蔣 麗，李 爽，崔 瑜，3，王偉峰，4，李恒德* (.中國水產(chǎn)科學研究院生物技術(shù)中心，北京 004；.中國水產(chǎn)科學研究院營口增殖實驗站，遼寧營口 5000；3.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 0306；4.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，湖北武漢 430070)

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半滑舌鰨偽雄魚性腺發(fā)育的組織學研究

蔣 麗1，李 爽2，崔 瑜1，3，王偉峰1，4，李恒德1*(1.中國水產(chǎn)科學研究院生物技術(shù)中心，北京 100141；2.中國水產(chǎn)科學研究院營口增殖實驗站，遼寧營口 115000；3.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；4.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，湖北武漢 430070)

[目的]了解半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)的生理發(fā)育過程。[方法]對5個家系的半滑舌鰨進行性腺發(fā)育的組織學觀察、遺傳性別鑒定和生理性別分析。[結(jié)果]半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)有著明顯的群體性，性逆轉(zhuǎn)只發(fā)生在特定群體中，有些群體完全不逆轉(zhuǎn)；半滑舌鰨發(fā)生逆轉(zhuǎn)的遺傳雌魚在性腺發(fā)育過程中，會出現(xiàn)明顯的兼性階段，即雌雄兼有的特有過程。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為剖析半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)的分子、生理機理以及性逆轉(zhuǎn)遺傳因子的作用機理提供研究方向和研究線索。

半滑舌鰨；性別逆轉(zhuǎn)；間性性腺；偽雄魚

半滑舌鰨(CynoglossussemilaevisGunther)，俗稱龍利、鰨米、牛舌頭，隸屬蝶形目(Pleuronectiform)舌鰨科(Cynoglossidae)舌鰨屬(Cynoglossus)，為我國近海常見的大型暖溫性底層魚類，具有個體大、味道鮮美、營養(yǎng)豐富等特點，目前已經(jīng)實現(xiàn)工廠化養(yǎng)殖和人工繁育[1]。半滑舌鰨雌魚的生長速度是雄魚的 2～4倍，而且雄魚經(jīng)過2年培育尚未達到商品上市規(guī)格[2]。在實際的工廠化養(yǎng)殖生產(chǎn)中，常常會出現(xiàn)雌性數(shù)量逐漸減少且遠遠少于雄性的現(xiàn)象，導(dǎo)致最終的半滑舌鰨養(yǎng)殖群體中雌雄比例差異很大。養(yǎng)殖場在購買苗種時雌性比例往往很低，通常低于 25%，最低時甚至不到20%，嚴重制約了生產(chǎn)效益的提高[3]。Otake等[4]研究表明半滑舌鰨在苗種期存在遺傳雌魚向表型雄魚單向性逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，致使部分雌魚性逆轉(zhuǎn)為雄魚，導(dǎo)致養(yǎng)殖生產(chǎn)中半滑舌鰨雄性占比很大。

