叢霞，李華濤，陳健偉，張東君，曹榮峰，田文儒*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.肥城市畜牧獸醫(yī)局，山東肥城 271600）

燈盞乙素抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)豬腎小管上皮細胞凋亡研究

叢霞1，李華濤1，陳健偉1，張東君2，曹榮峰1，田文儒1*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.肥城市畜牧獸醫(yī)局，山東肥城 271600）

燈盞乙素（Scu）為燈盞花中提取的單一黃酮類化合物，具有清熱解毒和保護細胞免受熱應(yīng)激損傷的作用。試驗將不同濃度Suc培養(yǎng)的豬腎小管上皮細胞（LLC-PK1）在42℃下熱應(yīng)激1 h，采用RNA干擾法沉默細胞HSP72基因表達，熒光定量PCR和Western blot檢測細胞熱休克蛋白（HSP）70、Bcl-2、Bax、細胞色素C（Cyt-c）和caspase-3裂解。結(jié)果表明，Scu顯著增加細胞Bcl-2蛋白和HSP70蛋白水平，增加Bcl-2/Bax比值，抑制Cyt-c的釋放及pro-caspase-3裂解和caspase-3表達；但沉默HSP70后，細胞Cyt-c釋放和caspase-3表達均顯著增加。由此可知，Scu抑制LLC-PK1凋亡，保護細胞免受熱應(yīng)激損傷。

燈盞乙素；LLC-PK1；凋亡；熱應(yīng)激；HSP70

腎臟疾病如急性腎小管阻塞、慢性痛風(fēng)性腎病、尿酸腎結(jié)石等，可引起腎臟組織損害，炎性細胞浸潤，導(dǎo)致腎功能損傷。Choe等研究認為，細胞凋亡可能是腎臟（尤其是腎小管上皮）細胞損傷發(fā)病機制之一[1]。細胞凋亡具有兩個主要調(diào)節(jié)途徑，即死亡受體誘導(dǎo)的外源性和線粒體小體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑。Bax和Bcl-2在線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中發(fā)揮重要作用，能調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性，使細胞色素C（Cyt-c）釋放到細胞質(zhì)中。Cyt-c促進凋亡蛋白酶激活因子活化并激活caspase-9，促進procaspase-3裂解成caspase-3，導(dǎo)致蛋白水解和細胞凋亡[2]。在內(nèi)源性途徑中，HSP70能穩(wěn)定部分變性蛋白，去除不可逆損傷蛋白，維持細胞正常功能并抑制熱應(yīng)激引起細胞凋亡。Bcl-2/Bax值是腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡關(guān)鍵因素[3]。HSP70可阻止應(yīng)激反應(yīng)中Bax易位，抑制線粒體釋放Cyt-c及caspase-3激活[4-5]。HSP70與線粒體釋放的另一個凋亡誘導(dǎo)因子結(jié)合形成復(fù)合物，可阻止細胞染色質(zhì)聚集和細胞凋亡[6]。

燈盞乙素（Scu）是燈盞花中提取的單一黃酮類化合物，在中醫(yī)臨床上廣泛用于治療心血管疾病[7]。Zhang等研究表明，Scu能抑制線粒體功能損傷和大腦缺血再灌注損傷所誘導(dǎo)的細胞凋亡[8]，通過上調(diào)Bcl-xL表達和降低caspase-3活性而抑制CoCl2誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡[9]，Scu保護熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞損傷研究報道鮮見，對Scu解熱作用及機制研究較少。

本文采用RNA干擾、實時定量PCR和western blot方法，研究Scu對受熱應(yīng)激LLC-PK1細胞Bcl-2、Bax、HSP70、cyt-c和pro-caspase-3表達影響，為闡明Scu保護熱應(yīng)激引起細胞損傷的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

