王漢斌 華春珍 李偉 尚世強

2010－2013年兒童呼吸道標本肺炎衣原體DNA檢測分析

王漢斌 華春珍 李偉 尚世強

肺炎是我國5歲以下兒童死亡的主要原因之一[1]，而社區(qū)獲得性肺炎（CAP）中約有10%由肺炎衣原體（CP）感染所致[2]。近年來，CP感染率在人群中呈上升趨勢[3]，除肺炎外，還可引起咽炎、鼻竇炎和支氣管炎等疾病，由于其臨床表現(xiàn)呈多樣性和不典型性，單純依靠臨床癥狀或影像學檢查不能作出明確診斷，只有病原學檢查才對診斷具有重要意義。熒光定量PCR檢測具有實時監(jiān)測、準確性高和交叉污染少等優(yōu)點，CP-DNA陽性可作為CP感染早期診斷的特異性指標。本研究通過檢測罹患呼吸道感染的住院患兒呼吸道標本，分析CP-DNA陽性者的年齡、性別及季節(jié)分布和臨床特點，為臨床CP感染的診治提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月至2013年12月浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院門診和住院疑似CP感染的患兒共35 662例，其中男22 624例，女13 038例，年齡1d～14歲，平均（1.96±2.96）歲。＜1歲18 326例，1～3歲8 403例，～6歲4 992例，＞6歲3 941例。入選標準[4]：年齡＜14歲；有流涕、鼻塞、咳嗽持續(xù)并逐漸加重、呼吸加快等臨床癥狀；病程遷延未愈；就診前均未經(jīng)抗生素治療。

1.2 檢測試劑和儀器 PCR熒光檢測試劑盒（產(chǎn)品編號：Cat#DA-006）由中山大學達安基因股份有限公司生產(chǎn)，抗CP抗體IgG檢測試劑盒（產(chǎn)品編號：YZB/GER 0379-2010）和抗CP抗體IgM檢測試劑盒（產(chǎn)品編號：YZB/GEM 1641-2010）由德國歐蒙醫(yī)學實驗診斷股份公司生產(chǎn)。熒光定量PCR擴增儀7500型和StepOnePlus型由美國AB公司生產(chǎn)。

1.3 檢測方法

1.3.1 標本采集 患兒標本均在入院后用藥前釆集。痰液：用無菌5ml玻璃管取受檢者肺深部咳出的痰液1～3ml（嬰幼兒經(jīng)鼻腔負壓抽吸深部合格痰液），密封送檢；肺及支氣管灌洗液：做纖維支氣管鏡檢查者，用無菌5ml玻璃管收集肺泡灌洗液1～3ml，密封送檢；咽拭子：用棉拭子取咽部分泌物，將棉拭子置入無菌玻璃管，密封送檢。本組患兒中有8例同時采集2種標本。

1.3.2 CP-DNA檢測 采用熒光定量PCR技術(shù)，＞1.0×103copies/ml為陽性。具體步驟：（1）痰液：加入4倍體積的0.9%氯化鈉溶液，輕輕震蕩后置4℃冰箱過夜，用槍頭或吸管混勻后吸取1.0～1.5ml至離心管中，12 000r/min離心5min；肺及支氣管灌洗液：取灌洗液1.0～1.5ml至離心管中，12 000r/min離心5min，去上清液，沉淀加滅菌0.9%氯化鈉溶液1ml混勻，12 000r/min離心5min；咽拭子：向玻璃管中加入1ml滅菌0.9%氯化鈉溶液，充分震蕩搖勻，擠干棉拭子，吸取全部液體轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，120 000r/min離心5min。（2）去上清液，沉淀中加入50μlDNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理101min，120 000r/min離心5min。（3）取上清液進行PCR反應(yīng)測定，每次操作均設(shè)陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品和強陽性質(zhì)控品對照，操作過程嚴格按照操作規(guī)程進行。

1.3.3 血清CP-IgM、CP-IgG及細胞檢測 血清CP-IgM檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法，患者樣本吸光度值/上標準品吸光度值＞1.1為陽性；血清CP-IgG檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法，結(jié)果＞22RU/ml為陽性。細胞計數(shù)、白細胞分類正常值參照諸福棠實用兒科學第7版[4]。

