江波 倪海峰 周珍 李勇 黃光武

Parkin基因甲基化在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用

江波 倪海峰 周珍 李勇 黃光武

目的 探討Parkin基因甲基化在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 應(yīng)用甲基化特異性PCR技術(shù)對5個鼻咽癌細(xì)胞株（CNE1、CNE2、TW03、HONE1、C666）和1個正常鼻咽上皮細(xì)胞株（NP69）、54例鼻咽癌組織和16例正常鼻咽上皮組織的Parkin基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，并分析鼻咽癌組織中Parkin基因甲基化與臨床特征的關(guān)系；應(yīng)用RT-PCR檢測加入甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5-氮-2-脫氧胞苷）后CNE1、CNE2中Parkin基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，分析去甲基化對Parkin基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。結(jié)果1個正常鼻咽上皮細(xì)胞株和16例正常鼻咽上皮組織中均未檢測到Parkin基因甲基化；5個鼻咽癌細(xì)胞株和54例鼻咽癌組織中Parkin基因甲基化頻率分別為60.00%和62.96%；54例鼻咽癌患者中Parkin基因甲基化狀態(tài)與臨床因素均無關(guān)（均P＞0.05）。經(jīng)過5-氮-2-脫氧胞苷處理后，Parkin基因在CNE1、CNE2中轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加，分別從0提高至3.65和2.15。結(jié)論 鼻咽癌中Parkin基因甲基化與轉(zhuǎn)錄表達(dá)密切相關(guān)，是基因表達(dá)調(diào)節(jié)的一種重要方式；可能成為鼻咽癌早期分子生物學(xué)輔助診斷的標(biāo)志物和去甲基化基因治療的靶點(diǎn)。

Parkin基因 鼻咽癌 甲基化 5-氮-2-脫氧胞苷

【 Abstract】 Objective To investigate the methylation of Parkin gene promoter in nasopharyngeal carcinoma(NPC). Methods The methylation-specific PCR(MSP)was used to detect methylation status of Parkin gene promoter in 54 specimens of NPC tissues and 16 specimens of normal nasopharyngeal epithelia(NNE)tissues,as well as in 5 NPC cell lines(CNE1,CNE2, TW03,HONE1,C666)and 1 normal nasopharyngeal epithelia cell line(NP69).The expressionof Parkin mRNA in NPC cell lines CNE1 and CNE2 were analyzed before and after treatment with the methyltransferase inhibitor 5-aza-2-deoxycytidine.In addition,alterations of mRNA expression of Parkin gene were detected by semi-quantitative reverse transcription PCR (RT-PCR).The relationship between promoter methylation and clinicalfeatures,demethylation and expression of Parkin mRNA was analyzed.Results Methylation ofParkin promoter was detected in 60.00%(3/5)NPC celllines and 62.96%(34/54)NPC tissue specimens,but not in NNE tissues and NP69 cells.There was no significant association between Parkin promoter methylation andclinical features of NPC(P＞0.05).After 5-aza-2-deoxycytidine treatment,the expression of Parkin mRNA was increased in CNE1 and CNE2 cells. Conclusion The close correlation between Parkin methylation and low mRNA expression suggests that methylation might be associated with the regulation of gene expression.Parkin gene promoter methylation has high specificity in distinguishing cancers from normal tissues,which indicates methylation of Parkin promoter may provide a novel molecular target for diagnosis and treatment ofNPC.

研究證實(shí)大多數(shù)癌癥中Parkin基因主要表現(xiàn)為雜合性缺失，而甲基化鮮有報(bào)道；目前僅見在急性淋巴細(xì)胞性和慢性粒細(xì)胞性白血病中Parkin基因甲基化的報(bào)道。本研究采用甲基化特異性PCR對鼻咽癌組織及其細(xì)胞株、正常鼻咽上皮組織及其細(xì)胞株的Parkin基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，以探討Parkin基因甲基化在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 對象和方法