豬腎小管上皮細胞（Pig kidney proximal tubular，LLC-PK1，美國ATCC細胞庫第三代細胞）購自上海復(fù)祥生物科技有限公司；燈盞花乙素（Scutellarin，Scu）購自江西南昌制藥工程中心；高糖DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國GIBCO公司；胎牛血清購自美國HyClone公司；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別購自原平皓生物有限公司和日本TaKaRa公司；LightCycler?480 SYBR GreenⅠMaster購自美國Roche公司；抗Bcl-2（sc-492）、Bax（sc-526），HSP70（sc-1060）、細胞色素C（sc-8385）、pro-caspase-3（ab90437）、caspase-3（ab13847）和GAPDH（sc-48166）抗體均購自美國Santa Cruze公司；兔抗羊、羊抗兔IgGHRP（二抗-辣根過氧化物酶）購自美國Jackson Immuno Research公司；Western及IP細胞裂解液、一抗二抗去除液和ECL熒光底物試劑盒均購自碧云天生物制品有限公司。

1.1.2 細胞培養(yǎng)及處理

LLC-PK1細胞在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)于37℃，含5%CO2培養(yǎng)箱中，DMEM培養(yǎng)液含5%胎牛血清并分別加入100 U·mL-1和100 μg·mL-1青、鏈霉素。將Scu溶解在DMSO中，使用時稀釋終濃度為0.1%DMSO完全培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)24 h后42℃熱應(yīng)激1 h處理，37℃下恢復(fù)6 h，收獲細胞并作相應(yīng)試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 Scu最佳濃度篩選

將LLC-PK1細胞（5×103·孔-1）接種于96孔培養(yǎng)板并培養(yǎng)24 h，再用含不同濃度Scu（10-3～10-7mol·L-1）完全培養(yǎng)基孵育24 h，CCK-8試劑盒檢測細胞活力，具體操作方法參照試劑盒說明書。測定A450nm波長吸光度，取3次重復(fù)試驗平均值。

1.2.2 siRNA干擾HSP70基因表達

將濃度為10 nm的HSP70干擾RNA（siRNAs，見表1）和QIAGEN轉(zhuǎn)染試劑混合后，按照說明書操作程序轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染細胞在37℃下培養(yǎng)12 h，42℃熱應(yīng)激1 h，然后在37℃下恢復(fù)6 h后收獲細胞，Western blot法檢測細胞HSP70表達水平，分析HSP70沉默效率，篩選最佳干擾RNA。

1.2.3 熒光定量PCR

按照RNA提取試劑盒說明，提取Scu和熱應(yīng)激處理細胞總RNA，按照試劑盒（TaKaRa）說明反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系（20 μL）為：總RNA 7 μL；Random hexamer引物（0.2 μg·μL-1）1 μL；DEPC處理水4 μL；5×Reaction Buffer 4 μL；RibolockTMRNase抑制劑1 μL；10 mmol·L-1dNTP Mix 2 μL；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL。

將合成的cDNA產(chǎn)物作系列濃度梯度稀釋，Roche LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀作定量反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系（10 μL）為：ddH2O 3.6 μL；SYBRGreen Real time PCR Master Mix 5 μL；上下游引物（上海生工生物技術(shù)有限公司合成，20 pmol·μL-1）各0.2 μL（見表2）；cDNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃10 min，95℃5 s，60℃30 s，72℃，30 s共45個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，各組細胞以β-actin作內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法定量分析[10]。

