宋永令 李江河 王若蘭

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院；糧食儲(chǔ)藏與安全教育部工程研究中心；糧食儲(chǔ)運(yùn)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450001)

谷朊粉糖基化改性對(duì)其結(jié)構(gòu)及溶解性的影響

宋永令 李江河 王若蘭

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院；糧食儲(chǔ)藏與安全教育部工程研究中心；糧食儲(chǔ)運(yùn)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450001)

本試驗(yàn)使用葡聚糖對(duì)谷朊粉進(jìn)行干法糖基化改性。研究了反應(yīng)溫度、時(shí)間以及糖與谷朊粉的配比對(duì)反應(yīng)接枝物溶解度的影響，優(yōu)化了制備最佳溶解度接枝物的工藝條件。同時(shí)研究了接枝物在不同pH以及溫度條件下的穩(wěn)定性。并通過(guò)傅里葉紅外光譜(FTIR)和電子顯微鏡(SEM)掃描方法證實(shí)了糖基化的發(fā)生及糖蛋白結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，在反應(yīng)溫度59 ℃，葡聚糖/谷朊粉(m/m)280%，反應(yīng)時(shí)間12 d(288 h)的條件下接枝物的溶解度最高，為1.923 mg/mL。在pH較高或較低以及谷朊粉等電點(diǎn)等情況下，接枝物的功能特性均處于較高水平，且具有良好的穩(wěn)定性。通過(guò)紅外掃描分析可知，改性后蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了很明顯的改變，其β折疊有所減少，α螺旋、轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的含量得到一定程度的增加，而糖基化改性對(duì)無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的影響不大，通過(guò)電鏡掃描分析可知，糖基化改性后蛋白質(zhì)的分子體積增大。

谷朊粉 葡聚糖 干法糖基化 溶解度

谷朊粉又稱(chēng)活性小麥面筋，作為小麥加工生產(chǎn)淀粉的副產(chǎn)物，每年都有大量的谷朊粉產(chǎn)生。由于其適中的價(jià)格，作為蛋白質(zhì)資源它常常與牛奶和大豆蛋白成為競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手[1]。目前，谷朊粉廣泛用于固體食物，但在液體食品(如飲料、奶制品)中的應(yīng)用是有限的。這主要是由于谷朊粉富含疏水性氨基酸(如谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中有較大的疏水區(qū)。因此，谷朊粉的溶解性、乳化性及發(fā)泡性不能滿(mǎn)足食品加工的需求。而溶解性是蛋白質(zhì)的重要性能之一，它可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的其他功能特性，如乳化性、凝膠性等。因此，改善谷朊粉的溶解特性，拓寬其應(yīng)用范圍具有重要的意義。

通過(guò)美拉德反應(yīng)制備蛋白-多糖復(fù)合物是改善蛋白質(zhì)功能特性的一項(xiàng)新方法，此方法具有反應(yīng)條件溫和、不添加其它化學(xué)試劑等優(yōu)點(diǎn)。目前對(duì)于蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物在提高蛋白質(zhì)的溶解性，乳化能力和乳化穩(wěn)定性等方面已有研究報(bào)道。布冠好等[2]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)糖基化修飾大豆蛋白后，其功能特性包括溶解性、乳化特性、凝膠特性、熱穩(wěn)定性及過(guò)敏原性均有所改善。趙艷娜等[3]的研究也發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白與乳糖結(jié)合后，其抗氧化能力有了大幅度的提高，甚至其還原能力還要高于VC和BHA。任仙娥等[4]分別采用3種不同的糖對(duì)谷朊粉進(jìn)行濕法糖基化改性。結(jié)果表明，改性后谷朊粉的溶解性、乳化性、表面疏水性均有不同程度的提高。

蛋白質(zhì)常用的糖基化方法主要有2種：干法和濕法。濕熱法較干熱法相比，條件相對(duì)簡(jiǎn)單，反應(yīng)速率快，主要用于蛋白質(zhì)與單糖或雙糖的接枝反應(yīng)，而與多糖進(jìn)行反應(yīng)的報(bào)道相對(duì)較少，有研究表明，多糖的加入較單糖與雙糖更能提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[5]。本研究采用干法來(lái)制備谷朊粉與葡聚糖的糖基化接枝產(chǎn)物，優(yōu)化制備具有較好溶解性的糖基化反應(yīng)條件，并對(duì)改性的機(jī)理進(jìn)行了初步探究，旨在拓寬谷朊粉改性的途徑，為植物蛋白的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)原料

