楊有望 高文明 易翠平 謝 濤 周素梅

(長沙理工大學化學與生物工程學院 健康谷物制品研究所1，長沙 410114) (湖南工程學院化學化工學院2，湘潭 411104) (中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所3，北京 100193)

秈米黃淀粉中蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)

楊有望1高文明1易翠平1謝 濤2周素梅3

(長沙理工大學化學與生物工程學院 健康谷物制品研究所1，長沙 410114) (湖南工程學院化學化工學院2，湘潭 411104) (中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所3，北京 100193)

以分別經(jīng)中性蛋白酶和二硫蘇糖醇(DTT)處理的秈米黃淀粉或燦米黃淀粉蛋白樣品為對照，對秈米黃淀粉中蛋白質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能性質(zhì)及其對黃淀粉糊化性質(zhì)的影響進行了研究。結(jié)果表明，秈米黃淀粉中的蛋白質(zhì)是以小蛋白體的形式結(jié)合在纖維素上面，并與淀粉相互作用，共同影響黃淀粉蛋白的功能性質(zhì)；蛋白酶與二硫蘇糖醇對這種結(jié)構(gòu)能造成一定的破壞；秈米黃淀粉蛋白分子結(jié)構(gòu)中存在相當數(shù)量的二硫鍵，且二硫鍵遭受破壞的程度、蛋白分子中肽片段的多少以及分子間相互作用的強度同樣影響到秈米黃淀粉蛋白的各種功能性質(zhì)。

秈米 黃淀粉 蛋白質(zhì) 功能性質(zhì)

蛋白質(zhì)作為秈米的第二大組成成分，對其糊化、回生等基本特性影響很大，進而影響其加工性質(zhì)，但其具體的影響機理尚未闡明[1-4]。根據(jù)Osborne分類法，秈米中的蛋白質(zhì)可以分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，這部分蛋白質(zhì)可以用NaOH溶液提取、對淀粉糊化特性的影響已有相關(guān)研究[5]，但還有一部分蛋白質(zhì)跟秈米淀粉結(jié)合緊密、通過堿液不能提取，例如用0.05 mol/L NaOH溶液堿提離心得到的黃淀粉層，就還含有4%左右的蛋白質(zhì)，繼續(xù)用堿液處理亦不能去除[5-6]，說明這部分蛋白質(zhì)與淀粉可能有特殊的結(jié)合方式。因此，本論文首先分析了秈米黃淀粉中蛋白質(zhì)不同狀態(tài)下的功能性質(zhì)，觀察秈米黃淀粉中蛋白質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并通過中性蛋白酶、二硫蘇糖醇(DTT)處理后淀粉糊化性質(zhì)的差異推測其結(jié)合鍵型，以期為闡明秈米黃淀粉中蛋白質(zhì)在秈米食品加工中的地位和作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃淀粉蛋白質(zhì)：采用淀粉酶水解制備，含水量14%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為80.52%，其余為灰分等；大米總蛋白：采用堿提酸沉制備，含水量11%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為88.43%。中性蛋白酶(酶活力200 000 U/g)、牛血清白蛋白、二硫蘇糖醇(DTT)、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、考馬斯亮藍等均為分析純。

722型可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；IKA T10勻漿機：廣州市金晶穗達科學儀器有限公司；快速黏度測定儀RVA，Super-4：Newport scientific 公司；冷凍切片機 Leica CM1950、顯微鏡Leica DM4000 B LED：德國徠卡公司；DK-2000-L型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛋白酶與DTT處理樣品的制備

以含水量14%的秈米黃淀粉蛋白為原料，按參考文獻[8]的方法分別制得含水量仍為11%的中性蛋白酶與DTT處理的秈米黃淀粉蛋白樣品。

1.2.2 溶解性的測定

將各種樣品用pH 7.0 的0.05 mol/L 磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液溶解[9]，25 ℃電磁攪拌1 h，3 000 r/min離心20min，用考馬斯亮藍法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量，由牛血清白蛋白作出標準曲線方程。蛋白質(zhì)的溶解性=上清液中蛋白質(zhì)含量/原料中總的蛋白質(zhì)含量×100%。

1.2.3 起泡性和起泡穩(wěn)定性的測定

[10]：將樣品用 pH 7.0的 0.05 mol/L 磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液配成 1 mg/100 mL 的溶液，取 100 mL 倒入高速組織搗碎機中，在10 000 r/min下攪拌 1 min；倒入 250 mL 量筒，盡快記錄泡沫體積(V0) 。蛋白質(zhì)的起泡性 FC=(V0-100)/100×100%，起泡穩(wěn)定性用失水率表示，即將上述體系靜置 30 min 后，測出下層析出液的體積(Vt)。失水率=Vt/V0×100%。