1.2.4 蛋白印跡分析

將細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液吸掉，加入2 mL PBS（0.01 moL·L-1，pH 7.2～7.3）清洗2次，去除PBS后將培養(yǎng)皿置于冰上，每培養(yǎng)皿細胞中加入0.5 mL終裂解液，吹打、混勻。裂解后將裂解液移至1.5 mL離心管中，4℃，14 000 r·min-1離心5 min。取離心后上清液用2×SDS樣品緩沖液1∶1稀釋，煮沸使蛋白變性。然后在5%濃縮膠、12%分離膠、電壓為110 V條件下SDSPAGE電泳2 h。將細胞樣品中蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（4℃，220 mA，2 h），在TBST緩沖液中漂洗3次，每次5 min，將膜置于10%牛血清白蛋白（BSA）中室溫封閉2 h，根據(jù)PVDF膜孔徑加一抗（1∶1000稀釋），4℃下孵育過夜，用TBST漂洗膜3次，每次5min；加入與一抗稀釋后相同量的二抗IgG-HRP，室溫反應(yīng)1 h，經(jīng)TBST漂洗3次，每次5 min，待ECL發(fā)光試劑顯色后拍照鑒定，用BandScan 5.0軟件灰度分析。

表1 試驗中使用的siRNA核苷酸片段Table 1The primer sequences of siRNA used in the experiment

表2 熒光定量PCR引物Table 2The primer sequences used in real time PCR

1.2.5 統(tǒng)計分析

用SPSS 12.0軟件作方差分析，試驗數(shù)據(jù)用-X± SD表示，t檢驗做均數(shù)間比較，*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Scu對細胞存活率影響

CCK-8法檢測Scu檢測處理后細胞活力，以確定Scu對LLC-PK1細胞毒副作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當Scu濃度為10-6～10-7mol·L-1時，對細胞存活率無顯著（P＞0.05）影響（見圖1），當Scu濃度增加至10-3～10-5mol·L-1時，細胞活力顯著（P＜0.05）下降。

2.2 熱應(yīng)激對細胞凋亡相關(guān)因子表達影響

Western blot檢測結(jié)果表明，與對照組比，熱應(yīng)激使細胞Bax和Bcl-2蛋白表達顯著（P＜0.05）升高（見圖2），使Bcl-2/Bax蛋白比值顯著（P＜0.05）下降；此外，細胞受熱應(yīng)激后，cyt-c釋放量和pro-caspase-3裂解量均顯著（P＜0.05）高于對照組。

圖1 不同濃度Scu對LLC-PK1細胞活力影響Fig.1Effects of different concentration of Scu on LLC-PK1 cells viability

圖2 熱應(yīng)激對細胞Bcl-2、Bax、cyt-c、pro-caspase-3和caspase-3蛋白表達影響Fig.2Effects of heat stress on Bcl-2,Bax,cyt-c,pro-caspase-3 and caspase-3 protein expression

2.3 Scu對受熱應(yīng)激細胞Bcl-2、Bax及HSP70 mRNA表達影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與熱應(yīng)激組比，Scu處理組（ScuM）細胞Bcl-2 mRNA表達顯著（P＜0.05）升高（見表3），而Bax mRNA表達則顯著（P＜0.05）降低（見表3），并且Bcl-2/Bax mRNA比值也顯著（P＜0.05）升高（見表3）；值得注意的是，Scu（ScuM，P＜0.01；ScuL，P＜0.05）處理，比熱應(yīng)激組顯著增加HSP70 mRNA表達，而當Scu濃度增加（ScuH）時，表達差異不顯著（P＞0.05）（見表3）。

表3 Scu對熱應(yīng)激細胞Bcl-2、Bax及HSP70 mRNA表達水平影響Table 3Effects of Scu on Bcl-2,Bax and HSP70 mRNA expression

2.4 對熱應(yīng)激細胞Bcl-2、Bax及HSP70蛋白表達影響

Western blot檢測結(jié)果（見圖3）發(fā)現(xiàn)，與熱應(yīng)激組比較，Scu處理組（ScuM）細胞Bcl-2蛋白表達顯著（P＜0.05）升高，而Bax蛋白表達則顯著（P＜0.05）降低；Scu處理組（ScuM和ScuL）細胞Bcl-2/Bax蛋白比值以及HSP70蛋白和pro-caspase-3的表達量均顯著升高，而cyt-c含量和caspase-3表達量則顯著（P＜0.05）降低（見表4）。

