李 芬，李榮榮，張瓊瓊，李暑燕，馬 云，盧建雄

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.山東省滕州市至善中學(xué)，山東 滕州 277599；3.信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000)

?

科學(xué)試驗(yàn)

中國(guó)地方黃牛PPARα exon7基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)研究

李 芬1，3，李榮榮2，張瓊瓊3，李暑燕3，馬 云3，盧建雄1*

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.山東省滕州市至善中學(xué)，山東 滕州 277599；3.信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000)

[目的]以期為我國(guó)地方黃牛生長(zhǎng)性狀分子育種提供理論依據(jù)。[方法]本研究以南陽牛、郟縣紅牛、魯西牛和秦川牛4個(gè)品種共計(jì)424頭中國(guó)地方黃牛為材料，以與牛脂肪代謝相關(guān)的基因PPARα為目標(biāo)基因，利用生物信息學(xué)、PCR-RFLP結(jié)合DNA池測(cè)序等技術(shù)，對(duì)其第7外顯子(PPARα_exon7)進(jìn)行遺傳特征分析，檢測(cè)SNPs，并分析該序列的多態(tài)性與試驗(yàn)黃牛生長(zhǎng)性狀指標(biāo)的相關(guān)性。[結(jié)果]發(fā)現(xiàn)在PPARα基因(AC_000162.1)exon7的164bp處發(fā)現(xiàn)了一處SNP(C/T)，檢測(cè)出CC和CT兩種基因型。群體遺傳分析顯示，該位點(diǎn)在試驗(yàn)牛群體中均屬于中度多態(tài)(0.25

中國(guó)地方黃牛；PPARα基因；SNPs；關(guān)聯(lián)分析

過氧化物酶體增殖物激活型受體(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs )是一組調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的配體激活核受體轉(zhuǎn)錄因子,作為激素激活核受體轉(zhuǎn)錄因子，PPARs在調(diào)節(jié)脂肪代謝、胰島素敏感、炎癥反應(yīng)、脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等方面發(fā)揮著重要作用[1-5]。 PPARs家族已發(fā)現(xiàn)含有α、β和γ三個(gè)成員，其中PPARα基因主要參與脂肪酸氧化代謝，通過調(diào)節(jié)控制肝臟內(nèi)脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)，從而對(duì)肝臟中脂肪細(xì)胞的分化、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及貯存、脂肪酸氧化等脂肪和能量代謝過程產(chǎn)生影響[6]。因此，近年來備受關(guān)注。在家養(yǎng)動(dòng)物PPARα基因的研究方面，Shimada[7]、Sebastian[8]、樊月園[9]、晉大鵬[10]、邵根寶[11]和孟和[12]等分別在牛、豬和雞上開展了一些研究，但總體上關(guān)于PPARα基因與牛肉用性狀相關(guān)研究的報(bào)道較少。