1.2.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定

采用濁度法[11]：以0.5%的樣品溶液20 mL, 邊攪拌邊加入純大豆色拉油10 mL, 然后以8 000～10 000 r/min 的速度高速勻漿2 min 制成乳狀液, 用微量注射器從底部抽取乳狀液50 μL, 放入一小燒杯中。然后加入25 mL 0.1% 的十二烷基璜酸鈉(SDS) 溶液制成混合液, 在500 nm 的波長下測吸光值E0, 該值為乳化活性指數(shù)(EAI) ,再過20 min 測吸光值E20, 乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)用以下公式計算:ESI=E0×20/(E0-E20)。

1.2.5 持水、吸油能力的測定

采用重量法[12]。持水性：準確稱取樣品0.3 g于離心管中，加入4 mL 水，放入帶刻度離心管中，用細金屬絲攪拌1 min, 使樣品分散于水中，40 ℃水浴放置30 min, 在500 r/min離心25 min, 讀出游離水的體積。WHC (mL/g)=(4-游離水體積)/0.3。

吸油性：準確稱取樣品0.4 g于離心管中，加入4 mL金龍魚調(diào)和油，放入帶刻度離心管中，用細金屬絲攪拌1 min, 使樣品充分分散，靜置30 min, 在2 000 r/min離心25 min, 讀出游離油的體積，通過總油與未被吸附油的體積之差, 測其吸油性：吸油性(mL/g)=(4-游離油體積)/0.4。

1.2.6 黃淀粉的形態(tài)結(jié)構(gòu)

采用組織切片的方法：樣品0.25 g+2 mL水，在60、80、90 ℃分別水浴攪拌10 min，2 000 r/min轉(zhuǎn)離心 2 min，取沉淀在-16 ℃ 低溫恒冷，切片成3 μm厚，置于載玻片上，Lugols碘染色30 s，流水漂洗，甘油封片，用光學顯微鏡 Leica DM4000 BLED觀察黃淀粉中主要成分的形態(tài)結(jié)構(gòu)，軟件 LAS V4.1處理圖片。

1.2.7 黃淀粉的糊化性質(zhì)分析

采用快速黏度測定儀(RVA)測定[13]：稱取樣品 3.0 g(干基)，加入蒸餾水25 mL，制備測試樣品。在攪拌過程中，罐內(nèi)溫度變化如下：50 ℃保持1 min；以 12 ℃/min速率上升到95 ℃(3.75 min)；95 ℃保持 2.5 min，以12 ℃/min降到50 ℃(3.75 min)；50 ℃保持1.4 min。攪拌器在起始 10 s內(nèi)轉(zhuǎn)動速度為960 r/min，之后保持在160 r/min。得到米粉的糊化特性曲線，其中峰值黏度(單位為RVU，下同)、熱糊黏度、崩解值(最高黏度與熱糊黏度之差)、最終黏度、回生值(最終黏度與熱糊黏度之差)、糊化溫度(℃)是反映不同樣品RVA譜差異的重要特征值。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次試驗的平均值，采用SPSS軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秈米黃淀粉蛋白的功能性質(zhì)

2.1.1 溶解性

蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)及應(yīng)用性能很大程度上取決于其溶解性[10]。對于結(jié)構(gòu)比較完整的蛋白質(zhì)而言，它們的溶解性較差，如秈米蛋白及其黃淀粉蛋白的溶解度均在10%左右(見圖1)，且兩者差異不顯著(P>0.05)。與秈米黃淀粉蛋白相比，經(jīng)中性蛋白酶處理后的黃淀粉蛋白的溶解度顯著增高到38.11%，增加了4倍多(P<0.01)，這是由于蛋白質(zhì)遭受了蛋白酶的強烈破壞而降解成了水溶性更強的多肽[8]；而經(jīng)DTT處理后的黃淀粉蛋白的溶解性盡管也增加了2倍(P<0.05)，但增加倍數(shù)遠低于經(jīng)蛋白酶處理的黃淀粉蛋白，這是因為DTT雖然可以裂解二硫鍵破壞其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)從而增加其溶解性[8]，但蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)并沒有遭受嚴重破壞。

注：1 秈米蛋白，2 黃淀粉蛋白， 3 蛋白酶處理的黃淀粉蛋白， 4 DTT處理的黃淀粉蛋白。

圖1 4種蛋白的溶解性

2.1.2 起泡性與起泡穩(wěn)定性

由圖2可見，與秈米蛋白相比，秈米黃淀粉蛋白的起泡性與起泡穩(wěn)定性都有所下降，但差異不顯著(P>0.05)。然而，秈米黃淀粉蛋白經(jīng)中性蛋白酶處理后，其起泡性與起泡穩(wěn)定性都有顯著提高(P<0.05)，這是由于經(jīng)適當酶解處理后蛋白質(zhì)肽片段數(shù)增加、分子間的各種相互作用力也隨之增加，蛋白質(zhì)分子通過重排、鋪展以及相互間結(jié)合形成堅韌的界面膜，以形成更多的泡沫并防止其破裂[15]。另外，經(jīng)DTT處理的秈米黃淀粉蛋白，其起泡性與起泡穩(wěn)定性的變化均不顯著(P>0.05)，這可能是DTT處理僅破壞了蛋白質(zhì)分子的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分子間的范德華力、氫鍵及疏水相互作用等均未發(fā)生大的變化[8,15]。