2.5 siRNA對細胞熱應(yīng)激后HSP70表達抑制

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與熱應(yīng)激組比較，siRNA0、siRNA2、siRNA3和siRNA4組細胞HSP70蛋白表達均無顯著差異，僅siRNA1組細胞HSP70蛋白表達極顯著（P＜0.01）下降，抑制率為87.3%（見圖4）。

2.6 沉默HSP70對Scu抗細胞凋亡相關(guān)蛋白表達影響

Western blot檢測結(jié)果（見圖5）顯示，與單純熱應(yīng)激組相比，轉(zhuǎn)染siRNA組細胞cyt-c、procaspase-3和caspase-3蛋白表達均無顯著（P＞0.05）變化；而Scu（ScuM）可顯著（P＜0.05）抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的cyt-c釋放及pro-caspase-3裂解，顯著（P＜0.05）降低caspase-3表達。沉默HSP70后，阻止Scu降低線粒體釋放cyt-c作用，細胞質(zhì)中cyt-c量顯著（P＜0.05）升高；pro-caspase-3裂解顯著（P＜0.05）升高；caspase-3表達顯著（P＜0.05）升高。

圖3 Scu對熱應(yīng)激細胞Bcl-2、Bax及HSP70蛋白表達影響Fig.3Effects of Scu on Bcl-2,Bax,cyt-c,pro-caspase-3, caspase-3 and HSP70 protein expression

表4 Scu對熱應(yīng)激細胞Bcl-2、Bax及HSP70蛋白表達的影響Table 4Effects of Scu on Bcl-2,Bax,cyt-c,pro-caspase-3,caspase-3 and HSP70 protein expression

圖4 不同siRNA片段對細胞熱應(yīng)激后HSP70蛋白表達影響Fig.4Effect of different siRNA on relative amount of HSP70 protein expression

圖5 沉默HSP70對Scu抗細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Fig.5Silence HSP70 affect expression of apoptotic relative proteins

3 討論與結(jié)論

Bax和Bcl-2是重要細胞凋亡調(diào)節(jié)因子，其中Bcl-2是抗凋亡基因，Bax可抑制Bcl-2蛋白作用，其過度表達可促使細胞凋亡，Iwayama等研究認為，Bax通過與Bcl-2形成異源二聚體頡頏Bcl-2保護效應(yīng)而促使細胞凋亡，Bcl-2和Bax蛋白比值決定細胞是否凋亡，Bcl-2/Bax值升高抑制細胞凋亡。因此，Bcl-2/Bax值是細胞凋亡閾值的關(guān)鍵因素[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激時Scu通過下調(diào)Bax并上調(diào)Bcl-2蛋白表達，提高Bcl-2/Bax值，表明Scu能緩解由熱應(yīng)激導(dǎo)致的細胞損傷，抑制LLC-PK1細胞凋亡。同時，熱應(yīng)激誘導(dǎo)LLC-PK1細胞釋放Cyt-c，進一步激活caspase-9，使pro-caspase-3裂解成活化caspase-3，啟動細胞凋亡。Caspase-3在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，是細胞凋亡主要效應(yīng)執(zhí)行者，一旦活化，凋亡不可逆轉(zhuǎn)。Pro-caspase-3裂解激活caspase-3依賴于從線粒體中釋放的cyt-c，激活的caspase-3可水解包括細胞調(diào)節(jié)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)、細胞存活等環(huán)節(jié)重要蛋白，使細胞表現(xiàn)為凋亡特有的形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)特征。劉萍等研究發(fā)現(xiàn)，Scu可增加H2O2誘導(dǎo)的PC12 Bcl-2 mRNA表達，減弱caspase-3酶活性，降低P12細胞凋亡率[12]。徐華等研究證實，燈盞花素對順鉑腎毒性的保護作用機制與Bcl-2/Bax值相關(guān)[13]。說明Scu可通過提高Bcl-2表達，降低pro-caspase-3裂解水平發(fā)揮對細胞的保護作用。Hanqing C等研究發(fā)現(xiàn)，Scu對SAP大鼠腎小管細胞損傷具有明顯保護作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度Scu可抑制LLC-PK1細胞Cyt-c的釋放和caspase-3表達，原因是Scu改變細胞線粒體外膜通透性，抑制細胞色素C釋放。本試驗結(jié)果證實，Scu預(yù)處理可減少熱應(yīng)激誘導(dǎo)的LLCPK1細胞凋亡。

