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花生蛋白亞基結(jié)構(gòu)與性質(zhì)研究進(jìn)展

2016-12-26 02:45石愛民劉紅芝
中國糧油學(xué)報(bào) 2016年10期
關(guān)鍵詞:亞基性質(zhì)花生

劉 麗 石愛民 劉紅芝 胡 暉 王 強(qiáng)

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

花生蛋白亞基結(jié)構(gòu)與性質(zhì)研究進(jìn)展

劉 麗 石愛民 劉紅芝 胡 暉 王 強(qiáng)

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

花生蛋白是一種營養(yǎng)與功能兼具的優(yōu)良植物蛋白,具有廣闊應(yīng)用前景,花生蛋白結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)研究是一直以來的研究熱點(diǎn)。主要總結(jié)了花生蛋白亞基組成與分類、結(jié)構(gòu)與性質(zhì),對花生蛋白亞基分離純化、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、構(gòu)效關(guān)系等方面研究進(jìn)展進(jìn)行了詳細(xì)論述,同時(shí)指出目前該研究領(lǐng)域中存在的問題,并對未來的研究重點(diǎn)進(jìn)行展望,為高品質(zhì)花生蛋白產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

花生蛋白 亞基 結(jié)構(gòu) 性質(zhì)

花生蛋白是一種營養(yǎng)與功能兼具的優(yōu)良植物蛋白,富含多種人體必需氨基酸,如精氨酸、谷氨、天門冬氨酸[1],能促進(jìn)腦細(xì)胞發(fā)育和增強(qiáng)記憶力。與其他植物蛋白相比,花生蛋白的消化率很高,消化系數(shù)可達(dá)90%,易被人體吸收利用,食用后不會產(chǎn)生食用大豆蛋白常出現(xiàn)的腹脹、嗝氣現(xiàn)象,因此花生蛋白的生物學(xué)效價(jià)比大豆高得多,被認(rèn)為是一種極具開發(fā)潛力的乳糖不耐癥消費(fèi)者的蛋白基料和牛乳等動(dòng)物奶類的代替品。而花生蛋白組成復(fù)雜,不同組分具有相似但不完全一致的氨基酸組成和序列,并且來自于不同品種的花生蛋白主要組分的含量比例、亞基組成或氨基酸構(gòu)成也有所差別,因此不同花生蛋白在食品體系中物化功能特性的表現(xiàn)不同[2-3]。在目前我國動(dòng)物性蛋白資源嚴(yán)重不足而難以滿足人們需要的情況下,開展對花生蛋白結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的研究,開發(fā)和利用花生蛋白資源,對于改善人們的膳食結(jié)構(gòu)具有極其重要的意義。

從更小結(jié)構(gòu)單元亞基角度研究蛋白結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)關(guān)系是目前研究熱點(diǎn),如在大豆蛋白亞基方面,日本京都大學(xué)Utsumi團(tuán)隊(duì)從90年代開展大豆蛋白及其組成亞基的氨基酸序列、重組表達(dá)、結(jié)構(gòu)表征到蛋白理化與功能性質(zhì)、品質(zhì)改良等,研究較為系統(tǒng)[4-9]。美國Nilsen團(tuán)隊(duì)則主要從基因角度研究大豆蛋白組成亞基氨基酸序列、基因性質(zhì)等[10-12]。國內(nèi)學(xué)者研究了大豆蛋白、主要組分及組成亞基的分離純化、結(jié)構(gòu)表征、熱聚集行為和界面、乳化性質(zhì)等[13-14]。

而目前對花生蛋白的基礎(chǔ)研究主要集中在花生過敏原結(jié)構(gòu)鑒定[15]、結(jié)構(gòu)變化[16]等,也有對花生濃縮蛋白[17]、花生分離蛋白[18]、花生蛋白組分及其不同比例[19-20]與功能性質(zhì)的關(guān)系,未深入到花生蛋白更小的組成單元亞基的角度上,研究花生蛋白特定亞基與性質(zhì)構(gòu)效關(guān)系,有助于從基因工程的角度來調(diào)控加工品質(zhì),成為花生蛋白加工的新趨勢。

