呂 煜，季慶輝，張澤琦，滿 婧，姚麗巖，王思懿

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

?

MSC/rhBMP-2結(jié)合藻酸鈣凝膠治療激素性股骨頭壞死的研究

呂 煜，季慶輝，張澤琦，滿 婧，姚麗巖，王思懿

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:探討自體MSC與rhBMP-2結(jié)合藻酸鈣凝膠治療激素性股骨頭壞死的療效及其促進成骨和新生血管的作用。方法：將新西蘭大白兔40只進行激素性股骨頭壞死模型制備后,隨機的方式分成A、B、C、D、E、F6組,A組：激素性股骨頭壞死組；B組：單純減壓組；C組：減壓后植入MSC；D組：減壓后植入MSC及rhBMP-2；E組：減壓后植入MSC及藻酸鈉懸液及氯化鈣溶液；F組：減壓后植入MSC/rhBMP-2和藻酸鈣凝膠在壞死股骨頭內(nèi)。術(shù)后第4周及第8周各組兔子行X線檢查,然后處死兔子取股骨頭行常規(guī)組織學(xué)染色進行評估。結(jié)果：在8周時，F(xiàn)組的標本股骨頭壞死鉆孔處有大量的成骨細胞和新生血管產(chǎn)生，經(jīng)分析統(tǒng)計，F(xiàn)組與其他組比較骨陷窩陽性數(shù)和血管數(shù)目差異(P<0.05)具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：MSC/rhBMP-2和藻酸鈉懸液及氯化鈣溶液治療激素性股骨頭缺血性壞死，通過誘導(dǎo)MSC轉(zhuǎn)化為成骨細胞,既修復(fù)骨還促進血管生成，有利于改善早期壞死股骨頭血運行，MSC/rhBMP-2結(jié)合藻酸鈣凝膠治療激素性股骨頭壞死有較好應(yīng)用前景。

激素性股骨頭壞死;骨髓間充質(zhì)干細胞;自體移植;藻酸鈣凝膠

糖皮質(zhì)激素是引起股骨頭缺血性壞死最常見原因, 患病率為3%～38%[1]。股骨頭缺血性壞死 (osteonecrosis of the femoral head,ONFH)最終可產(chǎn)生髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)間隙狹窄，股骨頭塌陷變扁，甚至與髖臼黏連，致使人的髖關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，它是由各種原因?qū)е鹿晒穷^缺血、骨壞死，進而股骨頭塌陷，如果早期有一種有效的干預(yù)治療，可防止產(chǎn)生髖關(guān)節(jié)致殘，目前臨床上沒有完美治療方法。本研究對兔激素性股骨頭壞死模型進行在髓芯減壓的基礎(chǔ)上將骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)和(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)結(jié)合藻酸鈣凝膠移植到減壓區(qū), 觀察其療效。

1 材料和方法

1.1 材料

新西蘭大白兔40只(年齡4～5個月,體重2.5～3.0kg),6組動物分籠，同條件喂養(yǎng)。首先將10μg/kg脂多糖經(jīng)兔的耳緣靜脈注射,1d后肌肉注射20mg/kg的甲強龍,共3d(每天1次)，6周之后選出成功的模型[2]。最終除去死亡和失敗的模型，還剩36只。將其分成A、B、C、D、E、F組,A組為試驗對照組。

1.2 兔骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)

按pittenger方法[3]，取自新西蘭兔自體，麻醉采用速眠新肌注射消毒髂骨，12號骨髓穿刺針穿刺抽取骨髓5mL吹打成細胞懸液，采用密度梯度離心法，置于percoll(密度1.073g/mL)液面上，2000r/min離心，20min后取中層云霧狀細胞層，10cm細胞培養(yǎng)皿2×105云霧狀細胞接種，加100mL/L胎牛血清培養(yǎng)液，置于37℃，50mL/L CO2培養(yǎng)箱中，5d后首次換液，沖去紅細胞,可見多個成纖維細胞克隆貼壁長，用0.25%胰蛋白酶消化，培養(yǎng)孔1/2長滿細胞,原孔傳代2～3d，培養(yǎng)孔長滿培細胞，細胞培養(yǎng)瓶按1×106/cm2密度移入。第3代細胞長滿消化細胞，配成2×106/cm2懸液細胞，每個股骨頭內(nèi)含細胞懸液50μL，共10萬個細胞,細胞培養(yǎng)箱中孵育4h備用。