性逆轉(zhuǎn)是在一定條件下動物的雌雄個體相互轉(zhuǎn)化的一種現(xiàn)象，性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象在魚類中比較常見[5]。許多魚類的性別受基因和環(huán)境的雙重調(diào)控，外部環(huán)境中的溫度、pH、光照、鹽度和內(nèi)部遺傳因素等都可能影響魚類的性別分化[6-9]。一般魚類性腺分化可分為雌雄同體和雌雄異體2類[10]。雌雄同體性逆轉(zhuǎn)魚類有黃鱔(Monopterusalbus)[11]和石斑魚(Epinephelus)[12]等，它們有的是雌性性腺發(fā)育成熟后逆轉(zhuǎn)為雄性，有的是雄性性腺發(fā)育成熟后逆轉(zhuǎn)為雌性[11，13]。雌雄異體魚類的性腺分化又可劃分為分化型和未分化型[14-15]。在未分化類型中，未分化的性腺最初發(fā)育成類似卵巢樣的性腺，然后約有一半個體變成雄性，而另一半變成雌性，如斑馬魚(Brachydaniorerio)[16]；在分化型中，未分化的性腺直接分化成精巢或卵巢，如青鳉(Oryziaslatipes)[17]。只有在性腺發(fā)育的特定時期用性類固醇激素、溫度、光照等條件進行人工誘導(dǎo)，分化型的雌雄異體性別的人工控制才能獲得成功。半滑舌鰨雌雄異體，人為地控制溫度等外部條件可使雌魚逆轉(zhuǎn)為雄魚[9]，屬于分化型；半滑舌鰨只有一種逆轉(zhuǎn)方向，即從遺傳雌魚向生理雄魚轉(zhuǎn)化，未發(fā)現(xiàn)有從遺傳雄魚向生理雌魚方向轉(zhuǎn)化。Orban等[3]研究發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨的性逆轉(zhuǎn)也受遺傳因子的調(diào)控，其偽雄魚作為父本，其后代的遺傳雌魚全部逆轉(zhuǎn)為生理雄魚，這可能與表觀遺傳有關(guān)。然而，關(guān)于正常雄魚作為親本其后代發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的分子遺傳機制尚未闡明[3]。

在實際生產(chǎn)中半滑舌鰨雌性率低一直是制約半滑舌鰨發(fā)展的最重要因素[18]。如何提高半滑舌鰨在生產(chǎn)中的雌性率，進而提高半滑舌鰨在人工養(yǎng)殖中的經(jīng)濟效益是研究重點之一。利用性逆轉(zhuǎn)的分子遺傳特性進行遺傳選育是解決半滑舌鰨雌性率低的一種很好的方法[19]。半滑舌鰨在性逆轉(zhuǎn)過程中的組織變化特征可以為進一步了解性逆轉(zhuǎn)的遺傳機制提供豐富的生理學信息。筆者利用組織學觀察研究了半滑舌鰨在性逆轉(zhuǎn)過程中的性腺組織和細胞形態(tài)的變化，旨在為今后的分子遺傳研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料2014年5月育苗的5個半滑舌鰨家系，分別為2、3、7、8、9號家系，各家系在工廠化養(yǎng)殖模式下同池養(yǎng)殖。

1.2 方法

1.2.1樣品采集。2013年9月和2014年11月各采集樣品1次。每次每個家系隨機撈取50尾，共500個樣本。在解剖鏡下將魚的性腺取出，置于波恩(Bouin)固定液中(苦味酸飽和液∶甲醛∶冰醋酸=15∶5∶1)固定，24 h后將樣品轉(zhuǎn)移至70%乙醇中，并做好標記，常溫下可長期保存。剪取適量的組織樣品置于離心管中，恒溫4 ℃下保存，并做好標記，備用。

1.2.2性別鑒定。

1.2.2.1遺傳性別鑒定。采用海洋動物組織基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取半滑舌鰨DNA，溶解于50 μL TE 中，進行1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃下保存?zhèn)溆?。設(shè)計1對引物序列，上游序列為GAGGCCGACAGGATCGTAC，下游序列為TACGACGTACTCCGGTGGTTTT。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系(20 μL)為：2×PCR mix 10 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板(原液稀釋20倍)1 μL，添加ddH2O 補足20 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。對PCR產(chǎn)物進行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓 140 V，電泳時間 30 min，檢測出現(xiàn)2條帶(218和206 bp)的為雌魚(ZW)，出現(xiàn)1條帶(206 bp)的為雄魚(ZZ)。