1 花生蛋白組成

種子貯藏蛋白按溶解性分為鹽溶性蛋白、水溶性蛋白、酸或堿溶性蛋白、醇溶性谷蛋白[4]?;ㄉA藏蛋白中約10%為水溶性蛋白,其余90%為鹽溶蛋白,主要由花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅱ和伴花生球蛋白Ⅰ組成,而按沉降系數(shù)又分為14S(花生球蛋白)、7.8S(伴花生球蛋白Ⅰ)、2S(伴花生球蛋白Ⅱ)[3]。

2 花生蛋白亞基組成與結(jié)構(gòu)

2.1 亞基組成

花生蛋白亞基組成復(fù)雜,研究者對于花生球蛋白的研究結(jié)論不太一致。楊曉泉等[21]采用雙向聚丙烯酰胺電泳分析花生球蛋白由5個(gè)亞基組成,分別為2個(gè)酸性亞基(40.5 ku、pI 5.5,37.5 ku、pI 5.0)和3個(gè)堿性亞基(19.5 ku、pI 6.3,pI 7.0, pI 8.2)。采用高效液相色譜法對花生球蛋白亞基的數(shù)目、種類,以及花生球蛋白的種類(花生球蛋白Ⅰ、花生球蛋白Ⅱ)進(jìn)行分析,確定花生球蛋白和花生球蛋白Ⅱ均含有12個(gè)亞基,而花生球蛋白Ⅰ含有6個(gè)亞基,并且在除去SDS后,花生球蛋白Ⅰ的亞基可以重新聚合[22]。采用SDS-PAGE對170份花生品種蛋白組成進(jìn)行分析,得出花生球蛋白主要包括4個(gè)條帶(如圖1 中區(qū)域 2和區(qū)域 3),分子質(zhì)量為40.5、37.5、35.5、23.5 ku,伴花生球蛋白I主要包括3個(gè)條帶(如圖1 中區(qū)域 4),分子質(zhì)量為15.5、17、18ku,伴花生球蛋白Ⅱ主要包括1個(gè)條帶(如圖1 中區(qū)域 1),分子質(zhì)量為61 ku,并通過分析花生蛋白亞基相對含量變異性得出35.5ku亞基變異系數(shù)高達(dá)55%[23-24]。

注:區(qū)域1~區(qū)域4分別代表伴球蛋白Ⅱ,球蛋白酸性亞基,球蛋白堿性亞基,伴球蛋白Ⅰ。

圖1 花生蛋白亞基組成

2.2 亞基氨基酸組成

因?yàn)榘被岬牟町惪赡苡绊憗喕谀承├砘凸δ芴匦裕虼朔治霭被峤M成與類型有助于解釋理化和功能性質(zhì)差異。Yamada T等[25]研究得出花生球蛋白亞基S1,S2,S3有大量的精氨酸和谷氨酸,除了S2中未發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸殘基以及纈氨酸含量較S1高以外,其他氨基酸組成相似,而將純化花生球蛋白亞基混合后進(jìn)行透析,得出混合后蛋白是以六聚體形式存在,也有相同的亞基組成,這些六聚體與天然球蛋白相比有更強(qiáng)的耐熱性,其自組裝成六聚體后有更穩(wěn)定的四級結(jié)構(gòu)。

3 花生蛋白亞基純化

很多蛋白質(zhì)需要多亞基協(xié)同來完成復(fù)雜的生物功能,分離純化特定蛋白質(zhì)的亞基是研究其結(jié)構(gòu)與功能的前提,對于在亞基水平上深入研究花生蛋白功能機(jī)理,提高花生蛋白應(yīng)用范圍具有十分重要的意義。

3.1 色譜法

在眾多的蛋白質(zhì)分離方法中,色譜應(yīng)用最多、也最為廣泛,在絕大部分蛋白質(zhì)的純化過程中都作為精制的手段。色譜技術(shù)甚至能夠分離物化性質(zhì)差別很小的化合物。當(dāng)混合物中各組成部分的化學(xué)或物理性質(zhì)十分接近,而其他分離技術(shù)很難或根本無法將其分離時(shí),色譜技術(shù)愈加顯示出其優(yōu)越性。