1.3 藻酸鈣凝膠的制備

將102mmol/LCaCl2溶液與1.2%藻酸鈉溶液通過禍旋混合器橫拌(1800r/min),快速充分混合20s。將混合溶液放置于圓柱形定制模具(直徑10mm，高10mm)中塑型5 min。然后將該支架轉(zhuǎn)移到含有15mLCaCl2溶液的培養(yǎng)皿中靜置10min最后用稱酸緩沖液清洗兩次即制備成水凝膠三維支架。pH值調(diào)為7.4,121℃高壓蒸汽滅菌20min,4℃?zhèn)溆肹4]。

1.4 實驗方法

兔取俯臥位，40mg/kg硫賁妥鈉做腹腔麻醉注射，備皮穿刺部位→消毒→鋪巾。2號骨穿針X線下刺入股骨頭中心。A組：激素性股骨頭壞死組；B組：單純減壓組；C組：減壓后植入MSC；D組：減壓后植入MSC及rhBMP-2；E組：減壓后植入MSC及藻酸鈉懸液及氯化鈣溶液；F組：減壓后植入MSC/rhBMP-2和藻酸鈣凝膠在壞死股骨頭內(nèi)。術(shù)后第4周及第8周各組兔子行X線檢查,然后處死兔子取股骨頭行常規(guī)組織學(xué)染色。手術(shù)后各組分籠飼養(yǎng)，5d連通續(xù)肌肉注射青霉素40萬U/d。手術(shù)后4、8周采用X線檢測結(jié)果，所有動物均采用耳緣靜脈注射空氣栓塞致死法處死取股骨頭，股骨頭劈為1/2組織學(xué)觀察。

1.5 觀察指標

1.5.1 MSC生長觀察，A、B、C、D、E、F各組切片HE染色, 觀察股骨頭壞死區(qū)情況。在染色的切片中，觀察血管數(shù)目時,依次任選5個20×40倍倍視野在軟骨下區(qū),計血管數(shù)目,求出平均值。高20×40倍鏡觀察骨陷窩，隨機選5個視野, 計數(shù)1個視野內(nèi)50個骨陷窩得出空缺骨陷窩百分率。

1.5.2 股骨頭X線檢查 待兔麻醉后仰臥于X線檢查桌股骨頭置于中心，檢測股骨頭情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0分析處理，A、B、C、D、E、F各組采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MSC生長觀察

MSC培養(yǎng)生長第5d時，觀察MSC克隆集落貼培養(yǎng)瓶壁生長。消化傳代2～4h后細胞貼壁生長，2～3d長滿培養(yǎng)瓶底。傳代2～7d以指數(shù)生長，倍增時間48h。見圖1。

2.2 組織學(xué)觀察

組織切片觀察股骨頭：A組：4周時觀察軟骨與細胞及骨髓出現(xiàn)壞死，空骨陷窩數(shù)量增加，骨小梁有不規(guī)則出現(xiàn)。8周時關(guān)節(jié)軟骨面磨損與修復(fù)并存，骨吸收和軟骨面塌陷。B組： 4周時股骨頭組織切片標本缺損處， 出現(xiàn)成骨細胞稀少現(xiàn)象。 8周時僅