谷朊粉：封丘縣華豐粉業(yè)有限公司；葡聚糖(AR)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要試驗(yàn)儀器及設(shè)備

TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Hitachi S-4300掃描電鏡 ：日本日立公司；WQF-510傅里葉紅外光譜儀：美國(guó)Thermo Nicolet公司；LGJ-10C型冷凍干燥機(jī)：北京市四環(huán)科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 接枝物制備[6]

稱(chēng)取一定量的谷朊粉，溶于pH為12的磷酸緩沖溶液中，使其濃度為10 mg/mL。以一定比例將谷朊粉與葡聚糖(m/m)進(jìn)行混合，振蕩直至溶解完全。對(duì)混合液進(jìn)行冷凍干燥，然后把得到的樣品放置在底部為飽和KBr溶液的密封干燥器內(nèi)(相對(duì)濕度為79%)，再分別放置在不同溫度的恒溫箱內(nèi)反應(yīng)，定時(shí)取樣。得到的反應(yīng)產(chǎn)物放入冰箱內(nèi)冷凍保存，待測(cè)。

1.3.2 溶解度測(cè)定[7-8]

a.雙縮脲試劑配制：取1.5 g CuSO4·5H2O和6.0 g酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6·4H2O)，用500 mL蒸餾水溶解，在攪拌下加入300 mL的10%NaOH (m/V)，用水稀釋到1 000 mL，貯存于塑料瓶中(或內(nèi)壁涂有石蠟的玻璃瓶中)。

b.蛋白質(zhì)溶解度的測(cè)定：配制1%(m/V)接枝物溶液，平衡30 min，在離心機(jī)上以3 000 r/min 離心10 min。靜置，取上清液1 mL于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，劇烈振蕩10 min，靜置放置30 min。取1個(gè)試管先加入1 mL蒸餾水，再加入4 mL雙縮脲作為空白試驗(yàn)，于540 nm處進(jìn)行比色測(cè)定，以牛血清蛋白的溶解度作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

c.牛血清蛋白溶解度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：配制濃度為20 mg/mL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別移取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于試管中，不足1.0 mL者用蒸餾水補(bǔ)齊至1.0 mL。再將各試管中加入4.0 mL雙縮脲試劑，然后用上述蛋白質(zhì)溶解度的測(cè)定方法分別測(cè)定其吸光值。以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，方程為y=0.049x+0.002，相關(guān)系數(shù)R2為0.998。

1.3.3 接枝產(chǎn)物在不同pH條件下的穩(wěn)定性

將制備的接枝物溶于去離子水，使其質(zhì)量濃度為5 mg/mL。然后用0.1 mol/L的HCl或NaOH溶液來(lái)調(diào)節(jié)溶液pH，使其值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，再測(cè)定接枝物的溶解度隨pH的變化。

1.3.4 接枝產(chǎn)物在不同溫度條件下的穩(wěn)定性

將接枝物溶于去離子水，使其濃度為5 mg/mL，然后將其放到水浴鍋中，使其溫度為30、40、50、60、70、80、90 ℃，再分別測(cè)定接枝物的溶解度隨溫度的變化。

1.3.5 傅里葉紅外光譜分析[9]

先將谷朊粉以及接枝物進(jìn)行充分干燥，再將樣品與KBr質(zhì)量比為1:300的比例進(jìn)行混合，充分碾磨，壓制成薄片。利用紅外光譜儀做全波段掃描(400～4 000 cm-1)，掃描12次。

1.3.6 掃描電鏡分析[10]

對(duì)谷朊粉以及接枝物進(jìn)行充分干燥，取少量的樣品粘貼到樣品臺(tái)的導(dǎo)電膠上，真空條件下在導(dǎo)電膠表面噴金，利用掃描電鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 干法糖基化反應(yīng)的單因素研究

以葡聚糖為糖基供體，分別對(duì)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、蛋白多糖比例進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)糖基化谷朊粉溶解性的高低初步確定反應(yīng)條件。

