張洪亮,賈阿娜,劉春輝,王 慧,范 蕾,趙智敏,賀兆發(fā)

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154003；2. 佳木斯市急救中心，黑龍江 佳木斯 154002)

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孤兒肽在肺動脈高壓大鼠中的表達(dá)

張洪亮1,賈阿娜2,劉春輝1,王 慧1,范 蕾1,趙智敏1,賀兆發(fā)1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154003；2. 佳木斯市急救中心，黑龍江 佳木斯 154002)

目的:探討孤兒肽( orphanin FQ, OFQ)在肺動脈高壓大鼠肺動脈組織及血漿中表達(dá)水平變化意義。方法:20只雄性SD大鼠隨機(jī)分為肺動脈高壓誘導(dǎo)組(n=15)和對照組(n=5)，肺動脈高壓誘導(dǎo)組采用腹腔注射野百合堿( monocrotaline，MCT) 60mg/kg體重，對照組腹腔注射等體積的0.9%生理鹽水。在注射野百合堿7、14、21、28d后，檢測大鼠肺組織中mRNA的表達(dá)情況，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)定位OFQ在肺動脈組織中表達(dá)。結(jié)果:OFQ在肺動脈高壓大鼠肺組織中表達(dá)隨時(shí)間增加呈現(xiàn)正相關(guān)，同時(shí)在血漿中OFQ表達(dá)變化隨著肺動脈高壓進(jìn)展而增加，OFQ表達(dá)變化與肺動脈血液動力學(xué)指標(biāo)及右心室肥厚指數(shù)呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，免疫組化顯示OFQ定位于肺小動脈的內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞。結(jié)論:OFQ在野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠血漿及肺動脈中表達(dá)升高，它可以作為判定肺動脈高壓嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，可能參與肺動脈高壓發(fā)病血管重塑機(jī)制。

肺動脈高壓；孤兒肽；大鼠；野百合堿

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是一類以肺動脈壓力和肺小血管阻力進(jìn)行性增加為特征的臨床病理綜合征，往往伴有右心衰竭，肺血栓形成及血液動力學(xué)變化，嚴(yán)重者會危及生命[1]。肺小動脈血管重構(gòu)是其主要病理改變，重構(gòu)的主要表現(xiàn)為：肺動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞過度增殖，一些無肌小動脈出現(xiàn)肌層樣改變，同時(shí)伴有肺組織纖維化、炎癥浸潤及血栓形成。

孤兒肽( orphanin FQ, OFQ )或稱痛敏肽( nociceptin ) ,是一類與阿片肽具有高度同源的肽類物質(zhì)，OFQ最早從大鼠和豬的腦組織中分離得到的一種新的17肽，實(shí)驗(yàn)證明孤兒肽為阿片樣受體的內(nèi)源性配體[2]。OFQ前體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中具有廣泛的表達(dá)，近年來發(fā)現(xiàn)在其他器官如腎臟、脾以及生殖系統(tǒng)中存在表達(dá)。McDonald 研究發(fā)現(xiàn)OFQ主要表達(dá)于冠狀動脈粥樣硬化的動脈組織，同時(shí)在發(fā)生心力衰竭時(shí)候也有表達(dá)，但心肌組織中沒有明顯的表達(dá)[3]。

目前關(guān)于OFQ在肺動脈高壓中的表達(dá)情況尚無報(bào)道，本研究對MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺動脈及血漿中OFQ變化進(jìn)行探究，進(jìn)一步觀察PAH肺組織及肺動脈中是否具有OFQ分布，并為OFQ參與血管重構(gòu)及血管效應(yīng)機(jī)制研究提供初步參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

MCT(Sigma公司)，TRIZOL(Takara公司)，大鼠OFQ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 檢測試劑盒(Linco公司)，PCR引物(Invitrogen 公司), AMV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Promega 公司), Power SYBR green PCR master mix (ABI 公司)， Anti-Nociceptin抗體(ab100880)。