1.1對象 16例正常鼻咽上皮組織標(biāo)本取自鼻竇內(nèi)鏡手術(shù)和扁桃體切除術(shù)患者，54例鼻咽癌組織取自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和杭州市第一人民醫(yī)院2008—2011年耳鼻咽喉科就診的新發(fā)鼻咽癌患者，均為新鮮活檢病理組織。切除組織后立即凍存于－80℃冰箱內(nèi)備用。1個永生化正常鼻咽上皮細(xì)胞株（NP69）由香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室George Tsao教授惠贈。取1位健康青年外周血淋巴細(xì)胞作甲基化、非甲基化的特異性PCR陽性對照標(biāo)本。本實(shí)驗(yàn)通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，采集標(biāo)本前與患者或志愿者簽訂知情同意書。

1.2 主要試劑 Trizol試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶為美國Promeag公司產(chǎn)品；DNA的亞硫酸氫鹽修飾所需試劑（Hydroquinone、低熔點(diǎn)瓊脂糖、礦物油、Sodium metabisulphite）和5-氮-2-脫氧胞苷均為美國Sigma公司產(chǎn)品；甲基化酶試劑盒為新英格蘭BioLabs公司產(chǎn)品；TaKaRa Ex Taq耐熱性DNA聚合酶、二甲基亞砜、Marker均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用經(jīng)典的蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提、乙醇沉淀的方法，分別從組織、細(xì)胞株和外周血淋巴細(xì)胞中提取DNA。用紫外分光光度儀檢測A260、A280，計(jì)算濃度、A260/A280。

1.2.2 外周血淋巴細(xì)胞DNA的CpG甲基化酶修飾 取1μgDNA、2μl 10×反應(yīng)緩沖液、0.1μl 200×S-腺苷甲硫氨酸、1U CpG甲基化酶，加水至20μl，37℃溫育1h；完成以上步驟后進(jìn)一步作DNA的亞硫酸氫鹽修飾，作為甲基化陽性對照。

1.2.3 DNA的亞硫酸氫鹽修飾 將組織、細(xì)胞株和外周血淋巴細(xì)胞中提取的DNA，經(jīng)CpG甲基化酶處理的DNA分別作亞硫酸氫鹽修飾，實(shí)驗(yàn)步驟參照相關(guān)文獻(xiàn)[1]進(jìn)行。外周血淋巴細(xì)胞中提取的DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后，作為非甲基化陽性對照。

1.2.4 甲基化特異性PCR Parkin基因甲基化、非甲基化特異性PCR引物序列，見表1。甲基化特異性PCR程序（197bp）：95℃預(yù)變性3min，94℃30s、63℃20s、72℃20s 37個循環(huán)，最后延伸72℃5min。非甲基化特異性PCR程序（197bp）：95℃預(yù)變性3min，94℃30s、61℃20s、72℃20s 37個循環(huán)，最后延伸72℃5min。2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。正常外周血淋巴細(xì)胞中提取的DNA作為非甲基化陽性對照，CpG甲基化酶修飾后正常外周血淋巴細(xì)胞DNA模板作為甲基化陽性對照，去離子水作為空白對照。陽性（甲基化）標(biāo)本：僅有甲基化引物特異性擴(kuò)增產(chǎn)物或甲基化和非甲基化引物均有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；陰性（非甲基化）標(biāo)本：僅有非甲基化引物特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 Parkin基因甲基化及非甲基化特異性PCR引物序列

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)和去甲基化處理 在6孔板中，以每孔2×105個細(xì)胞的濃度接種CNE1、CNE2細(xì)胞，次日更換為含10μmol/L 5-氮-2-脫氧胞苷的完全I(xiàn)MDM培養(yǎng)基，每24h更換含藥培養(yǎng)液，96h后提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用RT-PCR檢測Parkin基因mRNA表達(dá)。用含10μmol/L二甲基亞砜的完全I(xiàn)MDM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)液處理的細(xì)胞作為對照組。

1.2.6 總RNA提取和第一鏈cDNA的合成 采用Trizol試劑一步法提取細(xì)胞和組織總RNA，用紫外分光光度儀檢測A260、A280，計(jì)算濃度、A260/A280。反轉(zhuǎn)錄采用Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)酶，按照操作手冊進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。