2.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)接枝物溶解度的影響

如圖1所示，糖基化谷朊粉溶解性隨反應(yīng)溫度升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，反應(yīng)溫度對(duì)糖基化產(chǎn)物具有顯著影響，當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃附近時(shí)接枝物的溶解度最高。糖基化是在蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈上引入糖基，一方面糖基的引入增加了蛋白質(zhì)中親水性基團(tuán)的數(shù)量，從而使蛋白質(zhì)達(dá)到更好的親水親油性的平衡，另一方面，糖基的引入可以阻礙蛋白質(zhì)分子聚集，從而提高蛋白溶解性。在一定范圍內(nèi)隨反應(yīng)溫度升高，谷朊粉與糖共價(jià)交聯(lián)速度加快，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，提高大分子表面活性，增加接枝物親水性，從而提高其溶解性；但當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)升高超過(guò)一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)開(kāi)始聚集變性，分子中部分親水性基團(tuán)被覆蓋，導(dǎo)致接枝物的溶解性開(kāi)始下降。張波等[11]在對(duì)糖基化對(duì)大豆蛋白乳化性研究結(jié)果中顯示溫度達(dá)到一定程度時(shí)，其復(fù)合物的乳化性也會(huì)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，此結(jié)果與本研究相一致。

圖1 不同反應(yīng)條件對(duì)接枝物溶解度的影響

2.1.2 葡聚糖/谷朊粉對(duì)接枝物溶解度的影響

蛋白和多糖的分子間共價(jià)結(jié)合是在一定的基團(tuán)間進(jìn)行的，適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)物配比不僅可以提高反應(yīng)的速度和最終的反應(yīng)程度，而且還可以減少副反應(yīng)(如焦糖化)的發(fā)生[11]。圖1顯示出，葡聚糖/谷朊粉對(duì)接枝物的溶解性的影響比較明顯。葡聚糖/谷朊粉(m/m)質(zhì)量比小于275%時(shí)，隨著葡聚糖的增加，接枝物的溶解性不斷增加，大于275%時(shí)，溶解性開(kāi)始下降。這可能是由于糖比例的增大提高了蛋白質(zhì)自由氨基與糖分子還原末端的羰基之間的接觸幾率，接枝度升高；然而，隨著糖含量的繼續(xù)增加，溶液的黏度增加和空間位阻效應(yīng)明顯，接枝度降低。王成波[12]在對(duì)玉米谷蛋白-葡萄糖復(fù)合物溶解性研究結(jié)果也顯示，谷蛋白/葡萄糖質(zhì)量比并不是越大越好，而是有一個(gè)最佳的值。那治國(guó)等[13]以米糠谷蛋白和葡聚糖為原料進(jìn)行干法糖基化改性，研究表明蛋白/糖為1∶5時(shí)，反應(yīng)得到的復(fù)合物的接枝度最高。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)接枝物溶解度的影響

如圖1曲線(xiàn)所示，反應(yīng)時(shí)間對(duì)枝結(jié)物溶解性的影響比較明顯。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，枝結(jié)物的溶解性逐漸增加，反應(yīng)時(shí)間為10 d時(shí)，接枝物的溶解性最好。但是反應(yīng)時(shí)間超過(guò)10 d之后，枝結(jié)物的溶解性開(kāi)始下降，這種變化趨勢(shì)與王成波[12]研究玉米谷蛋白-葡萄糖復(fù)合物溶解性的變化相一致。這是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，糖基化反應(yīng)比較充分，但是時(shí)間太長(zhǎng)美拉德反應(yīng)的一些中間產(chǎn)物可能會(huì)抑制該反應(yīng)的進(jìn)行，溶解性反而不是很好。

2.1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化制備最佳溶解度接枝物的工藝條件

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際生產(chǎn)要求選取合適的因素水平，并根據(jù)螺旋中心組合設(shè)計(jì)原理，采用軟件 Design Expert 7.1中Box-Behnken模型對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，各因素水平編碼表如表1所示。

表1 三因素三水平響應(yīng)面分析水平編碼表

接枝物溶解度的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。其中所得數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

利用分析軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出了葡聚糖和谷朊粉接枝物溶解度(Y)與反應(yīng)溫度(X1)、谷朊粉與葡聚糖配比(X2)、反應(yīng)時(shí)間(X3)的回歸方程。