1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CP-DNA檢測結(jié)果 所有送檢標本CP-DNA陽性70例，總陽性率為0.20%。痰液標本送檢31 241例，CP-DNA陽性55例（0.18%）；灌洗液標本送檢888例，CP-DNA陽性16例（1.80%）；咽拭子標本送檢2 371例，CP-DNA陽性7例（0.30%）。男性患兒CP-DNA陽性42例（0.19%）；女性患兒CP-DNA陽性28例（0.21%），男女患兒CP-DNA陽性率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.358，P＞0.05）。2010年送檢7 633例，CP-DNA陽性5例（0.07%）；2011年送檢8 150例，CP-DNA陽性22例（0.27%），2012年送檢9 045例，CP-DNA陽性25例（0.28%）；2013年送檢10 834例，CP-DNA陽性18例（0.17%），不同年份CP-DNA陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.383，P＜0.01）。

2.2 CP-DNA陽性者在不同季節(jié)和月份的分布情況

2.2.1 不同季節(jié)CP-DNA陽性率比較 春季（3～5月份）送檢9 050例，CP-DNA陽性21例（0.23%）；夏季（6～8月份）送檢 7 734例，CP-DNA陽性 24例（0.31%）；秋季（9～11月份）送檢8 898例，CP-DNA陽性14例（0.16%）；冬季（12月～次年2月份）送檢9 980例，CP-DNA陽性11例（0.11%），春夏季節(jié)的陽性率（0.27%）高于秋冬季節(jié)（0.13%），差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=8.349，P＜0.01）。

2.2.2 不同月份CP-DNA陽性率比較 研究年限內(nèi)各月份CP-DNA陽性率范圍為0%～0.51%，5月份送檢2 731例，CP-DNA陽性14例（0.51%），12月份送檢3 476例，CP-DNA陽性0例，每月痰液、咽拭子及灌洗液的CP-DNA陽性率見圖1。

圖1 每月痰液、咽拭子及灌洗液的CP-DNA陽性率

2.3 CP-DNA陽性患兒的臨床特點

2.3.1 一般情況 痰液、咽拭子及灌洗液CP-DNA陽性的70例患兒中，男42例（60.00%），女28例（40.00%）。年齡1個月～13歲，平均（5.9±4.3）歲。＜1歲15例（21.43%），1～3歲10例（14.29%），～6歲8例（11.43%），＞6歲37例（52.86%）。

2.3.2 CP-DNA陽性患兒的臨床診斷 70例患兒中，合并其他病原體感染14例（20.00%）：同時存在1種其他病原體檢查陽性9例，包括軍團菌、肺炎支原體、EB病毒各2例，沙眼衣原體、肺炎鏈球菌、巨細胞病毒各1例；2種其他病原體檢查陽性3例，其中肺炎支原體和肺炎軍團菌1例，呼吸道合胞病毒和大腸埃希菌1例，巨細胞病毒和肺炎支原體1例；3種其他病原體陽性1例，包括呼吸道合胞病毒、肺炎軍團菌及肺炎支原體；4種其他病原體陽性1例，包括肺炎軍團菌、肺炎支原體、沙眼衣原體及EB病毒。56例CP單一感染患兒中，以呼吸道疾病為主54例（96.43%），其中肺炎41例，支氣管炎和毛細支氣管炎6例，急性上呼吸道感染7例。41例肺炎患兒中，合并胸腔積液5例，伴肺不張5例，伴支氣管異物1例，有支氣管哮喘3例，伴肺咯血、支氣管擴張囊性變及呼吸功能不全1例；另2例患兒無明顯呼吸道癥狀，但罹患急性散播性腦脊髓炎和病毒性腦炎。

2.4 CP-DNA陽性患兒輔助檢查結(jié)果 血白細胞計數(shù)平均（9.6±4.2）×109/K，高于正常21例（30.00%）；中性粒細胞計數(shù)平均（5.1±3.9）×109/K，高于正常16例（22.86%）。超敏C反應(yīng)蛋白送檢70例，其中≥8mg/K28例（40.00%）。行血清學檢查54例，其中CP-IgM陽性33例（61.11%），CP-IgG陽性25例（46.30%），兩者均陽性17例（31.48%）。