1.2.7 RT-PCR Parkin基因RT-PCR引物序列，見表2。RT-PCR程序經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確立，循環(huán)數(shù)均在指數(shù)擴(kuò)增期，具體如下：Parkin（456bp）：95℃預(yù)變性3min，94℃30s、57℃30s、72℃30s 30個循環(huán)，最后72℃延伸5min；β-actin（621bp）：95℃預(yù)變性3min，94℃30s、58℃30s、72℃30s 28個循環(huán)，最后72℃延伸5min。正常鼻咽上皮組織作陽性對照，去離子水作空白對照。2%的瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用Quantity One軟件分析各條帶的灰度值，各組織樣本Parkin基因片段與相應(yīng)模板β-actin片段灰度值的比值，即表達(dá)量。

表2 RT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或四格表資料的Fisher確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 人群基線資料 54例鼻咽癌患者中，男39例，女15例；年齡20～78歲，中位年齡45.8歲；參照國際抗癌聯(lián)盟2010年第7版臨床TNM分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期15例，Ⅲ期23例，Ⅳa期12例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移0例；M0期54例，M1期0例；病理診斷參照2005年WHO分型：非角化性癌48例，角化型鱗狀細(xì)胞癌6例，基底細(xì)胞樣鱗狀細(xì)胞癌0例。16例正常鼻咽上皮組織健康志愿者中，男11例，女5例；年齡18～68歲，中位年齡42.5歲。兩組性別、年齡方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 Parkin基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài) 5個鼻咽癌細(xì)胞株（CNE1、CNE2、TW03、HONE1、C666）和54例鼻咽癌組織中Parkin甲基化頻率分別為60.00%（3/5）和62.96%（34/54）；1株正常鼻咽上皮細(xì)胞株（NP69）和16例正常鼻咽上皮組織中均未檢測到甲基化，見圖1。

圖1 Parkin基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的電泳圖（M：甲基化特異性PCR；U：非甲基化特異性PCR；MK：Marker；CNE1、CNE2、TWO3、HONE1、C666：鼻咽癌細(xì)胞株；NP69：正常鼻咽上皮細(xì)胞株；T1、T2、T3：鼻咽癌組織；N1、N2、N3：正常鼻咽上皮組織；PC：陽性對照；H2O：陰性對照）

2.3 Parkin基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床特征的關(guān)系 不同年齡、性別、T分期、N分期、TNM分期、病理類型的鼻咽癌患者Parkin基因啟動子區(qū)甲基化頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

表3 54例鼻咽癌患者Parkin基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床特征的關(guān)系

2.4 5-氮-2-脫氧胞苷對Parkin基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響 對Parkin基因甲基化的2個鼻咽癌細(xì)胞株（CNE1、CNE2）應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5-氮-2-脫氧胞苷）進(jìn)行去甲基化處理，采用RT-PCR檢測去甲基化處理前后Parkin基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)去甲基化處理后Parkin基因的mRNA表達(dá)明顯提高，CNE1轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平從0提高至3.65，CNE2從0提高至2.15，見圖2。

圖2 5-氮-2-脫氧胞苷對鼻咽癌細(xì)胞株（CNE1、CNE2）Parkin轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響的電泳圖（5-aza-dc:5-氮-2-脫氮肥苷，-：二甲基亞砜；+：5-氮-2-脫氧胞苷；NNE：正常鼻咽上皮組織，即陽性對照；H2O：陰性對照）