表2 試驗(yàn)結(jié)果

接枝物：Y=+1.87-0.077×X1+0.10×X2+0.29×X3-0.10×X1×X2-0.14×X1×X3-0.035×X2×X3-0.40×X12-0.49×X22-0.44×X32

表3為所建回歸方程的方差分析。表中，葡聚糖與谷朊粉的接枝物溶解度回歸方程模型F檢驗(yàn)極顯著(P<0.01)，表示所建模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合良好，試驗(yàn)誤差較小。而所建模型的失擬P值均大于0.05，不顯著，表明其它因素對(duì)所建模型的影響較小，能充分反映各反應(yīng)因素之間的關(guān)系以及數(shù)據(jù)的情況。所以建立的模型可以對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確的分析和預(yù)測(cè)。

表3 葡聚糖接枝物溶解度方差分析

注：P<0.01 極顯著(**)；P<0.05 顯著(*)；P>0.05 不顯著。

圖2 葡聚糖接枝物溶解度兩因素交互響應(yīng)面分析

為了更直觀地表現(xiàn)2個(gè)因素同時(shí)對(duì)接枝物溶解性的交互作用，根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面立體圖，運(yùn)用SAS 軟件對(duì)二次回歸模型進(jìn)行規(guī)范分析，以任意2個(gè)因素為考查對(duì)象，剩余1個(gè)因素水平值取為0，進(jìn)行降維分析，得到二元二次方程繪出響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖形，如圖2所示。

由圖2可以看出，具有較好溶解度的葡聚糖與谷朊粉接枝產(chǎn)物的反應(yīng)時(shí)間集中在零水平后，而反應(yīng)溫度以及葡聚糖/谷朊粉集中在零水平附近。葡聚糖與谷朊粉反應(yīng)需要較高的溫度以及較長(zhǎng)的時(shí)間，這是由于葡聚糖的分子量太大造成的。從等高線(xiàn)圖中可以看出，反應(yīng)溫度與葡聚糖/谷朊粉，反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間的交互作用不顯著，反應(yīng)時(shí)間與葡聚糖/谷朊粉的交互作用顯著。同時(shí)，有利于葡聚糖與谷朊粉糖基化接枝物溶解度的反應(yīng)溫度范圍為：57～62 ℃；葡聚糖/谷朊粉范圍為：250%～310%；反應(yīng)時(shí)間范圍為：9～15 d。各因素對(duì)接枝物溶解度影響的大小順序?yàn)椋悍磻?yīng)時(shí)間﹥葡聚糖/谷朊粉﹥反應(yīng)溫度。

2.1.5 工藝優(yōu)化及試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面條件的優(yōu)化，得出葡聚糖與谷朊粉糖基化反應(yīng)的最佳條件為：反應(yīng)溫度59.13 ℃，葡聚糖/谷朊粉 (m/m)283.17%，反應(yīng)時(shí)間11.75 d，此時(shí)的溶解度為1.93 mg/mL。根據(jù)實(shí)際將條件設(shè)定為反應(yīng)溫度59 ℃，葡聚糖/谷朊粉(m/m)280%，反應(yīng)時(shí)間12 d(288 h)。

將優(yōu)化后設(shè)定的實(shí)際反應(yīng)條件做3組平行試驗(yàn)得到表4，從表中可以看出各糖接枝物溶解度的平均值與理論值之間的誤差均小于1%，說(shuō)明了優(yōu)化條件的準(zhǔn)確性。

表4 接枝物溶解度試驗(yàn)驗(yàn)證表

2.2 接枝產(chǎn)物在不同pH及溫度條件下溶解度的穩(wěn)定性

2.2.1 接枝產(chǎn)物在不同pH條件下溶解度的穩(wěn)定性

由圖3可知，在pH 3～12的范圍內(nèi)，干法糖基化復(fù)合物的溶解度都有提高，谷朊粉的等電點(diǎn)附近(pH 為7～8)時(shí)，谷朊粉的溶解度只有0.4 mg/mL左右，而糖基化接枝產(chǎn)物的溶解度均達(dá)到2.0 mg/mL以上，提高非常顯著。這主要是由于多糖鏈的引入，使得蛋白的親水基團(tuán)數(shù)量大大增加，蛋白質(zhì)的溶解度得以顯著改善；另一方面，隨著pH值的變化，接枝物溶解度變化比未糖基化谷朊粉溶解度的變化要相對(duì)平緩，這說(shuō)明糖基化改性能提高接枝物的抗酸堿能力。