2.5 治療情況 CP感染的住院患兒中治愈出院69例，因家長要求自行出院1例：下呼吸道感染患兒56例均予大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對癥治療，其中采用單一阿奇霉素治療50例（72.86%）；采用單一紅霉素治療4例（5.71%），采用單一克拉霉素治療1例，采用阿奇霉素治療1個療程后療效欠佳后改紅霉素1例；其余患兒予利邁欣（化學名：利巴韋林）、萘夫西林、頭孢西丁、苯唑西林等藥物，病情亦有所好轉(zhuǎn)。所有患兒住院2～29（8.6±5.8）d。2例無呼吸道癥狀的患兒使用阿奇霉素和羅氏芬（化學名：頭孢曲松鈉）治療后好轉(zhuǎn)出院。

3 討論

CP是1989年描述的衣原體，系革蘭染色陰性，嚴格細胞內(nèi)寄生的人類病原體[5]。本組資料顯示CP感染患兒在性別上差異無統(tǒng)計學意義，而年長兒的CP-DNA陽性率高于嬰幼兒，可能與學齡期兒童活動范圍較廣，在校園內(nèi)易發(fā)生交叉感染有關(guān)。本組受檢患兒痰液、咽拭子及灌洗液CP-DNA總陽性率為0.20%，較國內(nèi)外同類研究低[6-9]。分析造成差異的原因，可能與不同地區(qū)的流行高峰、患兒的年齡范圍以及檢測手段不同有關(guān)。本研究結(jié)果顯示灌洗液標本陽性率顯著高于痰液和咽拭子標本，提示灌洗液標本可作為臨床檢測首選方法。CP是公認的5歲以上兒童常見的呼吸道病原體，而本研究納入的＜6歲患兒占88.95%，其感染率低于5歲以上患兒，致總陽性率較低。本組2010年陽性率處于低水平，2011和2012年度感染率顯著高于其他年度，春夏季節(jié)CP-DNA陽性率顯著高于秋冬季節(jié)，反映了本地區(qū)研究年限內(nèi)CP感染的流行病學特點。從CP-DNA陽性率各月份分布圖亦可知，自2011年4月，本地區(qū)CP-DNA陽性率已較前明顯增加。春夏季節(jié)晝夜溫差大，兒童抵抗力較差易受感染，學校等教育機構(gòu)應(yīng)注意適當通風避免交叉感染。

CP感染除可引發(fā)肺炎和上呼吸道感染外，還與哮喘有關(guān)，甚至與肥胖、腦炎、心肌炎等許多非呼吸道疾病相關(guān)[10-13]。肺炎衣原體也可合并其他病原體感染，包括肺炎鏈球菌、肺炎支原體、沙眼衣原體、EB病毒、巨細胞病毒和呼吸道合胞病毒等，給臨床醫(yī)師的診治帶來更大的困難，易造成不合理用藥，延誤病情。實時熒光定量PCR的應(yīng)用，提高了檢測的準確性，在封閉系統(tǒng)內(nèi)進行操作，最大限度地減少了普通PCR導(dǎo)致的假陽性污染，并實現(xiàn)了準確定量,是CP感染的有效診斷方法[14]。但CP-DNA陽性也不能排除病原體定值可能，因此應(yīng)根據(jù)患兒的臨床特點和其他輔助檢查結(jié)果共同作出判斷。本組下呼吸道感染患兒均有相應(yīng)的X線胸片表現(xiàn)，血清CP-IgM陽性為61.11%，血清CP-IgG占46.30%，兩者均陽性占31.48%，符合CP感染的表現(xiàn)。由于初次感染時IgM大約在發(fā)病后3周左右出現(xiàn)，IgG在6～8周出現(xiàn)；再次感染時IgM可能不出現(xiàn)，IgG在1～2周出現(xiàn)[15]，因此早期檢測可出現(xiàn)假陰性，若能在恢復(fù)期復(fù)查CP抗體并與急性期比較，則更具有診斷價值。血常規(guī)和超敏C反應(yīng)蛋白是臨床常用的檢測指標，對鑒別細菌和病毒感染具有重要參考價值。本組CP感染患兒中，血白細胞計數(shù)正?；虻陀谡Ｕ?0.00%，中性粒細胞比例正?；虻陀谡Ｕ?7.14%，而超敏C反應(yīng)蛋白升高達40.00%，提示血常規(guī)正?；虻陀谡６鬋反應(yīng)蛋白升高有助于CP感染診斷。

