袁小建 李顯明 章功年 金東輝 肇恒飛 蘇志偉 范躍祖

去甲斑蝥素對人真皮淋巴管內(nèi)皮細胞體外三維培養(yǎng)淋巴管生成的影響及其機制

袁小建 李顯明 章功年 金東輝 肇恒飛 蘇志偉 范躍祖

目的 探討去甲斑蝥素（NCTD）對人真皮淋巴管內(nèi)皮細胞（HDLEC）體外三維培養(yǎng)淋巴管生成的影響及機制。方法建立HDLEC體外培養(yǎng)淋巴管生成模型，隨機分為NCTD組（加1/3 IC50NCTD 40 nM）與空白對照組，作用24 h，觀察兩組淋巴管生成的形態(tài)變化；并采用免疫細胞化學、Western blot試驗和qPCR技術測定比較兩組淋巴管生成因子（VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3）蛋白和基因表達。結果 NCTD組的HDLEC細胞形態(tài)發(fā)生改變，很少形成管狀結構，時間延長后細胞出現(xiàn)變圓、離壁、浮起、死亡；且NTCD組淋巴管生成（10.9±2.3）個，明顯少于空白對照組（68.4±5.2）個（P＜0.01）。免疫細胞化學染色、Western blot試驗結果顯示，NCTD對HDLEC三維培養(yǎng)淋巴管生成中的VEGF-C和VEGF-D的蛋白表達下調（P＜0.01）。qPCR檢測顯示，NCTD對VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的基因表達明顯降低（P＜0.01）。結論 NCTD對通過下調淋巴管生成因子VEGF-C、VEGF-D的蛋白和基因表達，產(chǎn)生抗淋巴管生成的作用。

去甲斑蝥素 人真皮淋巴管內(nèi)皮細胞 三維培養(yǎng) 抗淋巴管生成

腫瘤細胞通過淋巴管轉移是腫瘤擴散的主要途徑，但是淋巴管生成過程、作用和機制尚不清楚。去甲斑蝥素（NCTD）是用于治療癌癥的傳統(tǒng)中藥，其抗淋巴管生成作用的靶點與機制如何，尚待進一步研究。本研究通過人真皮淋巴管內(nèi)皮細胞（HDLEC）三維培養(yǎng)體外模擬淋巴管生成過程，觀察NCTD對淋巴管生成因子VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3蛋白和基因表達的影響，以探討NCTD抗淋巴管生成的相關分子機制，為腫瘤抗淋巴管生成治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑 HDLEC（美國Sciencell公司），人纖維蛋白原（北京拜德生物有限公司），人凝血酶（美國Sigma公司），NCTD（H20064531，江蘇康希制藥有限公司），兔抗人VEGF-C抗體（美國invitrogen公司）；兔抗人VEGF-D抗體（美國Abcam公司），兔抗人VEGFR-3抗體（美國Cell Signaling公司），GAPDH（美國Abcam公司），S-P試劑盒、免疫組化試劑盒（上海晶美生物技術有限公司），Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司），PCR引物（上海Sangon公司），Real-time PCR試劑盒（大連Takara公司），cDNA逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司），蛋白預染Marker（SM0671，美國Fermentas公司），顯影粉、定影粉和X光膠片（上海冠龍公司）。

1.2 纖維蛋白凝膠制備和細胞培養(yǎng) 依據(jù)相關文獻[1-2]，用PBS溶解人纖維蛋白原（3 mg/ml）和人凝血酶（50 U/ml），在6孔培養(yǎng)板中制備纖維蛋白凝膠，先后加入500 μl纖維蛋白原、100μl內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液和10μl凝血酶溶液凝固，37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中30min，纖維蛋白原凝膠形成膠凍狀。將培養(yǎng)好的HDLEC（第五代細胞）懸液各取300μl注入凝膠表面（細胞濃度1×105ml），靜置1h后加入內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液2ml，37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2d更換培養(yǎng)液1次，每天通過倒置光顯微鏡觀察細胞生長及體外淋巴管生成情況。

HDLEC在體外纖維蛋白凝膠培養(yǎng)1周左右，隨機分為空白對照組與NCTD組（加1/3 IC50NCTD 40nM）[2]，繼續(xù)培養(yǎng)24h，觀察形態(tài)變化。HDLEC（第五代細胞）培養(yǎng)1周后開始形成淋巴管生成管狀結構，隨機分為空白對照組與NCTD組（同上），作用24h，應用免疫細胞化學、Western blot試驗、qPCR檢測HDLEC體外模擬淋巴管生成過程中，NCTD對VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白和基因表達的影響。