我國(guó)地方黃牛品種遺傳資源豐富，而且種間差異較大，適應(yīng)性和繁殖能力強(qiáng)、耐粗飼、有害性狀的遺傳頻率低、肉脂品質(zhì)好等優(yōu)勢(shì)特征明顯，因而成為我國(guó)乃至全世界牛繁殖育種的重要遺傳資源[13]。但是，地方黃牛在牛肉產(chǎn)量和肉品質(zhì)提高方面還存在許多問題，與國(guó)外專門化肉牛品種還存在不小的差距。本研究選擇4個(gè)地方黃牛品種南陽牛、郟縣紅牛、秦川牛和魯西牛，以其作為試驗(yàn)材料，以PPARα基因作為目標(biāo)基因進(jìn)行遺傳特征分析，檢測(cè)其SNPs，并分析該基因的多態(tài)性與我國(guó)地方代表性黃牛生長(zhǎng)性狀指標(biāo)的相關(guān)性，以期進(jìn)一步闡明和確證PPARα基因多態(tài)與中國(guó)地方黃牛肉用性狀之間是否存在相關(guān)性，研究結(jié)果可為我國(guó)地方黃牛肉用性狀遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所使用的血液樣品分別來源于4個(gè)中國(guó)地方黃牛品種(包括南陽牛、郟縣紅牛、魯西牛和秦川牛)，試驗(yàn)動(dòng)物總計(jì)424頭，全部為母牛，其中139份南陽牛血樣來自南陽市黃牛良種繁育場(chǎng)，141份郟縣紅牛血樣采自河南省平頂山市郟縣紅牛良種繁育場(chǎng)，114份魯西黃牛血樣采自山東鄄城魯西黃牛原種場(chǎng)，30份秦川牛樣品由陜西省秦川牛良種繁育中心。成年牛生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)主要由本課題組相關(guān)人員現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)包括體高(BH)、體斜長(zhǎng)(BL)、胸圍(CC)、腹圍(AC)、腰角寬(HBW)、坐骨端寬(HW)、十字部高(HHC)和體重(BW)等。其中73頭郟縣紅牛和100頭南陽牛不同生長(zhǎng)階段體尺數(shù)據(jù)分別由郟縣紅牛國(guó)家級(jí)保種場(chǎng)和南陽牛良種繁育中心提供，具體測(cè)定指標(biāo)包括初生重以及6、12、18和24月齡的體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、腰角寬、體重和日增重。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 本實(shí)驗(yàn)血液基因組DNA提取均采用購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司的TIANamp Blood全血基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，產(chǎn)品編號(hào)：DP318-02)提取。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中公布的牛PPARα基因DNA序列(AC_000162.1)，mRNA 序列(NM_001034036.1)以及dbSNP數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)提供的SNP參考信息，運(yùn)用引入錯(cuò)配堿基創(chuàng)造限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)法設(shè)計(jì)1對(duì)引物,用Forced-PCR-RFLP 技術(shù)對(duì)牛PPARα基因第7外顯子區(qū)域突變r(jià)s110745628(C/T)進(jìn)行基因型分型，然后再對(duì)不同基因型進(jìn)行DNA 測(cè)序驗(yàn)證。上游引物引物序列為：TCCGTGGAGACCGGCAC；下游引物序列為：TAGGCTACCAACATCCCATCTTTAT；目的片段164bp，設(shè)計(jì)好的引物序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 本實(shí)驗(yàn)中PCR反應(yīng)體系分別是dNTP mix 7.5μL，上下游引物(10 μM)各0.1μL，Taq DNA聚合酶0.1μL(250U)，DNA 模板0.5μL，ddH2O 6.7μL，總體積15.0μL。

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；57.7 ℃退火30 s；72 ℃延伸30～50 s；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。其中變性、退火、延伸為30～40個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增片段大小確定。 1.2.4 PCR-RFLP分析及測(cè)序驗(yàn)證 根據(jù)堿基突變位點(diǎn)選擇合適的限制性核酸內(nèi)切酶，根據(jù)優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，目的條帶清晰且無非特異性擴(kuò)增時(shí)即可進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)結(jié)束后將酶切產(chǎn)物用濃度為10%～14%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果選擇不同基因型個(gè)體分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物寄送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 對(duì)不同的牛群體的基因型，計(jì)算基因頻率和基因型頻率，并進(jìn)行 2檢驗(yàn)。用Popgene計(jì)算各牛品種在該位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)和基因雜合度(He)。

運(yùn)用SPSS17.0軟件的一般線性模型(GLM)分析個(gè)體基因型對(duì)牛生長(zhǎng)性狀的影響。相關(guān)分析模型如下：Yijk= u + Bi+ Gj+ eijk?；校篩ijk為個(gè)體表型記錄；u為群體平均值；Bi為品種效應(yīng)；Gj為標(biāo)記基因型效應(yīng)；eijk為隨機(jī)誤差。4個(gè)黃牛群體作為一個(gè)整體，由于牛群為成年母牛，故沒有考慮性別效應(yīng)和年齡效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛PPARα exon7的PCR擴(kuò)增及SNP分析

以試驗(yàn)牛DNA樣品為模板，對(duì)牛PPARα基因的第7外顯子利用酶切引物進(jìn)行擴(kuò)增, 產(chǎn)物經(jīng)2.5%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，獲得與目的片段大小一致的產(chǎn)物164 bp，產(chǎn)物帶型清晰且無雜帶, 穩(wěn)定性和特異性好(圖1-1a)。根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合測(cè)序結(jié)果，利用分析軟件將其與候選基因參照序列進(jìn)行對(duì)比，篩查得到第7外顯子164 bp處C/T突變位點(diǎn)。根據(jù)堿基突變位點(diǎn)選擇限制性核酸內(nèi)切酶HgiCI進(jìn)行酶切分型，酶切反應(yīng)結(jié)束后將酶切產(chǎn)物用濃度為10%～14%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果呈現(xiàn)出CC和CT兩種基因型(圖1-1b)。