鉆孔區(qū)少量形成骨髓組織并有少量毛細血管，鉆孔區(qū)邊緣形成少量新生骨小梁和類骨質(zhì)。其余4組在4周時缺損處內(nèi)有許多成骨細胞和新生血管形成，F(xiàn)組最多。F組8周標本缺損處有大量的成骨細胞，可見成熟骨小梁,并且排列有序,相互交織。

圖1 原代MSC(20×40)

2.3 A、B、C、D、E、F各組空骨陷窩數(shù)和血管密度比較分析

手術(shù)后4、8周, 空骨陷窩數(shù)和血管密度測定數(shù)據(jù)運用SPSS18.0分析處理，A、B、C、D、E、F各組采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。F組與其他組比較骨陷窩陽性數(shù)和血管數(shù)目差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組術(shù)后4、8周空骨陷窩計數(shù)見表1；各組術(shù)后4、8周血管計數(shù)見表2。

表1 各組術(shù)后4、8周后空骨陷窩計數(shù)±s)

注：同一組在4周與8周之間相比*P<0.05；分別在4、8周時各組與F組相比△P<0.05。

表2 A、B、C、D、E、F各組術(shù)后4、8周后血管計數(shù)

注：同一組在4周與8周之間相比*P<0.05；分別在4、8周時各組與F組相比△P<0.05。

2.4 壞死股骨頭X線檢查

A組標本：4周時股骨頭密度改變，骨小梁結(jié)構(gòu)錯亂；8周時股骨頭出現(xiàn)軟骨下囊性變。見圖2。B組標本：手術(shù)后4周減壓區(qū)僅鉆孔邊緣增高密度，減壓區(qū)內(nèi)無明顯密度改變。C、D、E、F各組：手術(shù)后4周減壓區(qū)密度低；手術(shù)后8周C組有稀疏骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，D、E、F組有較密骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，F(xiàn)組骨密度出現(xiàn)最高現(xiàn)象。見圖3。

圖2 8周后模型組

圖3 8周后F組修復(fù)兔

3 討論

股骨頭壞死的發(fā)病機制尚不清楚，由復(fù)雜多因素導(dǎo)致股骨頭缺血及骨細胞壞死病理過程。青壯年時期多見于股骨頭早期壞死, 如果干預(yù)治療，很短時間出現(xiàn)關(guān)節(jié)面塌陷而需要置換股骨頭[5]。但是髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后可用的壽命有限, 因此延長進行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的時間非常關(guān)鍵，近年來，應(yīng)用干細胞移植治療早期股骨頭壞死已經(jīng)是目前一種可選的方法，成為了研究中的熱點[6]。股骨頭內(nèi)高壓在股骨頭壞死發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，很長期髓芯減壓術(shù)是股骨頭缺血性壞死治療常用方法。髓芯減壓治療主要采用改變壞死股骨頭內(nèi)高壓微環(huán)境，從而增加了壞死區(qū)內(nèi)的血液供應(yīng)，是當前治療早期股骨頭壞死的方法之一[7]。在髓芯減壓的基礎(chǔ)之上將MSCs移植到減壓處，為治療壞死股骨頭提供了種子細胞，從而為骨爬行替代和新生血管提供了基礎(chǔ)條件[8]。BMP是TGF-β超家族成員之一,是應(yīng)用最廣泛的信號蛋白在骨組織工程中，在這個家族中BMP-2是最重要的成骨形成調(diào)控因子[9]。一些研究認為，在修復(fù)ONFH的手術(shù)中，加入BMP-2能有效提高打壓植骨術(shù)療效[10]。胡彤宇等[11]通過研究發(fā)現(xiàn)BMP-2能刺激新生血管在新生骨周圍形成。藻酸鈣能泌鈣離子促進MSCs進一步分化為成骨的能力，并且具有三維立體多孔理想的結(jié)構(gòu)[12],提供了良好的微環(huán)境為細胞在其內(nèi)部生長、增殖和分泌基質(zhì)[13]。本實驗將自體MSC與rhBMP-2結(jié)合藻酸鈣凝膠同時注入股骨頭。通過X線檢查 、組織學(xué)染色評價療效。在8周時，F(xiàn)組的標本股骨頭壞死鉆孔處有大量的成骨細胞和新生血管產(chǎn)生，經(jīng)分析統(tǒng)計，F(xiàn)組與其他組比較骨陷窩陽性數(shù)和血管數(shù)目差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？傊?, MSC/rhBMP-2結(jié)合藻酸鈣凝膠治療激素性股骨頭壞死具有如下優(yōu)點：①方法簡單，②手術(shù)安全，③創(chuàng)傷相對較小，④療效可靠。臨床治療股骨頭壞死方面運用髓芯減壓方法,rhBMP-2不但加速骨生長,而且促進新生血管形成，并且藻酸鈣凝膠釋放鈣離子促進MSCs的成骨，從而可以提高MSC治療早期股骨頭壞死療效 。