3 討論

啟動子區(qū)異常甲基化是腫瘤抑制基因滅活的基本機(jī)制。經(jīng)典的癌基因、抑癌基因的遺傳學(xué)改變在鼻咽癌中較為罕見，鼻咽癌是一種高頻率的基因CpG島甲基化的腫瘤，DNA甲基化引起的抑癌基因失活在鼻咽癌的抑癌基因改變中起著重要作用，涉及細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡和腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的眾多基因[2]。Parkin基因最初發(fā)現(xiàn)是帕金森病的致病基因，Parkin基因參與蛋白質(zhì)的泛素化過程，其功能缺陷誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元選擇性死亡，導(dǎo)致帕金森病。近年來研究證實(shí)Parkin基因與乳腺癌[3]、卵巢癌[4]、膠質(zhì)細(xì)胞瘤[5]、腎癌[6]和白血病[7]等多種腫瘤關(guān)系密切，但在腫瘤中的具體作用尚未明確。Tay等[3]研究發(fā)現(xiàn)在Parkin基因缺失的乳腺癌細(xì)胞系中加入外源性Parkin蛋白，會導(dǎo)致細(xì)胞增殖和遷移能力減弱，主要作用機(jī)制是通過增強(qiáng)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶6表達(dá)來抑制乳腺細(xì)胞增殖，使細(xì)胞停留在G1期，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤抑制功能。Lee等[8]研究發(fā)現(xiàn)Parkin基因可調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂，其缺陷會引起細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示Parkin基因甲基化只發(fā)生在鼻咽癌中，具有腫瘤特異性，且其甲基化狀態(tài)與其他臨床因素?zé)o關(guān)，提示Parkin基因啟動子區(qū)甲基化可能在鼻咽細(xì)胞癌變早期即已發(fā)生，參與了鼻咽癌進(jìn)展的全過程，或許能成為早期分子生物學(xué)診斷的標(biāo)志物。Agirre等[7]報(bào)道Parkin基因甲基化與FAB分型、完全緩解率、復(fù)發(fā)率、死亡率、11年無瘤生存率和12年總存活數(shù)等無關(guān)，與本研究結(jié)果類似。此外，Agirre等[7]研究證實(shí)在26%的急性成人或兒童淋巴細(xì)胞性白血病患者中可檢測到Parkin基因甲基化，且Parkin基因甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，表明轉(zhuǎn)錄表達(dá)受甲基化調(diào)控；而本研究結(jié)果顯示鼻咽癌中Parkin基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平受DNA甲基化調(diào)控，可見Parkin基因甲基化在急性淋巴細(xì)胞性白血病與鼻咽癌中作用相似。

DNA甲基化是一個可逆的過程，去甲基化藥物可以逆轉(zhuǎn)因甲基化失活的腫瘤抑制基因?qū)?xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程[9]。本研究應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5-氮-2-脫氧胞苷）對CNE1、CNE2去甲基化處理后，Parkin基因的mRNA表達(dá)明顯提高，提示DNA的甲基化調(diào)節(jié)是鼻咽癌中Parkin基因表達(dá)調(diào)節(jié)的重要方式，有別于多數(shù)癌癥中等位基因缺失是Parkin基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制[10-12]。此外，由于Parkin基因產(chǎn)物具有抑制細(xì)胞分裂與增殖、阻止腫瘤形成的作用，若應(yīng)用去甲基化藥物重新激活其表達(dá)就能抑制鼻咽細(xì)胞癌變，則具有潛在的基因治療價(jià)值。

綜上所述，鼻咽癌中Parkin基因甲基化是其基因表達(dá)調(diào)節(jié)的一種重要方式，Parkin基因甲基化在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，可能成為鼻咽癌早期分子生物學(xué)診斷的標(biāo)志物和去甲基化基因治療的靶點(diǎn)，有待進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。

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（本文編輯：陳丹）

《浙江醫(yī)學(xué)》對醫(yī)學(xué)論文中有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物描述的要求

在醫(yī)學(xué)論文的描述中，凡涉及實(shí)驗(yàn)動物者，在描述中應(yīng)符合以下要求：（1）品種、品系描述清楚，（2）強(qiáng)調(diào)來源，（3）遺傳背景，（4）微生物學(xué)質(zhì)量，（5）明確等級，（6）明確飼養(yǎng)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)環(huán)境，（7）明確性別，（8）有無質(zhì)量合格證，（9）有對飼養(yǎng)的描述（如飼料型、營養(yǎng)水平、照明方式、溫度、溫度要求），（10）所有動物數(shù)量準(zhǔn)確，（11）詳細(xì)描述動物的健康狀況，（12）對動物實(shí)驗(yàn)的處理方式有單獨(dú)清楚的交代，（13）全部有對照，部分可采用雙因素方差分析。

本刊編輯部

Methylation of Parkin gene promoter in nasopharyngeal carcinoma

JIANG Bo,NI Haifeng,ZHOU Zhen,et al.Department of Otolaryngology and Head/Neck Surgery,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China

Parkin gene Nasopharyngealcarcinoma Methylation 5-aza-2-deoxycytidine

2016-01-07）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般項(xiàng)目（2011KYA127）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生骨干平臺項(xiàng)目（2012RCB038）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（江波、倪海峰、周珍、李勇）；廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（黃光武）

倪海峰，E-mail：nihaifeng138@163.com