圖1 牛PPARα exon7 多態(tài)位點(diǎn)的電泳圖譜

2.3 牛PPARα exon7遺傳平衡檢測(cè)和多態(tài)性指標(biāo)分析

本研究對(duì)4個(gè)品種牛個(gè)體PPARα exon7基因(C/T)位點(diǎn)多態(tài)信息含量(PIC)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表1。

表1 牛 PPARα exon7基因(C/T)位點(diǎn)遺傳參數(shù)分析

由表1可知，牛PPARα exon7基因(C/T)位點(diǎn)，四個(gè)地方黃牛群體均屬于低度多態(tài)(0

2.4 牛PPARα exon7多態(tài)性與生長(zhǎng)發(fā)育性狀的關(guān)聯(lián)分析

應(yīng)用所列出的一般線性模型對(duì)4個(gè)黃牛群體PPARα exon7的多態(tài)性與所對(duì)應(yīng)的體高、體重等指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見表2。

表2 牛 PPARα exon7基因(C/T)位點(diǎn)不同基因型對(duì)體尺性狀的影響

注: A,B代表數(shù)值的顯著水平為P < 0.01; a,b代表數(shù)值的顯著水平為P < 0.05。

表3 PPARα exon7基因(C/T)位點(diǎn)多態(tài)性與黃牛不同月齡生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表2可知，(C/T)位點(diǎn)僅有兩種不同基因型(CC和CT)，但在體斜長(zhǎng)指標(biāo)上，這兩種不同基因型的個(gè)體之間有顯著的差異(\%P\%<0.05)。

2.5 牛PPARα exon7多態(tài)性與黃牛不同月齡生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

應(yīng)用所列出的一般線性模型對(duì)4個(gè)黃牛群體PPARα exon7的多態(tài)性與黃牛不同月齡生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表3。

由表3可知，(C/T)位點(diǎn)兩種不同基因型(CC和CT)的個(gè)體之間沒有顯著的差異(\%P\%>0.05)。

3 討論

3.1 關(guān)于牛肉用性能改良與生長(zhǎng)發(fā)育性狀指標(biāo)的選擇

我國(guó)是世界第三大牛肉生產(chǎn)大國(guó)，但是我國(guó)用以生產(chǎn)牛肉的主體是過去曾經(jīng)長(zhǎng)期役用的地方黃牛，雖然建國(guó)后尤其是近年來先后選育出了5個(gè)肉牛品種(夏南牛、延黃牛、遼育白牛、蜀宣花牛、云嶺牛)及4個(gè)兼用品種(新疆褐牛、三河牛、草原紅牛、中國(guó)西門塔爾牛)，但總體上這些培育的肉牛(兼用)品種和國(guó)外專門化肉牛品種相比較，肉用性能仍然不盡如人意，在生長(zhǎng)速度、優(yōu)質(zhì)肉比率、高檔肉產(chǎn)率及肉品質(zhì)等指標(biāo)方面都亟待進(jìn)一步選育提高。當(dāng)前，隨著常規(guī)育種技術(shù)選擇增益的日漸減緩，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在牛的育種方面發(fā)揮越來越重要的作用。利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)結(jié)合常規(guī)育種技術(shù)制訂綜合選擇方案，對(duì)牛的經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行改良已成為牛育種的主流趨勢(shì)，而生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)是衡量肉用動(dòng)物的產(chǎn)肉性能的非常重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，因此制訂包含有影響生長(zhǎng)發(fā)育性狀指標(biāo)分子標(biāo)記的選擇方案，對(duì)于改良我國(guó)黃牛肉用性能具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。

3.2 牛PPARα exon7基因的遺傳變異分析

牛肉品質(zhì)與肉中脂肪沉積密切相關(guān)。而脂肪沉積來源于脂肪細(xì)胞的分化與增殖，過氧化物酶體增殖物激活型受體(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs )是一組調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的配體激活核受體轉(zhuǎn)錄因子。研究顯示，PPARs家族在脂質(zhì)代謝和能量代謝，脂肪細(xì)胞分化方面發(fā)揮重要作用。