一旦對CP感染明確診斷，可使用影響CP蛋白質(zhì)合成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進行治療。Hammerschlag[16]報道，小兒CP肺炎用紅霉素或克拉霉素治療10d或阿奇霉素治療5d，其清除率可達79%～86%。本組資料顯示阿奇霉素是治療CP感染的有效藥物，可作為首選藥物。但也有十余例患兒好轉(zhuǎn)而未使用針對性抗生素，可能與在增強體質(zhì)和治療混合感染的情況下，CP感染有一定自限性有關(guān)[17]。

[1] 陳桂霞,曾國章,陳筱錚,等．2001至2010年全國5歲以下兒童死亡監(jiān)測文獻分析[J]．中國優(yōu)生優(yōu)育,2013,19(8):619-621．

[2] El-Solh A A,Niederman M S,Drinka P．Nursing home-acquired pneumonia:a review of risk factors and therapeutic approaches [J]．Curr Med Res Opin,2010,26(12):2707-2714．

[3] 張繼翱,李家瑞,張宇．社區(qū)獲得性肺炎抗菌藥物治療的臨床觀察[J]．中華醫(yī)院感染學雜志,2014,24(2):347-348．

[4] 胡亞美,江載芳．諸福棠實用兒科學[M]．上冊．7版．北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:2684-2685．

[5] 崔京濤,閏文娟,倪安平,等．五年間肺炎衣原體血清抗體檢測及流行病學分析[J]．中華醫(yī)學雜志,2014,94(12):919-923．

[6] 陳建惠．389例呼吸道感染患兒血清肺炎衣原體IgM抗體檢測結(jié)果分析[J]．浙江醫(yī)學,2004,26(7):529-530．

[7] 吳茜,溫柏平,楊躍煌,等．住院兒童下呼吸道非典型病原體感染5年流行病學分析[J]．中國兒童保健雜志,2011,19(2):131-133．

[8] Chen C J,Lin P Y,Tsai M H,et al．Etiology of Community-acquired Pneumonia in Hospitalized Children in Northern Taiwan[J]．TheP-ediatric infectiousdiseasejournal,2012,31(11):196-201．

[9] Choroszy-Krol I,Frej-Madrzak I M,Teryks-Wolyniec D,et al．Respiratory infection caused by Chlamydophila pneumoniaein children and adolescents in the Lower Silesia Region ofPoland[J]．European journal of medical research,2010,15(Suppl 2):112-114．

[10] Asner S A,Jaton K,Kyprianidou S,et al．Chlamydia pneumoniae: possible association with asthma in children[J]．Clin Infect Dis, 2014,58(8):1198-1199．

[11] Lajunen T,Bloigu A,Paldanius M,et al．The association of body mass index,waist and hip circumference,and waist-hip ratio with chlamydia pneumoniae IgG antibodies and high-sensitive C-reactive protein at 31 years of age in Northern Finland Birth Cohort 1996[J]．Int J obes(Lond),2011,35:1470-1478．

[12] Elargoubi A,Verhoeven P O,Grattard F,et al．Acute encephalitis associated to a respiratory infection due to Chlamydophila pneumoniae[J]．Med Mal Infect,2013,43(8):345-349．

[13] Walder G,Gritsch W,Wiedermann C J,et al．Co-infection with two Chlamydophila species in a case of fulminant myocarditis[J]．Crit Care Med,2007,35(2):623-626．

[14] Karolina Gullsby,Martin Storm,Kare Bondeson．Simultaneous Detection of Chlamydophila pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae by Use of Molecular Beacons in a Duplex Real-Time PCR[J]．J Clin Microbiol,2008,46(2):727-731．

[15] 陳宏斌,王輝．非典型病原體的實驗室檢測技術(shù)及其臨床應(yīng)用前景[J]．中華結(jié)核和呼吸雜志,2010,33(7):540-543．

[16] Hammerschlag M R．Pneumonia due to Chlamydia pneumoniae in children:Epidemiology,diagnosis,and treatment[J]．Pediatric Pulmonology,2003,36(5):384-390．

[17] 陳建惠,龔方戚,章毅英,等．肺炎衣原體肺炎54例臨床分析[J]．臨床兒科雜志,2009,27(7):622-624．

2015-04-30）

（本文編輯：馬雯娜）

310003 杭州，浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院感染科（王漢斌系杭州師范大學醫(yī)學院在讀本科生）

華春珍，E-mail：chunzhenhua@yahoo.com