徐建峰,容維中,王 珂,郭海龍

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平涼 744000)

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早勝牛及其雜交類群GH基因遺傳多態(tài)性研究

徐建峰,容維中*,王 珂,郭海龍

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平涼 744000)

[目的]為深入探究早勝牛的分子遺傳特性及潛力，重視和保護地方優(yōu)秀種質資源，加快甘肅省肉牛新品種選育。[方法]以GH 基因作為影響早勝牛及其雜交類群生長發(fā)育性狀的候選基因，采用PCR-SSCP方法和DNA測序技術分析了GH基因Exon2和Exon5兩個位點的遺傳多態(tài)性。[結果]表明：GH基因存在遺傳多態(tài)性，其中，Exon2位點檢測到C1059T和C1150A 兩處SNPs，產生了AA、AB和BB 三種基因型；Exon5位點檢測到C2258T、C2277T和 A2291C三處SNPs，產生了CC和CD兩種基因型。[結論]為開展早勝牛GH基因遺傳多態(tài)性與其生產性能的相關性研究提供了一定的理論依據(jù)。

早勝牛；GH基因；PCR-SSCP；品種；選育

早勝牛是在隴東早勝塬等溝壑山區(qū)特有的黃土高原自然環(huán)境下，引入秦川牛經過長期馴化和雜交選育形成的地方群體，具有培育現(xiàn)代肉牛的潛力和生產以沉積脂肪為特點的優(yōu)質高檔牛肉的潛質[1]。

隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，從分子水平上探索物種的遺傳多樣性，已成為群體遺傳學和進化生物學研究的一個重要領域，也使得在人為選留地方群體優(yōu)良特性的基礎上，應用分子輔助標記選擇技術培育以肉用性狀為主的肉牛新類群(品種)成為可能。部分研究[2-5]表明，生長激素基因(growth hormone，GH)是動物生長發(fā)育和代謝的主要調節(jié)因子，具有促進蛋白質合成及骨骼肌肉生長、減少脂肪沉積、提高動物生長速度和參與動物免疫及泌乳等功能。

本研究以早勝牛及其雜交類群為試驗對象，以GH基因作為影響生長發(fā)育性狀的候選基因，采用 PCR-SSCP 技術對GH基因外顯子2及外顯子5進行多態(tài)性分析，旨在深入探究早勝牛的分子遺傳特性及潛力，為重視和保護地方優(yōu)秀種質資源，加快我省肉牛新品種選育提供分子水平上的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血樣的采集 在慶陽及平涼市規(guī)模養(yǎng)殖企業(yè)及散養(yǎng)戶，采集早勝牛及其雜種牛血樣240份，每份血樣7 mL，低溫條件下帶回實驗室，于-20℃超低溫冰箱保存。

1.1.2 引物的設計與合成 參照已發(fā)表在Gen Bank上的GH基因核苷酸序列(登錄號：M57764)，采用Prime 5.0 軟件設計2對引物，由北京三博遠志生物技術有限責任公司進行合成，引物信息見表1。

1.1.3 主要試劑 Taq Master Mix反應混合液、GoldView (GV)染色劑、Tris-HC1緩沖液、N,N-二亞甲雙丙烯酰胺、乙二胺四乙酸二鈉等試劑均購自北京三博遠志生物技術有限責任公司，血液DNA提取試劑盒購自Omegabiotek公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用D3471型血液DNA提取試劑盒對牛冷凍血液DNA進行提取，然后用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和分光光度計檢測OD260/OD280值。

表1 引物信息

1.2.2 PCR擴增 PCR反應體系：總體積50 μL，其中2×Taq Master Mix 混合液25 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各2 μL，DNA模板(100 ng/μL)2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應條件:：94℃預變性5 min，32個循環(huán)(GH-2：94℃變性5 min，60℃退火50 sec，72℃延伸50 sec；GH-5：94℃變性30 sec，51℃退火40 sec，72℃延伸50 sec)，72℃延伸8 min，4℃保存。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

1.2.3 SSCP檢測與測序 取2 μLPCR產物與6 μL變性緩沖液(98%甲酰胺、10 mmol/L EDTA、0.025%溴酚蘭、0.025%二甲苯青)混勻，98℃變性10 min后置于冰水浴上5 min，然后分別上樣于不同濃度(GH-2為8%、GH-5為12%)和交聯(lián)度為29:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠，在4℃、220 v的條件下預電泳20 min，然后將電泳槽接通電源后放在冰箱中(4℃、140v)恒溫恒壓電泳12～18h。電泳結束后，用優(yōu)化后的銀染法進行染色，根據(jù)染色后條帶位置及數(shù)量判定不同基因型，并將不同基因型個體送至北京三博遠志生物技術有限責任公司進行純化和測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用PopGen32軟件計算基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)、純合度(Ho)、雜合度(He)，利用PIC CALC V0.6軟件計算多態(tài)性信息含量(PIC)。

2 結果

2.1 基因組DNA提取

采用試劑盒法提取的DNA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象(圖1)。經分光光度計檢測，OD260/OD280值為1.7，純度較好。

圖1 血液基因組 DNA 凝膠電泳圖

2.2 PCR擴增

對240頭早勝牛及其雜交類群GH基因第2外顯子及第5外顯子進行PCR擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2、圖3)。結果顯示，擴增片段與目的片段大小一致，條帶特異性良好，可以進行SSCP分析。