本研究以PPARs家族成員PPARα基因?yàn)槟繕?biāo)基因，利用生物信息學(xué)技術(shù)、質(zhì)譜SNP分型技術(shù)、PCR-RFLP技術(shù)結(jié)合DNA池測(cè)序?qū)εPARα exon7基因進(jìn)行篩查。四個(gè)地方黃牛群體均屬于低度多態(tài)(0 < PIC < 0.25)，魯西牛、南陽牛和郟縣紅牛在該位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明采集的樣本來自于一個(gè)大的孟德爾群體中；而秦川牛處于不平衡狀態(tài)，此結(jié)果可能與秦川牛樣本群數(shù)量少有關(guān)。

3.3 牛PPARα exon7基因多態(tài)性與地方黃牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)性分析

本文對(duì)牛PPARα exon7的多態(tài)性與4個(gè)黃牛品種的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行了相關(guān)性分析, 發(fā)現(xiàn)除體斜長(zhǎng)指標(biāo)上CC和CT兩種基因型存在顯著差異(\%P\%<0. 05)外，其他指標(biāo)無差異或差異較小，且CC和CT基因型在黃牛不同月齡生長(zhǎng)指標(biāo)上不存在顯著差異。

PPARα基因定位于牛5號(hào)染色體(BTA5)，大約位于117.15到117.23 Mb處。筆者利用輻射雜種細(xì)胞系定位圖和QTL數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.iastate.edu/cgi-bin/QTLdb/BT/index)，尋找與牛PPARα基因相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)與牛平均日增重相關(guān)的QTLs (124 cM)[8]。PPARα的功能改變與肥胖和胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制有密切關(guān)系，大量研究結(jié)果表明人的PPARα基因第5 外顯子 L162V 多態(tài)性與低體重糖尿病或糖尿病脂質(zhì)代謝異常有關(guān)[10]。樊月圓等在牛 PPARα基因第 5 外顯子的 138 bp 處發(fā)生 T→C 突變，發(fā)現(xiàn)該突變對(duì)于秦川牛肉質(zhì)有顯著影響，這些結(jié)果提示該位點(diǎn)突變可能是影響牛肉背膘厚、眼肌面積和系水力的主效 QTN 或與之緊密連鎖，可作為肉牛產(chǎn)肉性狀的輔助選擇標(biāo)[9]。我們的研究結(jié)果表明PPARα基因的雜合基因型CT與黃牛體斜長(zhǎng)顯著相關(guān)。牛體重與體斜長(zhǎng)相關(guān)，這說明牛PPARα exon7遺傳多態(tài)性與體重指標(biāo)直接關(guān)聯(lián)，與之前所報(bào)道的牛PPARα基因影響脂質(zhì)代謝和能量代謝的報(bào)道一致。然而本研究未涉及肉品質(zhì)指標(biāo), 因此牛PPARα基因是否會(huì)影響肉牛肉品質(zhì)有待進(jìn)一步研究。所以，PPARα基因可能在家畜生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮一定作用。

[1] Yuan G, Chen X, Li D. Modulation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) by conjugated fatty acid in obesity and inflammatory bowel disease[J]. Journal of agricultural and food chemistry, 2015, 63(7): 1883-1895.

[2] Penas F, Mirkin G A, Vera M, et al. Treatment in vitro with PPARα and PPARγ ligands drives M1-to-M2 polarization of macrophages from T. cruzi-infected mice[J]. Biochimica et biophysica acta-molecular basis of disease, 2015, 1852(5) :893-904.

[3] Falcone R, Florio T M, Di G E, et al. PPARβ/δ and γ in a rat model of parkinson's disease: possible involvement in PD symptoms[J]. Journal of cellular biochemistry, 2015, 116(5): 844-855.

[4] Peng Z, Ban K, Wawrose R A, et al. Protection by enteral glutamine is mediated by intestinal epithelial cell peroxisome proliferator activated receptor gamma during intestinal ischemia/reperfusion[J]. Shock, 2015, 43(4): 327-333.