圖3 pH對(duì)接枝物溶解度的影響

2.2.2 接枝產(chǎn)物在不同溫度條件下溶解度的穩(wěn)定性

溫度條件在一定范圍內(nèi)對(duì)谷朊粉的溶解性起到促進(jìn)作用，這是由于在適當(dāng)范圍內(nèi)升高溫度有助于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的展開(kāi)，提高蛋白質(zhì)分子的分散能力，從而提高其溶解度。但是隨著溫度的增加，蛋白質(zhì)分子過(guò)分展開(kāi)，大量疏水性氨基酸暴露出來(lái)，使蛋白質(zhì)的溶解度有下降的趨勢(shì)[14]。圖4為谷朊粉和接枝物溶解性隨溫度的變化?？梢钥闯?，谷朊粉在溫度達(dá)到60 ℃附近時(shí)，其溶解性開(kāi)始下降，說(shuō)明蛋白質(zhì)開(kāi)始變性，70 ℃附近時(shí)，蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重，蛋白質(zhì)分子間聚集沉淀導(dǎo)致其溶解度急劇下降。接枝物在70 ℃附近時(shí)，溶解度開(kāi)始出現(xiàn)下降，這說(shuō)明接枝物的變性溫度推遲，而且與未糖基化的谷朊粉相比，其溶解度下降比較緩慢，這可能是由于葡聚糖具有大分子的空間穩(wěn)定作用，使得蛋白分子受到阻礙，不易靠近而聚集沉淀，使其溶解度下降比較緩慢。這說(shuō)明糖鏈的接入提高了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。徐彩虹[15]研究發(fā)現(xiàn)，大豆 7S 球蛋白經(jīng)過(guò)糖基化后熱變性溫度得到了提高，此結(jié)論與本研究結(jié)果相一致。

圖4 溫度對(duì)接枝物溶解度的影響

2.3 紅外分析

傅里葉紅外光譜是常用的分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法之一，可以靈敏反映出肽鏈結(jié)構(gòu)的變化。圖5為通過(guò)傅立葉紅外掃描后可得到谷朊粉和接枝物的紅外圖譜。蛋白質(zhì)與多糖分子以共價(jià)鍵接枝后，一個(gè)典型的特征就是蛋白質(zhì)分子的羥基含量增加，在紅外光譜表現(xiàn)為羥基的特征吸收增強(qiáng)[16-17]。羥基的特征吸收峰有2個(gè)，分別是—OH伸縮振動(dòng)吸收峰(3 700～3 200 cm-1)和伸縮振動(dòng)吸收峰(1 100～1 000 cm-1)，接枝產(chǎn)物和未糖基化的谷朊粉在3 700～3 200 cm-1和1 100～1 000 cm-1處都有較強(qiáng)的吸收，但接枝物吸收強(qiáng)于谷朊粉，由此可以說(shuō)明由于葡聚糖糖鏈上存在多個(gè)羥基，其通過(guò)共價(jià)鍵接入谷朊粉肽鏈上后，增加了肽鏈中羥基數(shù)量。

圖5 谷朊粉及葡聚糖接枝物紅外圖

蛋白質(zhì)的紅外光譜圖譜有幾組特征吸收譜帶：酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶，其中能夠反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的為酰胺Ⅰ區(qū)1 600～1 700 cm-1范圍[18]。其中β折疊的吸收峰處于1 600～1 640 cm-1之間，而無(wú)規(guī)則卷曲的吸收峰在1 640～1 650 cm-1之間，處于1 650～1 670 cm-1的吸收峰代表為α 螺旋的存在，1 680～1 685 cm-1之間的吸收峰可以反映出轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。對(duì)所得的光譜圖利用軟件PeakFit依次進(jìn)行去卷積、分峰、擬合處理，得到酰胺Ⅰ帶的紅外擬合曲線(xiàn)圖6。再根據(jù)不同峰所反映出的結(jié)構(gòu)，計(jì)算峰面積，得到各結(jié)構(gòu)所占蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的比重如表5所示。

圖6 谷朊粉及接枝物酰胺Ⅰ帶紅外擬合曲線(xiàn)