1.3 qPCR檢測 根據(jù)Trizol試劑盒指示提取細胞總RNA。通過cDNA逆轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA，并進行PCR擴增，隨后進行定量PCR檢測。PCR反應擴展條件：95℃30s，95℃5s，60℃30s，共40個循環(huán)。引物為VEGF-C，5′-AGTCGCGACAAACACCTTCT-3′（正義）和5′-GTAGCTCGTGCTGGTGTTCA-3′（反義）；VEGF-D，5′-CAGTGGGTTGATCTGGGACT-3′（正義）和5′-CATGCAGGGTAGGATGGTCT-3′（反義）；VEGFR-3，5′-CGGCTTCAGCTGTAAAGGAC-3′（正義）和5′-GCCTCCAAGGAGTAAGACCC-3′（反義）；GAPDH，5′-GCCTCCAAGGAGTAAGACCC-3′（正義）和5'-TGTGAGGAGGGGAGATTCAG-3′（反義）。使用ABI7900HT序列檢測系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）自帶軟件分析數(shù)據(jù)，所有樣品一式兩份。GAPDH作為每個樣本測定的CT值和mRAN相對表達量的內(nèi)部參照，使用比較循環(huán)閾值（2-2-△△CT）方法計算基因表達量。

1.4 Western blot試驗 按照試劑盒說明書操作裂解細胞，提取蛋白放置包含有50 mM Tris（pH 7.4）、150mM氯化鈉、1%的Trit nX-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉和蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液中。參照相關文獻[3]將兔抗人VEGF-C和-D和VEGFR-3抗體進行免疫印跡試驗。用Odyssey紅外成像系統(tǒng)（美國LI-COR Biosciences公司）進行蛋白條帶顯現(xiàn)，使用Odyssey軟件計算相對于GAPDH的熒光強度。運用Image Pro Plus軟件確定VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表達的積分光密度（IOD）。

1.5 免疫細胞化學染色 免疫細胞化學染色采用生蛋白鏈菌素-過氧化物酶（S-P）方法進行。HDLEC接種在浸漬35 mm培養(yǎng)皿纖連蛋白涂覆的玻璃蓋玻片上，隨機分為空白對照組與NCTD組，作用24h，取出蓋玻片，甲醇與丙酮溶液1∶1固定，自然風干后，-20℃冰箱內(nèi)保存，用S-P法對細胞片進行免疫細胞化學染色，以細胞質內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。染色結果用Image Pro Plus（美國Media Cybernetics公司）測定IOD。

1.6 統(tǒng)計學處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 NCTD對HDLEC體外模擬淋巴管生成的影響24h后，可見空白對照組的HDLEC細胞形成圓形或橢圓形、類環(huán)狀或多環(huán)中空管道樣“淋巴管生成”雛形結構，見圖1；NCTD組HDLEC細胞形態(tài)發(fā)生改變，很少形成管狀結構，時間延長后細胞出現(xiàn)變圓、離壁、浮起、死亡。隨機取5個顯微鏡視野（×200），觀察并計算淋巴管生成個數(shù)，重復3次取均值，NTCD組淋巴管生成（10.9±2.3）個，明顯少于空白對照組（68.4±5.2）個（P＜0.01）。

圖1 顯微鏡下可見（作用24h后，空白對照組可見HDLEC細胞形成多個圓形或橢圓形、類環(huán)狀或多環(huán)中空管道樣“淋巴管生成”雛形結構；NCTD組可見HDLEC細胞形成“淋巴管生成”雛形結構的能力減弱，HDLEC細胞聚集浮起，固縮碎裂，凋亡壞死。纖維蛋白凝膠三維培養(yǎng)，相差倒置光學顯微鏡，×200）

2.2 NCTD對HDLEC在體外模擬淋巴管生成過程中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白和mRNA表達的影響 qPCR結果顯示，NCTD能明顯降低HDLEC在體外模擬淋巴管生成過程中的VEGF-C（2.41%±0.11%，7.44%±0.11%）、VEGF-D（16.08%±1.12%，27.28%±1.22%）和VEGFR-3（0.95%±0.02%，3.40%±0.02%）的基因表達（P＜0.01）。免疫細胞化學染色結果顯示，NCTD能明顯降低VEGF-C（0.088±0.011，0.141±0.014）和VEGFD（0.084±0.008，0.138±0.012）的蛋白表達（P＜0.01）；但NCTD組與空白對照組在VEGFR-3（0.130±0.006，0.140± 0.017）的蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。Western blot試驗顯示，NCTD能明顯降低VEGFC（10 183.9±3 382.9，24 892.4±1 540.0）和VEGF-D（10 518.4±3 306.1，27 898.2±1 741.3）的蛋白表達，而兩組對VEGFR-3（33579.0±1589.2，39396.9±3 746.3）的蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖2 NCTD對HDLEC體外模擬淋巴管生成過程中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的蛋白表達的影響（免疫細胞化學染色）

圖3 NCTD對HDLEC外模擬淋巴管生成過程中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白表達的影響（Western blot試驗）