3.1.1 離子交換層析法

離子交換色譜(ion exchange chromatography,IEC)以離子交換樹脂作為固定相,樹脂上具有固定離子基團(tuán)及可交換的離子基團(tuán),當(dāng)流動(dòng)相帶著組分電離生成的離子通過固定相時(shí),組分離子與樹脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆變換。在各類色譜技術(shù)中,離子交換色譜的使用頻率最高。

Koppelman S.J.等[26]采用離子交換層析法分離純化Arah 3亞基,收集到5個(gè)組分,得出Arah3由分子質(zhì)量為14~45 ku的一系列多肽(亞基)組成。離子交換色譜法在大豆蛋白亞基分離純化上應(yīng)用較多,如在還原條件下利用陰離子交換層析,分離純化得到的大豆球蛋白堿性亞基及酸性亞基共4種,產(chǎn)率最高可達(dá)23.93%,純度最高為92.00%[27],而通過離子交換層析和金屬螯合親和層析相結(jié)合的方法,可得純化β-伴大豆球蛋白α’亞基純度為85.62%,α亞基純度為96.71%,β亞基純度為96.08%[14]。也有研究者用DEAE-纖維素柱層析、Sephadex G-75 凝膠過濾、FPLC-Superdex 75 HR 10/30 柱層析等純化方法,得到了電泳純的藻紅藍(lán)蛋白α-亞基,光化學(xué)活性達(dá)93%[28]。

3.1.2 高效液相色譜法

采用反相高效液相色譜成功分離純化花生球蛋白各亞基,其中花生球蛋白和花生球蛋白II均含有相同亞基組成,而花生球蛋白I含有6個(gè)亞基[22]。Dong K等[29]采用反相高效液相色譜法從面包和小麥中純化出小麥蛋白高分子谷蛋白亞基,可依次洗脫出高分子質(zhì)量谷蛋白亞基,順序?yàn)?Ax>1Bx>1Dx>1By>1Dy。該方法優(yōu)點(diǎn)為分辨率高,可重復(fù)性強(qiáng),缺點(diǎn)為制備量少,因此一般適合于亞基組成鑒定。

3.2 等電聚焦法

等電聚焦法可用于分離純化等電點(diǎn)有一定差異的蛋白亞基。Yamada T等[22]采用在蔗糖梯度溶液(含有6 mol尿素和0.2 mol巰基乙醇)中進(jìn)行等電聚焦的方法分離出6種花生球蛋白亞基,這些亞基(S1到S6)等電點(diǎn)分別為5.8、6.0、6.3、7.1、7.4、8.3,在球蛋白中的所占比例為2.5∶2.2∶2.6∶1.6∶1.1∶1.0。黃峙等[30]采用液相等電聚焦分離純化藻藍(lán)亞基,經(jīng)2次聚焦得到高純度的活性α和β亞基。鄭樹貴等[31]利用β-巰基乙醇切斷大豆球蛋白酸性亞基和堿性亞基之間二硫鍵的基礎(chǔ)上,根據(jù)2類亞基等電點(diǎn)的差異分離純化大豆球蛋白亞基,利用這一方法分離得到的酸性亞基和堿性亞基純度分別為92.69%和80.76%,酸性亞基和堿性亞基的凈產(chǎn)率分別達(dá)31.40%和41.64%。該方法是一種簡單有效、價(jià)格低廉的酸性和堿性亞基分離方法。

3.3 硫酸銨沉淀法

硫酸銨沉淀法是利用蛋白質(zhì)鹽析效應(yīng)對花生蛋白組分進(jìn)行分離的一種方法。通過使用飽和度為0%~40%的硫酸銨使花生球蛋白從溶液中析出,在硫酸銨飽和度為60~80%時(shí),可以使伴花生球蛋白析出[32]。日本Utsumi團(tuán)隊(duì)采用該從亞基缺失大豆品種中純化出僅含有1種亞基的球蛋白A3B4以及A5A4B3亞基,純度大于90%[9]。

4 亞基對花生蛋白性質(zhì)的影響研究進(jìn)展

貯藏蛋白是氨基酸和肽類的主要來源。從很大程度上,蛋白能影響種子的營養(yǎng)和功能性。蛋白亞基結(jié)構(gòu)和含量會影響蛋白的凝膠性、乳化性、溶解性等加工性質(zhì),明確不同條件下亞基結(jié)構(gòu)和性質(zhì)變化有助于更好地探究蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究。