注：1 秈米蛋白，2 黃淀粉蛋白， 3 蛋白酶處理的黃淀粉蛋白， 4 DTT處理的黃淀粉蛋白。下同。

圖2 4種蛋白的起泡性與起泡穩(wěn)定性

2.1.3 乳化性與乳化穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)乳化現(xiàn)象的形成是由于蛋白質(zhì)的疏水氨基酸與脂肪球表面結(jié)合，而親水氨基酸與水分子結(jié)合從而形成一層薄膜覆蓋在脂肪球表面，使脂肪球懸浮分散于水溶液中，形成乳狀液[15-16]。與溶解性相類似，對于結(jié)構(gòu)比較完整的秈米蛋白與秈米黃淀粉蛋白，它們的乳化性能幾無差別(P>0.05，見圖3a)，但乳化穩(wěn)定性則是后者高于前者約1倍(P<0.05，見圖3b)，這可能是由于黃淀粉蛋白樣品中含有較多的礦物成分，能夠形成有利于使蛋白質(zhì)起泡性能增強的離子強度，也即促進蛋白質(zhì)在乳狀液界面的絮凝和聚結(jié)。再由圖3a可看出，盡管經(jīng)DTT處理的秈米黃淀粉蛋白的乳化性要稍低于經(jīng)蛋白酶處理的秈米黃淀粉蛋白的乳化性(P>0.05)，但顯著高于秈米黃淀粉蛋白的乳化性(P<0.05)，這說明經(jīng)蛋白酶與DTT的適度處理有利于蛋白質(zhì)疏水氨基酸、親水氨基酸的暴露，增強其乳化能力。但是，秈米黃淀粉蛋白及其分別經(jīng)蛋白酶、DTT處理后的蛋白樣品的乳化穩(wěn)定性差別不顯著(P>0.05，見圖3b)，表明這3個蛋白樣品中維持乳狀液穩(wěn)定存在的相互作用強度相當。

圖3 4種蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性

2.1.4 吸油性與持水性

吸油性反映蛋白質(zhì)基質(zhì)吸附油的能力，而持水性則反映了蛋白質(zhì)基質(zhì)保留水的能力。由圖4可知，對于這4個蛋白樣品，它們的吸油性與吸水性基本相等，兩者由強到弱的順序依次為經(jīng)蛋白酶處理的黃淀粉蛋白>經(jīng)DTT處理的黃淀粉蛋白≈黃淀粉蛋白>秈米蛋白，這說明經(jīng)蛋白酶處理后蛋白質(zhì)中的親水與疏水性氨基酸暴露得最充分(P<0.05)，而分別經(jīng)DTT與堿處理后，這些氨基酸的暴露相對要弱些(P>0.05)。

圖4 4種蛋白的吸油性與持水性

2.2 秈米黃淀粉中蛋白質(zhì)的存在形態(tài)

Zheng等[14]采用組織切片法研究了谷粒糊粉層、次糊粉層和淀粉胚乳中蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)呈A、B、C 3種結(jié)構(gòu)形態(tài)。采用這種方法，研究了秈米黃淀粉中的蛋白質(zhì)在未糊化(60 ℃)、糊化點(80 ℃)及超過糊化點(90 ℃)3個溫度下的結(jié)構(gòu)形態(tài)，如圖5所示。由圖5可見，在黃淀粉中存在較多的類似于A、B、C的結(jié)構(gòu)(圖5a)，將A、B、C放大(圖5b)可以觀察到，這種結(jié)構(gòu)實際上是蛋白質(zhì)以小蛋白體的形式結(jié)合在纖維素上面，共同與淀粉相互作用，以影響秈米黃淀粉及其蛋白的功能性質(zhì)。具體地，A是黃淀粉未糊化時，顆粒清晰的小蛋白體和纖維素較為松散的結(jié)合；B是黃淀粉在糊化溫度時，蛋白體附著在纖維素上、包和在一起形成圈狀伸展開來；C是黃淀粉在超過糊化溫度10 ℃時，結(jié)合成圈狀的蛋白體和纖維素斷裂，形成線條狀結(jié)構(gòu)。這些秈米黃淀粉糊化過程中的蛋白質(zhì)的存在形態(tài)也可能是其影響秈米粉或黃淀粉糊化特性的行為方式。