1.2.2.2生理性別鑒定。采用石蠟組織切片的方法，進行生理性別鑒定。切片步驟如下：①脫水。70%乙醇(45 min)、 80%乙醇(45 min)、90%乙醇(45 min)、95%乙醇(45 min)、100%乙醇(40 min)；②透明。1∶1苯醇(40 min)、二甲苯(30 min)；③浸蠟。1∶1苯蠟(45 min)、純蠟1(45 min)、純蠟2(45 min)；④包埋；⑤切片。使用切片儀SYD-S2020 型切片，厚度6 μm；⑥展片。Leica HI1220 型展片儀，40 ℃下展平并烘干；⑦HE染色。展片后12 h進行HE染色；⑧樹膠封片。最后對切片進行鏡檢并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 各家系雌魚、雄魚以及偽雄魚所占比例由表1可知，不同家系間雌魚逆轉(zhuǎn)率存在較大的差異。在5個家系中遺傳性別雌雄比例為40%～60%，除3號家系的遺傳雌性遠低于遺傳雄性外，其余4個家系的遺傳雌性略低于遺傳雄性。2號、3號、7號家系分別有1尾、15尾、2尾雌魚發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，8號、9號家系雌魚沒有發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，5個家系逆轉(zhuǎn)率分別為2.3%、39.5%、 4.3%、 0和 0。各家系中偽雄魚所占比例分別為1%、15%、2%、0和0。

表1 各家系雌魚、雄魚和偽雄魚所占比例

2.2 性逆轉(zhuǎn)的性腺變化及間性性腺發(fā)育階段半滑舌鰨性腺組織切片中可見性腺分化后形成的精巢和卵巢(圖1 A、圖1B)。在精巢中分布有大量的精小囊，同一個體的精小囊內(nèi)可能包含不同時期的生殖細胞，有些精小囊中有大量成熟的精子，有些精小囊中有許多處于分裂期的初級精母細胞和次級精母細胞，有的甚至存在精原細胞(圖1C)。卵巢中，卵巢腔清晰可見，存在大量的卵原細胞以及處于分裂期的初級卵母細胞、次級卵母細胞和卵細胞(圖1D)。對比遺傳性別鑒定結(jié)果和生理性別鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的部分雌性完全逆轉(zhuǎn)為雄性，卵巢也完全轉(zhuǎn)化為精巢，轉(zhuǎn)化后的偽雄魚精巢結(jié)構(gòu)與遺傳雄魚精巢的結(jié)構(gòu)基本相似(圖1E)。此外，發(fā)現(xiàn)在半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)的部分個體中存在間性性腺，即在類似卵巢的性腺中除了存在雌性生殖細胞外還存在雄性生殖細胞(圖1F、圖1J)。在間性性腺中雌雄生殖細胞的比例不盡相同，在以雌性生殖細胞為主的間性性腺中雄性生殖細胞均勻分布(圖1G)，而以雄性細胞為主的間性性腺中雌性生殖細胞零星的分布于整個性腺或集中分布于某一塊區(qū)域(圖1H、圖1I)。

3 討論

3.1 不逆轉(zhuǎn)家系與生產(chǎn)利用通過對遺傳性別鑒定結(jié)果和生理性別鑒定結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)在5個半滑舌鰨家系中8號和9號家系198尾魚都沒有發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，而另外3個家系都有偽雄魚出現(xiàn)，這說明在半滑舌鰨家系中存在不發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的家系。在實際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖不逆轉(zhuǎn)家系可以有效降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟效益。由于雄性半滑舌鰨生長速度慢，其體型較雌性小，在生產(chǎn)中會占據(jù)雌魚的生存空間和資源，經(jīng)濟價值較低。利用分子標記來直接鑒定大生產(chǎn)群體中的遺傳雌魚和雄魚需要耗費大量的人力和物力。如何利用性逆轉(zhuǎn)性狀的遺傳規(guī)律開展不逆轉(zhuǎn)品系的培育是半滑舌鰨養(yǎng)殖生產(chǎn)中亟需解決的問題之一。

3.2 部分逆轉(zhuǎn)家系與選種或選配策略對比5個家系的逆轉(zhuǎn)率，發(fā)現(xiàn)部分家系存在性逆轉(zhuǎn)，而不同家系的性逆轉(zhuǎn)率差別很大。5個家系中2號、3號、7號家系都存在性逆轉(zhuǎn)，其中3號家系的逆轉(zhuǎn)率最高達到39.5%，2號和7號家系的逆轉(zhuǎn)率較低，分別為2.3%和4.3%，8號和9號家系不發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。結(jié)合對性逆轉(zhuǎn)性狀的遺傳研究結(jié)果[3]，利用不同分離群體對性逆轉(zhuǎn)性狀進行精細遺傳解析，有希望找出控制或與之關(guān)聯(lián)的遺傳因子或相關(guān)位點，揭示相關(guān)遺傳因子在性逆轉(zhuǎn)決定過程中的作用機理，對于今后選種或者選配以獲得全雌或者高雌性苗種意義重大。