圖2 Exon2 位點 PCR 擴增產物圖3 Exon5 位點 PCR 擴增產物

2.3 SSCP多態(tài)性檢測

經PCR-SSCP檢測，發(fā)現(xiàn)GH基因Exon2位點及Exon5位點均存在遺傳多態(tài)性，其中，Exon2位點發(fā)現(xiàn)C1059T和C1150A 兩處SNPs(圖4)，產生了A、B 兩個等位基因和AA、BB、AB三種基因型(圖5)。Exon5位點發(fā)現(xiàn)C2258T、C2277T、 A2291C三處SNPs(圖6)，產生了C、D兩個等位基因和CC、CD兩種基因型(圖7)。

Exon2位點，早勝牛及其雜交類群體中等位基因A的基因頻率高于等位基因B，為優(yōu)勢等位基因；基因型頻率從大到小依次為AA、BB和AB型，AA型為優(yōu)勢等位基因型。該群體純合度接近1，趨于純合狀態(tài)；PIC<0.25，屬于低度多態(tài)(表2)。

Exon5位點，早勝牛及其雜交類群體中C為優(yōu)勢等位基因，CD型為優(yōu)勢等位基因型。該群體純合度較高，且0.25

圖4 Exon2 位點不同基因型測序圖

圖5 Exon2 位點 PCR-SSCP 檢測結果

圖6 Exon5 位點不同基因型測序圖

圖7 Exon5 位點 PCR-SSCP 檢測結果

表2 GH基因Exon2位點遺傳多態(tài)分析

表3 GH基因Exon5位點遺傳多態(tài)分析

3 分析與討論

本研究采PCR-SSCP和DNA測序技術對早勝牛及其雜交類群GH基因不同位點的多態(tài)性進行了分析，發(fā)現(xiàn)GH基因Exon2位點上存在兩處SNPs和3種基因型，這與王利明等[6]研究發(fā)現(xiàn)的信陽水牛第2外顯子存在1處SNP(G413A)和產生了CC、CD和DD三種基因型的結果類似。Exon5位點上檢測到三處SNPs，這與薛愷等[7]在南陽牛中發(fā)現(xiàn)的研究結果一致，除以上突變外，高雪等[8]、郝靈慧等[9]還在2141bp、2386bp處檢測到C/G、T/C的替換，這表明在牛GH 基因第5外顯子多態(tài)性豐富，屬于高突變區(qū)。此外，高雪等[10]在第5外顯子檢測到3種基因型，而本研究發(fā)現(xiàn)兩種基因型，這可能與牛種不同和樣本量采集范圍有關，有待進一步驗證。

群體多態(tài)信息含量(PIC)與群體雜合度(He)都是反映群體遺傳多樣性的指標，其數(shù)值的大小表明群體中遺傳變異水平的高低。本研究發(fā)現(xiàn)，GH基因Exon2和Exon5位點分別呈現(xiàn)出低度多態(tài)和中度多態(tài)，表明GH基因Exon5位點，早勝牛純合度較高，群體遺傳變異較大、可選擇的空間很大，適合作為經濟性狀與基因型間連鎖分析的候選標記，以便為早勝牛遺傳資源的保護和肉用潛力的開發(fā)利用提供依據(jù)。

[1] 甘肅省畜牧廳主編.甘肅省畜禽品種志[M].蘭州:甘肅人民出版社,1986.

[2] Sweeney G,et al.Leptin signalling[J].Cell Signal,2002,14(8):655-663.

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[5] 黎 真,牛 冬,阮 暉,等.影響畜禽重要經濟性狀的主效基因研究進展[J].家態(tài)生態(tài),2004,25(4):147-151.

[6] 王利明,梁小娟,石亞飛,等.信陽水牛GH基因多態(tài)性與部分生長性狀的相關性[J].安徽農學通報,2012,18(21):75-77.

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[10] 高 雪,徐秀容,許尚忠,等.影響牛生長發(fā)育性狀的GH 基因遺傳效應分析[J].中國農業(yè)科學,2006,39(3):606-611.

Polymorphism Analysis of Growth Hormone Gene(GH) in Zaosheng Cattle and Hybrid Groups

XU Jian-feng, RONG Wei-zhong, WANG Ke, GUO Hai-long

(AnimalhusbandryandVeterinaryResearchInstituteinGansuProvince,PingLiang,Gansu744000)

GH gene were used as candidate gene which was influenced with growth and development traits in zaosheng cattle and hybrid groups. PCR-SSCP and DNA sequencing technologies were conducted to detect their single nucleotide polymorphism. The results showed that there were two SNPs (C1059T、C1150A) and three genotypes in the exon 2 of GH gene, and three SNPs (C2258T、C2277T、A2291C) and two genotypes in the exon 5 of GH gene. Therefore, the study result provided certain theoretical basis with association study of genetic polymorphism of GH gene and production performance in.

Zaosheng cattle; GH gene; RCP-SSCP; breed; breeding

2015-12-21修改日期:2015-12-29

甘肅省技術研究與開發(fā)專項計劃“分子遺傳標記在早勝牛遺傳多樣性研究中的應用” (項目編號：1207TCYL016)。

徐建峰(1981-)，男，漢，甘肅天水人，助理研究員，E-mail：710401384@qq.com。

容維中(1965-)，男，漢，甘肅平涼人，副研究員，研究方向為動物營養(yǎng)及牛羊繁殖技術。

S823.2

A

1001-9111(2016)01-0006-04