結(jié)構(gòu)類(lèi)型二級(jí)結(jié)構(gòu)中的占比/%谷朊粉葡聚糖接枝物β折疊結(jié)構(gòu)37.9433.03無(wú)規(guī)則卷曲14.2713.07α螺旋結(jié)構(gòu)25.7027.73轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)22.0926.17

由表5可以看出，經(jīng)過(guò)干法糖基化改性以后，接枝物的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β折疊結(jié)構(gòu)含量減少，α螺旋結(jié)構(gòu)含量少量上升，蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量也有一定的提高，同時(shí)對(duì)比蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲比例，發(fā)現(xiàn)改性前后差別不大?？傮w來(lái)說(shuō)，糖基化改性后，蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)增加。這一研究結(jié)果與布冠好等[19]研究大豆蛋白-葡萄糖復(fù)合物的抗原性及結(jié)構(gòu)特性時(shí)所得結(jié)論一致。理論上蛋白質(zhì)在加熱過(guò)程中，蛋白質(zhì)肽鏈?zhǔn)艿綗嵴袷?，保持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵主要是氫鍵被破壞，分子內(nèi)部有序排列被解除，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的展開(kāi)，會(huì)使蛋白質(zhì)的無(wú)序結(jié)構(gòu)增加。但是糖基化反應(yīng)條件溫和，溫度較低，并沒(méi)有使蛋白質(zhì)肽鏈?zhǔn)艿竭^(guò)分的熱振蕩，無(wú)規(guī)則卷曲比例增加并不明顯。同時(shí)，從圖6酰胺Ⅰ帶的紅外擬合曲線(xiàn)圖可以看出，接枝物與谷朊粉相比，在1 600～1 640 cm-1區(qū)間，在相同波數(shù)時(shí)，接枝物的吸收峰普遍高于谷朊粉，而在1 650～1 685 cm-1區(qū)間，在相同波數(shù)時(shí)，接枝物的吸收峰則普遍比谷朊粉低，這說(shuō)明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的 β-折疊有部分轉(zhuǎn)化為 α-螺旋結(jié)構(gòu)或轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。徐彩虹[15]在研究大豆球蛋白糖基化枝接改性及其熱聚集行為時(shí)，得出相似的結(jié)論。

2.4 電鏡掃描

經(jīng)掃描電鏡對(duì)接枝物以及谷朊粉進(jìn)行掃描后的到圖7。

a葡聚糖接枝物 b谷朊粉

圖7 谷朊粉及接枝物的掃描電鏡圖

圖7可以看出，谷朊粉和干法接枝物的微觀結(jié)構(gòu)明顯不同。通過(guò)同等倍數(shù)放大后可以看出，谷朊粉的微觀結(jié)構(gòu)為小粒狀，分子之間結(jié)合程度低，分子體積較小。對(duì)比谷朊粉而言，接枝物的分子間發(fā)生大量的結(jié)合聚集現(xiàn)象，接枝物呈大塊狀。這也說(shuō)明了接枝反應(yīng)后，葡聚糖與谷朊粉相結(jié)合，從而將谷朊粉分子團(tuán)團(tuán)圍住，形成了體積更大的接枝物分子。這與管軍軍等[20]以及那治國(guó)等[13]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、谷朊粉/葡聚糖的質(zhì)量比均對(duì)制備接枝物的溶解性影響顯著(P<0.01)。

研究了反應(yīng)溫度、時(shí)間以及糖與谷朊粉的配比對(duì)反應(yīng)接枝物溶解度的影響，并利用Box-Behnken模型對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，方差分析表明所建模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合良好，試驗(yàn)誤差較小。通過(guò)對(duì)模型的驗(yàn)證，最終獲得溶解性最好的反應(yīng)條件為：溫度為59 ℃，葡聚糖/谷朊粉為280%，反應(yīng)時(shí)間為12 d(288 h)，此時(shí)溶解度為1.923 mg/mL。

考察了糖基化接枝物在不同pH值和不同溫度條件下穩(wěn)定性，研究結(jié)果顯示，谷朊粉等電點(diǎn)、谷朊粉溶解性下降迅速，而接枝物的下降相對(duì)緩慢；隨著溫度的升高，接枝物表現(xiàn)出很好的熱穩(wěn)定性。