4.1 花生蛋白亞基與原料特性關(guān)系研究

不同基因型花生蛋白質(zhì)的亞基構(gòu)成不同,目前多集中在從品種改良角度研究花生蛋白亞基構(gòu)成與分布。通過對珍珠豆型花生?;?號莢果期花生各主要器官蛋白質(zhì)亞基組分分布特點(diǎn)及相關(guān)性分析,?;?號的根、葉、仁的蛋白質(zhì)中,除仁80 ku和仁的33 ku亞基與其他亞基無相關(guān)外,其他亞基間均有相關(guān)[33]。

4.2 花生蛋白亞基與加工品質(zhì)關(guān)系研究

4.2.1 亞基組成對蛋白功能性質(zhì)的影響

不同亞基組成的蛋白其功能性質(zhì)差異顯著,如花生球蛋白的熱穩(wěn)定性要好于伴花生球蛋白,且其變性協(xié)同性也好于伴花生球蛋白。通過選擇不同亞基組成品種比較蛋白功能性質(zhì)差異,并采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析花生品質(zhì)與蛋白溶解性、凝膠性關(guān)系,得出23.5 ku亞基與花生蛋白凝膠性呈顯著關(guān)系,37.5 ku亞基、23.5 ku亞基、15.5 ku亞基與花生蛋白溶解性呈顯著關(guān)系[24]。在大豆蛋白亞基研究中也有類似的結(jié)論,大豆蛋白α’和β亞基與質(zhì)構(gòu)特性的硬度、黏聚性呈極顯著負(fù)相關(guān),而α亞基與硬度呈極顯著負(fù)相關(guān)[14],通過比較不同亞基組成的7S蛋白凝膠性,得出凝膠硬度排序?yàn)槿笔Е痢?7S>缺失α,缺失α’大豆蛋白與7S相比更適宜制作豆腐[34]。與伴大豆球蛋白αα’亞基相比,β亞基有更高的熱穩(wěn)定性,其制備的黏結(jié)劑也顯示出更強(qiáng)的阻水性[37]。張吉民等[38]報(bào)道了燙漂處理花生后,缺失與不缺失36 ku的花生其種皮分離的程度差異顯著。

4.2.2 蛋白亞基結(jié)構(gòu)變化與性質(zhì)關(guān)系

不同處理手段會導(dǎo)致花生蛋白亞基不同程度的解離和聚集,從而表現(xiàn)出不同功能性質(zhì)。趙謀明等[39]報(bào)道花生分離蛋白亞基在常溫pH 2.5的條件下處理10 min后開始酸解,且隨著時(shí)間的延長高分子質(zhì)量的亞基逐漸減少;在離子強(qiáng)度0~0.1 mmol/L時(shí)酸解程度較大,當(dāng)離子強(qiáng)度大于0.2 mmol/L 時(shí),酸解作用被抑制。同樣,酸處理可促使大豆11S 亞基發(fā)生解離,在 pH 2.0和 pH 3.0 的條件下,大豆分離蛋白分子間正靜電排斥力較強(qiáng),大豆分離蛋白中亞基發(fā)生解離;在 pH 1.0 的條件下,大豆分離蛋白之間的靜電排斥力較弱,蛋白與蛋白之間發(fā)生了聚集,形成了聚集體,亞基未發(fā)生解離[40]。

超高壓處理對伴花生球蛋白Ⅱ結(jié)構(gòu)有顯著性影響,在200 MPa時(shí),伴花生球蛋白Ⅱ相對含量由原來的16.0%降為2.6%,條帶基本缺失[41],伴球蛋白凝膠硬度也急劇降低。對花生球蛋白進(jìn)行超高壓處理后,發(fā)現(xiàn)依靠微弱的非共價(jià)相互作用而形成的花生球蛋白多聚體離解成低聚體或單體,溶液變得均勻,互相摩擦阻力減小,導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶液剪切稀化現(xiàn)象[19]。