1.2 肺動脈高壓動物模型制備及樣本采集

健康SD大鼠20只，雄性，體重260～300g(8周齡)，被隨機(jī)分成正常對照組(control 組n=5)和秋水仙堿誘導(dǎo)組(MCT組n=15)，MCT組采用2% MCT以60mg/kg劑量SD大鼠一次性腹腔注射， control組采用等量生理鹽水SD大鼠腹腔注射，正常飼養(yǎng)4w。在注射MCT后分別于7、14、21、28d進(jìn)行血液動力學(xué)監(jiān)測(右心導(dǎo)管法)，檢測指標(biāo)包括：右室收縮壓、肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓，測量評估右心室肥厚指數(shù)，評估肺動脈高壓嚴(yán)重程度。收取實(shí)驗(yàn)大鼠血漿標(biāo)本，分裝后凍存于-80℃冰箱，留取肺組織迅速凍存于液氮之中備用。

1.3 免疫組化染色實(shí)驗(yàn)

肺組織應(yīng)用福爾馬林固定后石蠟包埋制成蠟塊，切片，貼片后以PBS清洗3遍，每次5min，進(jìn)行高壓修復(fù)；Triton X-100孵育20min，滴加封閉液，37℃ 封閉30min，加入Anti-Nociceptin抗體(ab100880)(1:200)，4℃過夜，PBS洗3次，每次5min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶500) ，室溫孵育2h;PBS 洗3 次，每次5min，加入ABC復(fù)合物，室溫孵育2h;PBS洗3次，每次5min，用蒸餾水迅速沖3 次; DAB 顯色，PBS終止顯色。梯度酒精進(jìn)行脫水，封片后拍照。

1.4 OFQ在肺組織mRNA表達(dá)檢測

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( real time PCR，RT-PCR)取凍存肺組織約100mg，應(yīng)用Trizol法提取總RNA，應(yīng)用NanoDrop 2000進(jìn)行RNA定量，各組RNA樣品的A260 /A280nm吸光度比值均在1.8～2.0之間。將2μg 的總RNA反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA。根據(jù)據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)的OFQ前體cDNA核甘酸序列引物序列[4]，由Invitrogen公司合成引物如下: 正義鏈引物(sense primer)為: 5′-T GGATCCCACGGCTGCACCATGAA-3′，反義鏈引物( anti sense primer)為: 5′-GAATTCGGCTCCTTCTGGCT ACACATTAC-3'；內(nèi)參為GAPDH: 正義鏈引物5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，反義鏈引物5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。RT-PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)條件是：95℃ 30s預(yù)變性，95℃ 10s變性和60℃ 30s退火及延伸，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)行三個(gè)重復(fù)，使用ABI Real-time PCR儀(Applied Biosystems)運(yùn)行程序，結(jié)果使用2(-ΔΔCT)計(jì)算方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 ELISA法檢測大鼠血漿中OFQ濃度

MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓血漿OFQ濃度使用Linco公司的試劑盒，按照說明書中操作步驟進(jìn)行，試驗(yàn)重復(fù)3次。及具體方法：用包被緩沖液將抗體稀釋后加入96孔板4℃過夜，次日棄掉孔內(nèi)溶液，應(yīng)用TBST沖洗后加入樣品100μL，37℃孵育1h，各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體100μL,37℃孵育1h，洗滌。底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液100μL，37℃30min，于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸50μL終止反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，連續(xù)變量應(yīng)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，one-way ANOVA 來進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OFQ的mRNA在MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠肺組織RT-PCR的表達(dá)

MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠肺組織中OFQ mRNA表達(dá)變化，應(yīng)用RT-PCR檢測MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠肺組織中OFQ mRNA表達(dá)情況，與control組比較結(jié)果顯示：MCT誘導(dǎo)PAH組在14d出現(xiàn)OFQ表達(dá)升高，時(shí)間的增加呈現(xiàn)逐步升高。分析結(jié)果顯示：在14天時(shí)候OFQ的表達(dá)量(fold change)為control組的2.9倍，28d則達(dá)到3.7倍。見圖1。

圖1 OFQ在MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠肺組織中的表達(dá)