注：A.精巢；B.卵巢；C.精巢內(nèi)精小囊及生殖細胞；D.卵巢內(nèi)生殖細胞； E.遺傳雌魚性逆轉(zhuǎn)為偽雄魚形成的精巢；F.類似卵巢的間性性腺(箭頭為性腺內(nèi)雌雄生殖細胞)；G.雌性生殖細胞為主的間性性腺雄性生殖細胞均勻分布；H.雄性細胞為主的間性性腺雌性生殖細胞零星的分布于整個性腺；I.雄性細胞為主的間性性腺中雌性生殖細胞集中分布于某一塊區(qū)域；J.類似卵巢的間性性腺(細部圖)。

3.3 兼性生殖階段與性逆轉(zhuǎn)半滑舌鰨由于其雌雄生長的差異、雌性性逆轉(zhuǎn)為生理雄魚、基因組小、易于遺傳操作等特點，有望使其成為研究性逆轉(zhuǎn)的理想遺傳材料。Chen等[20]研究發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)與基因組水平的甲基化有關(guān)，但是對于性逆轉(zhuǎn)性狀的遺傳解析報道較少。筆者研究了半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)過程中性腺及生殖細胞的變化，試驗發(fā)現(xiàn)性逆轉(zhuǎn)過程中有間性性腺出現(xiàn)，說明遺傳雌性個體在遺傳因素和外界環(huán)境因子共同作用下，生殖干細胞逐步分裂分化是受精細調(diào)控的，這為半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)的遺傳機制研究提供了表型鑒定的組織學依據(jù)。

4 結(jié)論

利用遺傳性別鑒定和生理性別鑒定研究性逆轉(zhuǎn)時，不同家系的性逆轉(zhuǎn)率差別很大，在所研究的家系中既有不發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的家系，又有部分性逆轉(zhuǎn)的家系；在發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的家系中，逆轉(zhuǎn)率差異很大，最低至2.3%，最高達到39.5%；半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)時性腺除了分化成精巢和卵巢外，部分個體存在間性性腺，間性性腺的發(fā)現(xiàn)為研究性逆轉(zhuǎn)機制提供了組織學表型證據(jù)。

[1] LIU H Q，GUAN B，XU J，et al.Genetic Manipulation of sex ratio for the large-scale breeding of YY super-male and XY all-male yellow catfish(Pelteobagrusfulvidraco(Richardson))[J].Marine biotechnology，2013，15(3)： 321-328.

[2] MEI J，GUI J F.Genetic basis and biotechnological manipulation of sexual dimorphism and sex determination in fish [J].Science China life sciences，2015，58(2)：124-136.

[3] ORBAN L，SREENIVASAN R，OLSSON P E.Long and winding roads： Testis differentiation in zebrafish [J].Molecular and cellular endocrinology，2009，312(1/2)： 35-41.

[4] OTAKE H，SHINOMIYA A，MATSUDA M，et al.Wild-derived XY sexreversalmutants in the Medaka [J].Genetics，2006，173(4)： 2083-2090.

[5] ZHANG Q，SUN X H，QI J，et al.Sex determination mechanisms in fish [J].Journal of ocean university of China，2009，8(2)： 155-160.

[6] 鄧景耀，孟田湘，任勝民，等.渤海魚類種類組成及數(shù)量分布[J].海洋水產(chǎn)研究，1988(9)： 11,91.

[7] 鄧思平，陳松林，田永勝，等.半滑舌鰨的性腺分化和溫度對性別決定的影響[J].中國水產(chǎn)科學，2007，14(5)： 714-719.