HSP70是機體在應(yīng)激情況下迅速合成的蛋白質(zhì)，被視為熱應(yīng)激過程中保護細胞的主要分子之一。HSP70能保護細胞免受高溫損傷、提高細胞耐熱性，HSP70可抑制凋亡小體形成，抑制細胞凋亡，提高細胞存活率。此外，HSP70還能直接保護H2O2和順鉑誘導(dǎo)的LLC-PK1細胞損傷[15]。熱應(yīng)激能夠誘導(dǎo)LLC-PK1細胞高表達HSP70[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，Scu能增加LLC-PK1細胞HSP70表達。這可能是Scu使細胞耐熱，因為HSP70能修復(fù)應(yīng)激損傷并恢復(fù)錯誤折疊蛋白[17]。本研究推測，Scu對細胞保護作用可能是由于：①Scu上調(diào)HSP70表達，修復(fù)細胞內(nèi)變性Bcl-2蛋白，防止其被降解[18]；另一方面，HSP70過表達有效促進核仁素上調(diào)，穩(wěn)定Bcl-2 mRNA表達[19]，促進Bcl-2表達，發(fā)揮凋亡抑制功能。②Scu上調(diào)HSP70表達，阻止Bax轉(zhuǎn)移至線粒體[20]，使線粒體膜電位趨于穩(wěn)定[21]，阻止cyt-c釋放，抑制pro-caspase-3裂解，發(fā)揮細胞保護作用。

為證實Scu是否通過上調(diào)細胞HSP70表達起保護作用，本文用RNA干擾方法沉默HSP70表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純熱應(yīng)激誘導(dǎo)的HSP70表達不影響細胞線粒體釋放Cyt-c及pro-caspase-3裂解，但沉默HSP70的表達可阻斷Scu對細胞保護作用。說明Scu通過上調(diào)HSP70表達而對LLC-PK1細胞熱應(yīng)激損傷起保護作用。這可能是在氧化應(yīng)激條件下，HSP70通過上調(diào)Bcl-2/Bax值，抑制線粒體膜電位改變，阻止cyt-c釋放；此外，HSP70可與凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）競爭性結(jié)合，抑制cyt-c與Apaf-1結(jié)合，阻止下游caspase-9激活caspase-3，最終阻止細胞凋亡。Liang等研究表明，細胞內(nèi)鈣離子增加可激活鈣/鈣調(diào)蛋白（CaM）和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶II（CaMKII）信號通路[22]，進一步誘導(dǎo)HSP70表達[23-24]。增加細胞內(nèi)鈣離子水平可以誘導(dǎo)HSP70表達[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激時siRNA不能完全阻斷Scu降低Cyt-c釋放和procaspase-3裂解作用。然而，Scu可降低活性氧生成，抑制p38 MAPK活化[9]，防止Bax易位到線粒體及Cyt-c釋放[26]。因此推測，Scu對LLC-PK1細胞保護作用還可能通過p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有效抑制熱應(yīng)激對LLC-PK1細胞的氧化及對細胞線粒體損傷實現(xiàn)，此亦有待深入研究的方向之一。

[1]Choe J Y,Park K Y,Kim S K.Oxidative stress by monosodium urate crystals promotes renal cell apoptosis through mitochondrial caspase-dependent pathway in human embryonic kidney 293 cells:mechanism for urate-induced nephropathy[J].Apoptosis, 2015,20(1):38-49.

[2]Sanz A B,Santamaria B,Ruiz-Ortega M,et al.Mechanisms of renal apoptosis in health and disease[J].J Am Soc Nephrol,2008, 19(9):1634-1642.