TG酶處理花生球蛋白和伴球蛋白后,花生球蛋白的酸性亞基容易發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),而堿性亞基不容易受到TG酶交聯(lián)的影響,而伴花生球蛋白比花生球蛋白更易在TG酶的催化下發(fā)生分子間或分子內(nèi)交聯(lián)反應(yīng),認(rèn)為是花生球蛋白穩(wěn)定、緊湊的空間構(gòu)象,使催化時(shí)TG酶較難與花生球蛋白的內(nèi)部分子相接觸,從而限制了亞基分子間的交聯(lián)反應(yīng)[42]。在Alcalse酶作用下,蛋白亞基敏感程度順序?yàn)樗嵝詠喕?39 ku和 42 ku)>花生伴球蛋白(66 ku)>花生球蛋白的堿性亞基(22 ku)[43]。

5 問題及展望

5.1 存在的問題

單個(gè)蛋白亞基或亞基對與花生蛋白凝膠性和溶解性存在著統(tǒng)計(jì)上的相關(guān)性,但用這種相關(guān)性結(jié)果預(yù)測花生蛋白品質(zhì)還存在很大的局限性。

5.1.1 花生蛋白組成亞基結(jié)構(gòu)與理化、功能性質(zhì)研究不完善?;ㄉ鞍讈喕姆N類較多,而且組合也較為復(fù)雜,花生球蛋白組成亞基分離純化已有初步研究,還不夠系統(tǒng),未進(jìn)行結(jié)構(gòu)以及后續(xù)性質(zhì)的系統(tǒng)研究,另外,對于花生蛋白中另一個(gè)主要成分伴球蛋白及亞基的研究還未涉及。

5.1.2 花生蛋白中不同亞基組成和含量、蛋白空間構(gòu)象均會對功能性產(chǎn)生影響,但是花生蛋白組成亞基結(jié)構(gòu)和性質(zhì)還不系統(tǒng),還未從更小結(jié)構(gòu)單元亞基角度上研究蛋白聚集行為和凝膠化過程。

5.1.3 加工中花生蛋白亞基結(jié)構(gòu)變化以及其他成分相互作用機(jī)制有待研究,如生產(chǎn)加工過程中蛋白亞基與多糖、油脂間的相互作用。

5.2 展望

食品原料結(jié)構(gòu)的改變會影響食品的物性、品質(zhì)和風(fēng)味,食品加工中經(jīng)常通過改變物料的結(jié)構(gòu)而研發(fā)新的工藝和產(chǎn)品。為了更好地探索不同花生蛋白組分與加工品質(zhì)的密切程度,以便準(zhǔn)確地把握和調(diào)控花生蛋白功能性質(zhì),有必要在以下幾方面深入開展研究。

5.2.1 建立花生蛋白亞基分離純化方法,系統(tǒng)研究各亞基氨基酸組成與類型,豐富花生蛋白結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

5.2.2 采用現(xiàn)代儀器分析手段,對加工處理中花生蛋白亞基結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行表征,明確花生蛋白亞基構(gòu)效關(guān)系。

5.2.3 結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)加工過程,明確在肉制品等加工真實(shí)體系中花生蛋白與油脂、多糖的相互作用及性質(zhì)變化。

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Research Progress on Peanut Protein Subunits Structure and Properties

Liu Li Shi Aimin Liu Hongzhi Hu Hui Wang Qiang

(Institute of food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Beijing 100193)

Peanut protein was a good vegetable protein with nutrition and functions, and have an extensive application prospect. Study on structure, function and properties of peanut protein has been always a research hotspot. In this paper, the peanut protein subunits and classification, structure and properties were summarizes, mainly the separation and purification of peanut protein subunits, structural features, functional properties, structure-activity relationships were provided in details. Finally the existing problems were pointed out and the development prospects were explored, in order to provide the theoretical foundation for the further study and development of peanut protein.

peanut protein, subunits, structure, property

TS201

A

1003-0174(2016)10-0151-06

國家科技支撐計(jì)劃(2012BAD29B03),國家科技創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-201X-IAPPST)

2015-03-19

劉麗,女,1985年出生,博士,糧食、油脂與植物蛋白工程

王強(qiáng),男,1965年出生,研究員,糧食、油脂與植物蛋白工程

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