[8] 季相山，陳松林，馬洪雨，等.半滑舌鰨養(yǎng)殖群體中自然性逆轉(zhuǎn)偽雄魚的發(fā)現(xiàn)[J].水產(chǎn)學報，2010，34(2)： 322-327.

[9] 梁卓，陳松林，張靜.半滑舌鰨養(yǎng)殖群體雌雄比例與自然性逆轉(zhuǎn)率[J].中國水產(chǎn)科學，2013(1)： 44-49.

[10] 羅杰，施鵬.魚類性逆轉(zhuǎn)研究最新進展[C]//全國生物遺傳多樣性高峰論壇會刊.昆明：中國遺傳學會，2012.

[11] 馬學坤，柳學周，溫海深.半滑舌鰨性腺分化的組織學觀察[J].海洋水產(chǎn)研究，2006，27(2)： 55-61.

[12] 孟田湘，任勝民.渤海半滑舌鰨的年齡與生長[J].海洋水產(chǎn)研究，1988(9)： 173-185.

[13] 沈志剛.黃顙魚與藍鰓太陽魚性別控制及性別決定機制研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2014.

[14] 宋超，蔣麗，王景偉，等.半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)的遺傳特性研究[J].生物技術(shù)通報，2015，31(3)： 207-212.

[15] 陶亞雄，林浩然.黃鱔自然性反轉(zhuǎn)的研究[J].水生生物學報，1991，15(3)： 274-278.

[16] 王美玉.半滑舌鰨性別決定機制證明及生長相關(guān)微衛(wèi)星標記篩選[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2013.

[17] 邢晨光，金姍，袁思平.石斑魚性逆轉(zhuǎn)研究現(xiàn)狀[J].水產(chǎn)科學，2006，25(4)： 214-216.

[18] 鈴木克美，熊國強.硬骨魚類的雌雄同體現(xiàn)象[J].水產(chǎn)科技情報，1990，17(5)： 151-154.

[19] 游秀容，蔡明夷，姜永華，等.大黃魚性腺性別分化的組織學觀察[J].水產(chǎn)學報，2012，36(7)： 1057-1064.

[20] CHEN S L，ZHANG G，SHAO C，et al.Whole-genome sequence of a flatfish provides insights into ZW sex chromosome evolution and adaptation to a benthic lifestyle [J].Nature genetics，2014，46(3)：253-260.

Histological Research on Gonadal Development of Pseudo-male Fish inCynoglossussemilaevis

JIANG Li1, LI Shuang2, CUI Yu1,3, LI Heng-de1*et al (1. Research Center of Biotechnology, Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing 100141; 2. Yingkou Aquaculture Experimental Station, Chinese Academy of Fishery Sciences, Yingkou, Liaoning 115000; 3. College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 4. College of Fisheries, Huazhong Agriculture University, Wuhan, Hubei 430070)

[Objective] To better understand the physiological development of the sex-reversal ofCynoglossussemilaevis. [Method] This study focus on the observation of gonadal development histologically among five families ofCynoglossussemilaevis, the genetic-sex identification and the analysis for physiological sex. [Result] The sex-reversal only occurs among the specific population which characterized with population, no sex-reversal occurs among some particular population; There exists a particular obvious chimeric stage, which is a stage while the female and male gonadal cells coexist. [Conclusion] The above founds will give light for the future research on molecularly, physiologically mechanisms of the sex-reversal ofCynoglossussemilaevis, even the action mode with the genetically factors of the sex-reversal.

Cynoglossussemilaevis; Sex-reversal; Chimeric gonadal; Pseudo-male fish

中央公益性基本科研業(yè)務(wù)費專項(2016B005)。

蔣麗(1976- )，女，河南淮陽人，副研究員，博士，從事魚類性別控制和水產(chǎn)養(yǎng)殖學研究。*通訊作者，副研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事動物數(shù)量遺傳學研究。

2016-08-22

S 931.1

A

0517-6611(2016)30-0123-04