紅外光譜分析一方面證明了美拉德反應(yīng)的發(fā)生，另一方面表明糖鏈的加入使蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，改變谷朊粉的溶解特性。掃描電鏡顯示，谷朊粉和接枝物的微觀結(jié)構(gòu)明顯不同，谷朊粉呈現(xiàn)小粒狀，而接枝物由于多糖的引入，使得蛋白分子結(jié)構(gòu)變大，呈大塊狀。

[1]Kong X, Zhou H, Qian H. Enzymatic hydrolysis of wheat gluten by proteases and properties of the resulting hydrolysates[J]. Food Chemistry, 2007, 102：759-763

[2]布冠好, 劉伯業(yè), 陳復(fù)生, 等. 糖基化修飾對(duì)大豆蛋白功能特性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械, 2011(4): 77-80

Bu Guanhao, Liu Boye, Chen Fusheng, et al. Effect of glycosylation modification on the functional properties of soy protein[J]. Agricultural Machinery, 2011, 4: 77-80

[3]趙艷娜, 辛巖, 姜瞻梅. 乳清蛋白糖基化反應(yīng)特性及抗氧化性的研究[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2010, 38(8): 18-21

Zhao Yanna, Xin Yan, Jiang Zhanmei. Study on characteristics of glycosylation of whey protein and antioxidant property[J]. China Dairy Industry, 2010, 38(8): 18-21

[4]任仙娥, 楊鋒, 曹燕, 等. 糖基化改性對(duì)谷朊粉功能性質(zhì)的影響[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2013(4): 30-33

Ren Xiane, Yang Feng, Cao Yan, et al. Effect of glycosylation modification on the functional properties of wheat gluten [J]. Food and Feed Industry, 2013, 4: 30-33

[5]Sangnark A, Noomhorn A. Effect of pariticle sizes on function properties of dietary fibre prepared from sugarcane bagasse[J]. Food Chemistry, 2003, 80:221

[6]Lertittikula W, Benjakula S, Tanakab M. Characteristics and an-tioxidative activity of Maillard reaction products from a porcine plasma protein-glucose model system as influenced by pH[J]. Food Chemistry, 2007, 100: 669-677

[7]張德欣. 鹽酸處理對(duì)谷朊粉理化性質(zhì)改良的研究[J]. 食品與機(jī)械, 2012, 28(2): 23-26

Zhang Dexin. Studies on quality improvement in wheat gluten’sphysical and chemical propertiesby hydrochloric acid treatment[J]. Food and Machinery, 2012, 28(2): 23-26

[8]李寧. 幾種蛋白質(zhì)測(cè)定方法的比較[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2006, 26(2): 132-134

Li Ning. The comparison on various methods for determing different proteins[J]. Journal of Shanxi Agricultural University (Natural Science Edition) , 2006, 26(2): 132-134

[9]謝安建, 沈玉華. 糖蛋白/膽紅素鈣水溶性復(fù)合物的形成及光譜研究[J]. 無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 4: 361-365

Xie Anjian, Shen YuHua. Study on the formation and spectra of soluble glycoprotein/calcium bilirubinate complexes [J]. Chinese Journal of Inorganic Chemistry, 2003, 4: 361-365

[10]王國(guó)峰. 基于ATRP反應(yīng)的水凝膠微球的制備與表征 [D]. 鄭州: 河南工業(yè)大學(xué), 2014

Wang Guofeng. Preparation and characterization of hydrogel microspheres based on ATRP reaction[D]. Zhengzhou：Henan University of Technology, 2014

[11]張波，遲玉杰. β-伴大豆球蛋白糖基化改性對(duì)其乳化性影響的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2012, 33(22):28-93

Zhang Bo，Chi Yujie. The effect of β-conglycinin glycosylation with xanthan gum on emulsifying properties[J]. Food Industry Science and Technology，2012, 33(22):28-93

[12]王成波. 玉米谷蛋白的糖基化改性研究[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012(7)：110-115

Wang Chengbo. Study on glycosylation of glutelin from waxy maize[J].Heilongjiang Agricultural Science, 2012(7)：110-115

[13]那治國(guó), 馬永強(qiáng), 韓春然, 等. 米糠谷蛋白干法糖基化改性的研究[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(2):52-57