2.2 HE染色光鏡觀察肺動脈形態(tài)學(xué)變化

MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠肺組織切片，經(jīng)過蘇木素-伊紅染色后與對照組比較，鏡下可見：MCT大鼠肌性肺小動脈中膜的平滑肌明顯增厚，管腔嚴(yán)重變窄。通過測量管腔橫截面積與血管腔總面積發(fā)現(xiàn)，MCT組管腔明顯狹窄。MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠肺小動脈存在血管內(nèi)膜增生和血管重構(gòu)現(xiàn)象。見圖2A,圖2B。

圖2 肺組織HE染色光鏡觀察結(jié)果(×400)

2.3 OFQ在MCT誘導(dǎo)PAH大鼠肺動脈中IHC染色結(jié)果

OFQ在正常大鼠肺動脈中有少量表達(dá)，見圖3A，在經(jīng)過MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓后，肺小動脈增生明顯，此時(shí)OFQ表達(dá)明顯增加，主要定位于肺動脈的平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，見圖3B。

圖3 OFQ在MCT誘導(dǎo)PAH大鼠肺動脈中IHC染色結(jié)果(×400)

2.4 OFQ在MCT誘導(dǎo)PAH大鼠血漿中檢測濃度的變化

應(yīng)用ELISA檢測PHA大鼠7、14、21、28d血漿中OFQ濃度變化情況，顯示隨著時(shí)間的延長，OFQ的血漿濃度呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，此項(xiàng)變化趨勢與肺組織中mRNA表達(dá)相一致。見表1。

表1 OFQ在MCT誘導(dǎo)PAH大鼠血漿中檢測濃度變化

與Control組同一時(shí)間比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

孤兒肽( orphanin FQ, OFQ)又稱為孤啡肽或者痛敏肽(nociceptin)，是一類由17個(gè)氨基酸組成的肽類物質(zhì)，最初在神經(jīng)系統(tǒng)中分離出來，實(shí)驗(yàn)證明OFQ能與阿片樣受體( opioid-like receptor 1 OLR1 )特異結(jié)合，體內(nèi)為 OLR1的內(nèi)源性配體。早期的研究發(fā)現(xiàn)OFQ與神經(jīng)系統(tǒng)的痛覺及記憶、情緒活動密切相關(guān)，在給予體外注射OFQ時(shí)發(fā)現(xiàn)OFQ能明顯增加實(shí)驗(yàn)動物的尿量，同時(shí)減少尿中鈉離子的排泄[5]。OFQ 除了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有著廣泛的分布，實(shí)驗(yàn)證實(shí)腦內(nèi)主要以下丘腦及邊緣系統(tǒng)的含量為最。OFQ的腦外組織分布主要在卵巢、脾臟、血液白細(xì)胞中，在心血管系統(tǒng)也有一定的分布，比如培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞、心房內(nèi)皮細(xì)胞等[6,7]。近年來有報(bào)導(dǎo)，在冠狀動脈粥樣硬化疾病和心力衰竭等心血管疾病中OFQ有明顯表達(dá)，參與心血管系統(tǒng)的病理生理調(diào)控。目前關(guān)于OFQ與肺動脈高壓的相關(guān)性尚無研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)基于此應(yīng)用MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓模型，并對OFQ在肺動脈高壓大鼠肺組織分布及肺動脈血管中表達(dá)情況進(jìn)行初步研究。

肺動脈高壓是臨床上肺動脈壓力持續(xù)進(jìn)行性增加的一組癥候群，盡管不同類型的PAH發(fā)病機(jī)制各異，但是最終病理上表現(xiàn)為肺小動脈的重構(gòu)，血管平滑肌細(xì)胞增生，管腔狹窄。MCT誘導(dǎo)PAH大鼠模型在發(fā)病機(jī)制研究中比較常用，容易操作，模型構(gòu)建成功率高。MCT在大鼠體內(nèi)經(jīng)過單氧化酶轉(zhuǎn)化后，產(chǎn)生野百合堿吡咯，對肺動脈血管損傷，引起炎癥反應(yīng)、細(xì)胞的凋亡壞死，血管增生與重構(gòu)，肺小動脈增生狹窄，肺動脈壓力增高[8]。本實(shí)驗(yàn)MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠肺組織HE染色，顯示肺高壓組與正常組比較，肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，變性壞死脫落，血管中膜平滑肌增生，管壁增生增厚，血管腔內(nèi)徑變小。說明MCT誘導(dǎo)大鼠PAH模型構(gòu)建成功，為后續(xù)的研究打下了基礎(chǔ)。