[3]Chao D T,Korsmeyer S J.BCL-2 family:Regulators of cell death [J].Annu Rev Immunol,1998,16:395-419.

[4]Li C Y,Lee J S,Ko Y G,et al.Heat shock protein 70 inhibits apoptosis downstream of cytochrome c release and upstream of caspase-3 activation[J].J Biol Chem,2000,275(33):25665-25671.

[5]Gotoh T,Terada K,Oyadomari S,et al.hsp70-DnaJ chaperone pair prevents nitric oxide-and CHOP-induced apoptosis by inhibiting translocation of Bax to mitochondria[J].Cell Death Differ,2004,11(4):390-402.

[6]Ravagnan L,Gurbuxani S,Susin S A,et al.Heat-shock protein 70 antagonizes apoptosis-inducing factor[J].Nat Cell Biol,2001,3 (9):839-843.

[7]Pan Z,Zhao W,Zhang X,et al.Scutellarin alleviates interstitial fibrosis and cardiac dysfunction of infarct rats by inhibiting TGFbeta1 expression and activation of p38-MAPK and ERK1/2 [J].Br J Pharmacol,2011,162(3):688-700.

[8]Zhang H F,Hu X M,Wang L X,et al.Protective effects of scutellarin against cerebral ischemia in rats:Evidence for inhibition of the apoptosis-inducing factor pathway[J].Planta Med,2009,75(2):121-126.

[9]Wang L X,Zeng J P,Wei X B,et al.Effects of scutellarin on apoptosis induced by cobalt chloride in PC12 cells[J].Chin J Physiol,2007,50(6):301-307.

[10]Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C (T))Method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[11]Iwayama H,Ueda N.Role of mitochondrial Bax,caspases,and MAPKs for ceramide-induced apoptosis in renal proximal tubular cells[J].Mol Cell Biochem,2013,379(1-2):37-42.

[12]劉萍,洪浩.燈盞乙素抑制過氧化氫誘導(dǎo)PC12細胞凋亡及機制[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2008,13(3):283-287.

[13]徐華,常陸林,馬天江,等.燈盞花素對腎損害小鼠腎組織細胞凋亡及相關(guān)蛋白的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(6): 260-263.

[14]Hanqing C,Xiping Z,Jingmin O,et al.Research on scutellarin parenteral solution's protective effects in rats with severe acute pancreatitis and multiple organ injuries[J].Inflammation,2012, 35(3):1005-1014.

[15]Komatsuda A,Wakui H,Oyama Y,et al.Overexpression of the human 72 ku heat shock protein in renal tubular cells confers resistanceagainstoxidativeinjuryandcisplatintoxicity[J]. Nephrol Dial Transplant,1999,14(6):1385-1390.

[16]Li C Y,Lee J S,Ko Y G,et al.Heat shock protein 70 inhibits apoptosis downstream of cytochrome c release and upstream of caspase-3 activation[J].J Biol Chem,2000,275(33):25665-25671.

[17]Jiang B,Liang P,Deng G,et al.Increased stability of Bcl-2 in HSP70-mediated protection against apoptosis induced by oxida-tive stress[J].Cell Stress Chaperones,2011,16(2):143-152.

[18]Samali A,Cotter T G.Heat shock proteins increase resistance to apoptosis[J].Exp Cell Res,1996,223(1):163-170.

[19]王慷慨,蔣磊,劉可,等.熱休克蛋白70對氧化應(yīng)激所致核仁素裂解的影響[J].中國動脈硬化雜志,2004,12(4):373-377.

[20]Stankiewicz A R,Lachapelle G,Foo C P,et al.Hsp70 inhibits heat-induced apoptosis upstream of mitochondria by preventing Bax translocation[J].J Biol Chem,2005,280(46):38729-38739.