圖5 黃淀粉的組織結(jié)構(gòu)

2.3 黃淀粉中蛋白質(zhì)對其糊化特性的影響

表1反映了黃淀粉中蛋白質(zhì)對其糊化特性的影響。由表1可知，秈米粉的峰值黏度、熱糊黏度、回生值、最終黏度均顯著低于秈米黃淀粉的(P<0.05)，而糊化溫度顯著高于秈米黃淀粉(P<0.05)，這與我們前期發(fā)現(xiàn)峰值黏度值與蛋白質(zhì)含量呈負相關(guān)的研究結(jié)果一致[6]。DTT是蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原劑，可用于阻止蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵的鏈接。中性蛋白酶主要是將蛋白質(zhì)分子降為小分子肽類，從而使改變蛋白質(zhì)與淀粉的作用方式。表1的結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃淀粉+DTT和黃淀粉+蛋白酶的峰值黏度、熱糊黏度、回生值、最終黏度均極顯著高于秈米粉和黃淀粉(P<0.01)，且黃淀粉+DTT又極顯著高于黃淀粉+蛋白酶(P<0.01)，說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)形態(tài)對黃淀粉的糊化性質(zhì)有影響，這與Xie等[1,13]的研究結(jié)果一致。此外，黃淀粉用DTT處理后糊化黏度值高于用蛋白酶處理的，說明黃淀粉蛋白質(zhì)的分子內(nèi)和分子間多以二硫鍵鏈接，它們對黃淀粉糊化性質(zhì)的影響超過了松散結(jié)構(gòu)的蛋白肽；也就是說，經(jīng)蛋白酶處理更有利于減弱蛋白質(zhì)對淀粉糊化的抑制作用，使淀粉顆粒膨脹增大，耐剪切力減弱，淀粉顆粒破裂度增大。

3 結(jié)論

3.1 秈米黃淀粉蛋白與秈米蛋白的溶解性、起泡性、起泡穩(wěn)定性及乳化性能比較接近，但秈米黃淀粉蛋白經(jīng)蛋白酶和DTT處理后，其溶解度顯著增高。秈米黃淀粉蛋白經(jīng)蛋白酶處理后，其起泡性與起泡穩(wěn)定性都顯著提高。無論經(jīng)DTT處理還是經(jīng)蛋白酶處理后的秈米黃淀粉蛋白的乳化性能相當，且較之秈米黃淀粉蛋白的有顯著增加，但三者的乳化穩(wěn)定性差別不大。

表1 黃淀粉中蛋白質(zhì)對其糊化特性的影響

3.2 秈米黃淀粉中的蛋白質(zhì)是以小蛋白體的形式結(jié)合在纖維素上面，共同與淀粉相互作用，以影響秈米黃淀粉蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)；蛋白酶與DTT能破壞這種結(jié)合。

3.3 與秈米粉相比，秈米黃淀粉的峰值黏度、熱糊黏度、回生值、最終黏度均要高很多，而糊化溫度卻要低得多；秈米黃淀粉經(jīng)DTT和蛋白酶處理后，其峰值黏度、熱糊黏度、回生值、最終黏度均顯著增高，且前者又明顯高于后者。

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Properties of Protein in Yellow Starch from Non-Waxy Rice

Yang Youwang1Gao Wenming1Yi Cuiping1Xie Tao2Zhou Sumei3

(School of Chemistry and Biological Engineering1, Changsha University of Science and Technology,Institute of Healthy Cereal Product1, Changsha 410114)(College of Chemical Engineering, Hunan Institute of Engineering2, Xiangtan 411104)(Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences3, Beijing 100193)

This study was to investigate the functional properties and pasting properties with its structure of protein in yellow starch from non-waxy rice (PYS-NR) treated by neutral protease and dithiothreitol (DTT). Results indicated that the solubility of PYS-NR was increased because of different protein structure formation treated by protease and DTT, the emulsification of them was almost the same, both higher than that of PYS-NR; and the foaming ability was increased significantly with foam stabilities. The protein was bonded on the fibrin as small protein body in PYS-NR, and their main existence forms were different under different temperature conditions, which might be the reason that led to peak viscosity, hot paste viscosity, setback and final viscosity of PYS-NR increased, and breakdown and paste temperature decreased. The peak viscosity, hot paste viscosity, setback and final viscosity of PYS-NR were also increased after being treated by protease and DTT, and the value of protease was lower significantly than DTT.

PYS-NR, functional properties, pasting properties, structure

TS236

A

1003-0174(2016)10-0050-06

國家自然科學青年基金(31301404)

2015-01-13

楊有望，男，1990年出生，碩士，糧食油脂與植物蛋白工程

易翠平，女，1973年出生，教授，糧食、油脂與植物蛋白工程