[5] Gu S J, Chen D H, Guo Z R, et al. Effect of obesity on the association between common variations in the PPAR gene and C-reactive protein level in Chinese Han population[J]. Endocrine, 2015, 48(1): 195-202.

[6] Van Diepen J A, Jansen P A, Ballak D B, et al. PPAR-alpha dependent regulation of vanin-1 mediates hepatic lipid metabolism[J]. Journal of Hepatology, 2014, 61(2): 366-372.

[7] Montiel P G, Antaramian A, Miyasaka A S, et al. Role of coactivator PGC-1α in energy balance: Importance in the production of beef cattle[J]. Archivos Latinoamericanos de Produccion Animal, 2008, 16(2):63-77.

[8] Nkrumah J D, Sherman E L, Li C, et al. Primary genome scan to identify putative quantitative trait loci for feedlot growth rate, feed intake, and feed efficiency of beef cattle[J].Journal of Animal Science, 2007, 85 (12): 3170-3181.

[9] Sebastian L, Beatrice G, Holger K, et al. Clofibrate causes an upregulation of PPAR-αtarget genes but does not alter expression of SREBP target genes in liver and adipose tissue of pigs[J]. American Journal of Physiology, 2007 , 293(1): 70-77.

[10] 樊月圓，林森，王洪寶，等. 牛過氧化物酶體增殖激活受體 (PPAR)基因第5外顯子多態(tài)性與胴體,肉質(zhì)性狀的相關(guān)性[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010,18(40):713-714.

[11] 晉大鵬. 豬PPARGC1A和CAPNS1基因多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志，2002，12(4)：45-48.

[12] 邵根寶，賈超，趙如茜，等. 豬13號(hào)染色體部分微衛(wèi)星標(biāo)記與肉質(zhì)性狀關(guān)系的研究[J].遺傳學(xué)報(bào),2005,32(5)：466-467.

[13] 孟和，王桂華，王啟貴，等. 雞PPAR基因單核苷酸多態(tài)與脂肪性狀相關(guān)的研究[J].遺傳學(xué)報(bào), 2002，29(2):119-123.

[14] 張英漢. 對(duì)中國(guó)黃牛資源認(rèn)知及持續(xù)利用問題的冷思考[J]. 中國(guó)牛業(yè)科學(xué), 2013, 39(6):1-6.

Polymorphism of the Exon 7 of PPARα Gene and Correlation with Growth Traits in Chinese Indigenous Cattle

LI Fen1,3, LI Rong-rong2, ZHANG Qiong-qiong3, MA Yun3, LU Jian-xiong1

(1.Collegeoflifescienceandengineering,NorthwestUniversityforNationalities,Lanzhou,Gansu730030;2.ZhishanSchoolofTengzhou,Zaozhuang,Shandong277599;3.CollegeofLifeSciences,XinYangNormalUniversity,Xinyang,Henan464000)

【Objective】 The aim of this study was to provide theoretical basis for the molecular breeding of local cattle growth traits in China. 【Method】In order to better understand the effect of PPARα gene which related with bovine fat metabolism in 424 Chinese indigenous cattle samples, including Nanyang cattle (NY), Jiaxian red cattle (JX), Luxi cattle (LX) and Qinchuan cattle (QC). A novel SNP of exon 7 locus of the bovine PPARα gene was detected with bioinformatics, PCR-RFLP, and DNA sequencing to investigate the genetic variations of PPARα. In addition, an association study was carried out to determine the effect of the SNPs of PPARα gene in exon 7 on the growth and meat quality traits. 【Result】 As a result, the SNP (C/T) was identified at 164 bp of PPARα gene in exon 7 (AC_000162.1), which contained two genotypes (CC and CT). The genetic analysis showed that SNP (C/T) was midrange polymorphism (0.25

Chinese indigenous cattle; PPARα gene; SNPs; association analysis

2015-07-20修改日期:2015-07-25

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31172193), 河南省科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目 (No. 134100510012), 河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 (No. 14IRTSTHN012) 及信陽師范學(xué)院青年科學(xué)基金(2015037)資助。

李芬(1976-)，女，陜西安康人，實(shí)驗(yàn)師，在讀碩士，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail:lifen2843@126.com

盧建雄，男，博士，教授，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。 E-mail:lu2003jx@163.com

S823.2

A

1001-9111(2016)01-0001-05