[21]Yi X,Yin X M,Dong Z.Inhibition of Bid-induced apoptosis by Bcl-2.tBid insertion,Bax translocation,and Bax/Bak oligomerization suppressed[J].J Biol Chem,2003,278(19):16992-16999.

[22]Liang R,Liu X,Wei L,et al.The modulation of the excitability of primary sensory neurons by Ca(2)(+)-CaM-CaMKII pathway[J]. Neurol Sci,2012,33(5):1083-1093.

[23]Peng W,Zhang Y,Zheng M,et al.Cardioprotection by CaMKII-deltaB is mediated by phosphorylation of heat shock factor 1 and subsequent expression of inducible heat shock protein 70[J].Circ Res,2010,106(1):102-110.

[24]Huang M,Wei J N,Peng W X,et al.The association of CaM and Hsp70 regulates S-phase arrest and apoptosis in a spatially and temporally dependent manner in human cells[J].Cell Stress Chaperones,2009,14(4):343-353.

[25]Wong V K,Li T,Law B Y,et al.Saikosaponin-d,a novel SERCA inhibitor,induces autophagic cell death in apoptosis-defective cells[J].Cell Death Dis,2013(4):720.

[26]Van Laethem A,Van Kelst S,Lippens S,et al.Activation of p38 MAPKisrequiredforBaxtranslocationtomitochondria, cytochrome c release and apoptosis induced by UVB irradiation in human keratinocytes[J].Faseb J,2004,18(15):1946-1948.

Study on scutellarin attenuates heat stress-induced apoptosis in LLC-PK1 cells/

CONG Xia1,LI Huatao1,CHEN Jianwei1,ZHANG Dongjun2,CAO Rongfeng1,TIAN Wenru1(1.School of Animal Science and Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University, Qingdao Shandong 266109,China;2.Veterinary and Animal Husbandry Department Feicheng, Feicheng Shandong 271600,China)

Scutellarin(Scu)is known to abate fever in the clinical practice of Traditional Chinese Medicine.The primary cultured pig kidney proximal tubular(LLC-PK1)cells incubated with(or without) various concentrations of Scu were heat-stressed at 42℃for 1 h to make heat shock injury cellular model.RNAi technique was used to silence heat shock protein(HSP)70 mRNA expression.The HSP70,Bcl-2,Bax,cytochrome c(cyt-c)and pro-caspase-3 cleavage of the cells were all detected by using real-time PCR and Western blot aimed to examine the effects of Scu on heat-stressed LLC-PK1 cells and to explore its possible mechanism.The results showed that Scu significantly increased the levels of Bcl-2 and HSP70 protein,the ratio of Bcl-2 to Bax,and inhibited the release of cyt-c,procaspase-3 cleavage as well as caspase-3 expression.Interestingly,caspase-3 expression and release of cyt-c were dramatically increased in the cells with HSP70 RNA interference.These results demonstrate that Scu protects LLC-PK1 cells against heat stress,possibly by up-regulating HSP70 expression.

scutellarin;LLC-PK1;apoptosis;heat stress;HSP70

S853.72

A

1005-9369（2016）11-0059-07

時間2016-11-30 15:18:38[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161130.1518.002.html

叢霞,李華濤,陳健偉,等.燈盞乙素抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)豬腎小管上皮細胞凋亡研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(11)：59-65

Cong Xia,Li Huatao,Chen Jianwei,et al.Study on scutellarin attenuates heat stress-induced apoptosis in LLC-PK1 cells [J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(11)：59-65.(in Chinese with English abstract)

2016-09-16

國家自然科學(xué)基金（31572590，31502138）；山東省自然科學(xué)基金（BS2015NY001）；山東省高等學(xué)?？萍加媱濏椖浚↗15LF03）

叢霞（1962-），女，高級實驗師，碩士，研究方向為動物生殖生理與生殖疾病。E-mail:780010688@qq.com

*通訊作者：田文儒，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為動物生殖生理與生殖疾病。E-mail:wrtian@126.com