[1]Assouline-Dayan Y,Chang C,Greenspan A,et al.Pathogenesis andnatural history of osteonecrosis[J].Semi Arth Rheum,2002,32(2):94-124

[2]董維，郭楊，馬勇，等.甲強龍聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)兔股骨頭壞死模型的建立[J]. 中國骨質(zhì)疏松雜志,2016,22(4):402-405

[3]Pittenger MF,Mackay AE,Beck SC,et al.Multilineage potential of adualt human mesenchymal stem cells[J].Science，1999，284:143-147

[4]盧璐，章東.藻酸巧凝膠三維細胞支架的制備與評價[D].南京：南京大學(xué)，2015：1-33

[5]Mont MA,Marulanda GA,Seyler TM,et al.Core decom-pression and nonvascularized bone grafting for the treatment of early stage osteonecrosis of the femoral head[J].Instr Course Lect,2007,56:213-220

[6]康凱，邵林，韓劍鋒，等.應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細胞治療股骨頭壞死的研究進展[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2016,47(2):187-190

[7]Helbig L，Simank HG，Kroeber M，et al． Core decompression com-bined with implantation of a demineralised bone matrix for non-traumatic osteonecrosis of the femoral head[J].Arch Orthop Trauma Surg，2012，132:1095-1103

[8]Zhao D，Cui D，Wang B，et al．Treatment of early stage osteone-crosis of the femoral head with autologous implantation of bone marrow-derived and cultured mesenchymal stem cells[J]．Bone，2012，50: 325-330

[9]Lim TY,Wang W,Shi Z,et al.Human bone marrow-de-rived mesenchymal stem cells and osteoblast differenti-ation on titanium with surface-grafted chitosan and im-mobilized bone morphogenetic protein-2[J].J Mater Sci Mater Med,2009,20(1):1-10

[10]李子榮,孫偉,史振才，等.加入和未加骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的打壓植骨術(shù)治療股骨頭壞死[J].中國骨與關(guān)節(jié)外科 ,2012,5(5):377-381

[11]胡彤宇,扈文海,李建衡，等.髓芯減壓BMP植入治療股骨頭壞死的血流量及病理改變[J].中國矯形外科雜志,2002,9(4):370-373

[12]盧璐,吉鴻飛,郭各樸，等.超聲增強藻酸鈣凝膠支架材料孔隙率的研究[J].物理學(xué)報,2015,64(2)：1-8

[13]Li Z,Zhang M .Chitosanalginate as scaffolding material for cartilage tissue engineering[J].Biomed Mater Res,2005,75(2):485-493

1.黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃重點項目，編號：201510222013；2.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點項目，編號：12Z1201508；3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院院級培育課題：編號：2014年。

呂煜(1992～)女，黑龍江雞西人，在讀本科生。

季慶輝(1983～)男，黑龍江黑河人，碩士，主治醫(yī)師，講師。E-mail:jqh19833@163.com。

R687.4

B

1008-0104(2016)06-0031-03

2016-07-11)