Na Zhiguo, Ma Yongqiang, Han Chunran, et al. Dry heating for glycosylation modification of rice bran glutelin[J]. Food Science, 2013, 34(2):52-57

[14]趙瑤興, 孫祥玉. 有機(jī)分子結(jié)構(gòu)光譜鑒定[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2003

Zhao Yaoxing, Sun Xiangyu. Spectral identification of organic molecular structure[M].Beijing: Science Press, 2003

[15]徐彩虹. 大豆球蛋白糖基化枝接改性及其熱聚集行為研究 [D]. 廣州：華南理工大學(xué), 2010

Xu Caihong. Research on the glycosylation and thermal aggregation of soybean globulin-polysaccharide[D]. Guangzhou:South China University of Technology, 2010

[16]解思曉, 鹿芹芹, 吳子慶, 等. 高溫度影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的研究現(xiàn)狀[J]. 生物技術(shù)通訊, 2012, 23(3): 461-464

Xie Sixiao, Lu Qinqin, Wu Ziqing, et al. Progress of temperature effect on protein crystallization[J]. Letters in Biotechnology, 2012, 23(3): 461-464

[17]榮國(guó)斌, 蘇克曼. 大學(xué)有機(jī)化學(xué)[M]. 上海: 華東理工大學(xué)出版社, 2000

Rong Guobing, Su Keman. University organic chemistry[M].Shanghai: East China University of Science and Technology Press, 2000

[18]李娟. 殼聚糖-醋酸改性對(duì)小麥面筋蛋白性質(zhì)影響的研究 [D]. 鄭州: 河南工業(yè)大學(xué), 2012

Li Juan. Study of the effect of properties of the wheat gluten modified by chitosan-acetic acid[D].Zhengzhou: Henan University of Technology, 2012

[19]布冠好, 朱婷偉, 陳復(fù)生. 大豆蛋白-葡萄糖復(fù)合物的抗原性及結(jié)構(gòu)特性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014, 30(11)：28-33

Bu Guanhao, Zhu Tingwei, Chen Fusheng. Antigenicity and structural properties of soybean protein-glucose conjugates [J]. Modern Food Science & Technology, 2014, 30(11)：28-33

[20]管軍軍, 裘愛(ài)泳, 劉曉亞. 微波合成大豆蛋白一糖接枝物結(jié)構(gòu)表征[J]. 食品科技，2010, 35(2): 120-126

Guan Junjun, Qiu Aiyong, Liu Xiaoya. Structural characterization of soy protein-saccharide grafts synthesized by microwave[J]. Food Science and Technology, 2010, 35(2): 120-126.

Structure and Solubility of Gluten-Polysaccharide Conjugates

Song Yongling Li Jianghe Wang Ruolan

(School of Food Science and Technology Engineering Research Center of Grain Storage and Security of Ministry of Education Grain Storage and Logistics National Engineering Laboratory, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001)

In this experiment, the modification of gluten via dry-heated Maillard reaction with dextran was studied. The effects of reaction temperature, time and the ratio of sugar to gluten on the solubility of the protein-polysaccharide conjugates were studied, and the process conditions for the preparation of glycoprotein with optimum solubility were optimized. The stability of the protein-polysaccharide conjugates at different pH and temperature was also studied. The glycosylation actions and the structure changes of the protein-polysaccharide conjugates were confirmed by infrared spectroscopy (FTIR) and scanning electron microscopy (SEM). The results showed that the solubility of the protein-polysaccharide conjugates was highest of 1.923 mg/mL under the reaction condition of the temperature 59 ℃, time 12 d(288 h) and dextran/gluten(m/m)280%. The functional properties of the modified protein were in a high level, and had good stability in the case of pH higher or lower, as well as the isoelectric point of gluten. The infrared spectroscopy showed the structure of the modified protein had a very obvious change, including the decrease of β-fold, the increase of α-helix and β-turn structure at a certain degree. But the glycosylation had little effect on the Irregular coiled structure. The scanning electron microscopy showed that the volume of modified protein was increased.

gluten, Dextran, dry glycosylation, solubility

TS21

A

1003-0174(2016)12-0125-08

河南工業(yè)大學(xué)校高層次人才基金(2012BS023)，河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(15A550001)

2015-05-22

宋永令，女，1981年出生，講師，糧食儲(chǔ)藏理論與技術(shù)