研究證實(shí)OFQ在心血管系統(tǒng)血壓調(diào)節(jié)活動中發(fā)揮著重要的作用，動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在急性心肌缺血后小腸表達(dá)OFQ明顯增加，并且與心肌的損害程度呈現(xiàn)正相關(guān)，實(shí)驗(yàn)表明在靜脈注射OFQ時(shí)可以明顯增加實(shí)驗(yàn)大鼠的尿量，并且能夠降低尿鈉的排除，OFQ的全身性降壓作用是通過NO的舒張血管作用實(shí)現(xiàn)的[9]。實(shí)驗(yàn)說明OFQ在循環(huán)系統(tǒng)中表達(dá)并且發(fā)揮著調(diào)控血壓的機(jī)制，但是在肺動脈高壓的調(diào)控機(jī)制中是否也存在OFQ的表達(dá)，尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)肺動脈高壓大鼠血漿OFQ的檢測表明，OFQ在肺動脈大鼠血漿中OFQ含量與肺動脈高壓進(jìn)展程度呈現(xiàn)密切相關(guān)，隨著MCT注射時(shí)間增加，其OFQ表達(dá)量也明顯增加。在隨后的PAH大鼠肺組織中OFQmRNA檢測也證實(shí)了上述結(jié)果。

本研究免疫組化結(jié)果顯示，OFQ在MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠的肺小動脈血管壁中表達(dá)增加，定位于發(fā)生重構(gòu)的肺小動脈平滑肌細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)呈現(xiàn)OFQ陽性反應(yīng)?；贠FQ在對高血壓調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，我們推測OFQ參與肺動脈高壓發(fā)病可能是通過促進(jìn)肺小動脈的血管壁平滑肌細(xì)胞增殖來參與血管壁的重構(gòu)，并且OFQ的表達(dá)增加又可能會起到延緩肺高壓的作用，具體的確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)研究證明了在MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠血漿中及肺組織中均有OFQ的明顯表達(dá)，隨著時(shí)間的增長極肺動脈高壓程度OFQ具有明顯變化趨勢，它可能參與了MCT誘導(dǎo)PAH大鼠的肺血管重構(gòu)過程和肺動脈壓力調(diào)節(jié)過程。

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The investigation of orphanin FQ in pulmonary arterial hypertension rats

ZHANGHong-liang1,JIAA-na2,LIUChun-hui1,WANGHui1,FANLei1,ZHAOZhi-min1，HEZhao-fa1

(1. Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China;2. Emergency Medical Centre in Jiamusi, Jiamusi 154002,China)

Objective: To investigate the expression pattern of orphanin FQ in pulmonary artery and serum of rats with pulmonary arterial hypertension (PAH). Methods: Twenty rats were randomly divided into PAH group(n=15), which were intraperitoneally injected 60 mg/kg MCT and equal volume normal saline for control group (n=5). Reverse transcription-polymerase chain reaction ( RT-PCR) was used to investigate the expression level of OFQ mRNA and protein. The immunohisto chemical method was performed to confirm the localization of OFQ in pulmonary artery of PAH. Results: The expression of OFQ mRNA and protein increased significantly in MCT group, and the positive immunohisto reactive OFQ was located on endothelium as well as smooth cells. Conclusion: OFQ was increased significantly in MCT induced PAH rat. It may be as a biomarker to estimate the severity of PAH, and take part in the remodeling process of the pulmonary vascular.

pulmonary arterial hypertension; orphanin FQ; rat; monocrotaline

1.黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號：H201364；2.黑龍江省衛(wèi)生廳項(xiàng)目，編號：2011-355。

張洪亮(1973～)男，黑龍江呼蘭人，博士，副主任醫(yī)師。

賀兆發(fā)(1962～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:21652994@qq.com。

R543.2

A

1008-0104(2016)06-0019-03

2016-07-13)