3 討論

淋巴管生成對于胚胎期淋巴系統(tǒng)的發(fā)育與成體中淋巴管的再生十分重要。一般來說，血管生成總是伴隨著淋巴管生成；而腫瘤中存在血管生成，那么可能存在淋巴管生成。2001年首次在動物模型中證實腫瘤淋巴管生成[4-6]。前期研究表明NCTD能明顯抑制膽囊和膀胱腫瘤細胞的VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白水平和基因水平的表達[7-8]。本研究建立了HDLEC體外三維培養(yǎng)淋巴管生成模型，相差光學顯微鏡觀察到HDLEC在纖維蛋白凝膠三維培養(yǎng)基中形成圓形、橢圓形、類環(huán)狀或多環(huán)中空管道樣的“淋巴管生成”雛形結構；而淋巴管狀結構的形成與HDLEC增殖、遷移、行走密切相關[2]。本實驗應用NTCD后，淋巴管生成個數(shù)明顯減少，HDLEC形態(tài)發(fā)生改變，很少形成管狀結構，時間延長后HDLEC細胞聚集、浮起，固縮碎裂，淋巴管狀結構斷裂、破壞，細胞凋亡壞死。這表明NCTD不僅能顯著抑制HDLEC三維培養(yǎng)體外模擬形成“淋巴管生成”，而且對已形成的淋巴管狀結構有明顯的抑制破壞作用。

目前，NCTD已廣泛應用于臨床抗腫瘤治療，但迄今尚未見應用于抗腫瘤淋巴管生成方面的報道。本實驗通過培養(yǎng)HDLEC建立體外模擬淋巴管生成模型，觀察NCTD對HDLEC的直接殺傷和凋亡誘導作用，以及對淋巴管生成因子蛋白和mRNA表達的影響，以研究NCTD抗HDLEC淋巴管生成的作用與機制。通過免疫細胞化學、Western blot試驗和qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，NCTD可使HDLEC體外三維培養(yǎng)模擬淋巴管生成過程中的VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3在蛋白和mRNA水平表達均明顯下調。NCTD的抗HDLEC淋巴管生成作用，可能與其直接抑制淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移，誘導其凋亡，在蛋白和mRNA水平下調淋巴管生成因子VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的表達，阻斷VEGFC、VEGF-D和VEGFR-3的信號通道等有關。

前期研究表明，NCTD能有效抑制腫瘤細胞的VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表達[7-8]。本實驗直接針對淋巴管內(nèi)皮細胞、HDLEC體外三維培養(yǎng)模擬淋巴管生成和淋巴管生成過程中的VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達進行研究，為NCTD靶向性抗腫瘤淋巴管生成和阻斷VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3信號通道提供實驗依據(jù)與“抗腫瘤淋巴管生成”作用靶點。此外，能否真正抑制惡性腫瘤所誘導的淋巴管生成，有待在荷瘤動物淋巴管生成抑制實驗中進一步驗證；NCTD與VEGFR-3抗體在抗腫瘤淋巴管生成方面是否協(xié)同作用、機制如何，需進一步探討。

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Inhibitory effect of norcantharidin on human dermal lymphatic endothelial cell in three-dimensional culture

YUAN Xiaojian,LI Xianming，ZHANG Gongnian,et al.Department of Surgery,Jiaxing Maternal and Child Health Hospital,Jiaxing 314000,China

Objective To study the effect of norcantharidin(NCTD)on human dermal lymphatic epithelial cell(HDLEC)in three-dimensional culture and related molecular mechanisms. Methods Three dimensional model of lymphangiogenesis with HDLEC was established to mimic lymphatic capillary-like structures in vitro.The three-dimensional cultured HDLEC were randomly assigned to control group(no NCTD)and NCTD group(cultured with 40 nm NCTD)for 24 h.The morphological changes were observed by inverted microscope,the expressions of VEGF-C,VEGF-D,VEGFR-3 protein and MicroRNA in threedimensional cultured HDLEC were measured by immunohistochemistry,western-blot and qPCR. Results The lymphangiogenesis model in vitro was established successfully by three-dimensional culture of HDLEC.The inhibitory effects of NCTD on lymphangiogenesis in vitro were observed.Compared to control group,the expression of VEGF-C and VEGF-D proteins in NCTD group was significantly down-regulated as showed by immunohistochemistry and Western-blot(P＜0.01),The MicroRNA expression of VEGF-C,VEGF-D and VEGFR-3 in NCTD group was significantly decreased as shown by qPCR(P＜0.01). Conclusion Norcantharidin inhibits lymphangiogenesis by down-regulating the expression of VEGF-C and VEGF-D,suggesting that it might be an effective agent for targeting anti-lymphangiogenesis.

Norcantharidin Lymphatic endothelialcellThree-dimensionalAnti-lymphangiogenesis

2015-02-12）

（本文編輯：陳丹）

314000 嘉興婦幼保健院外科（袁小建、李顯明、章功年、金東輝、肇恒飛、蘇志偉，袁小建系同濟大學醫(yī)學院2006級在職研究生）；上海同濟大學附屬同濟醫(yī)院外科（范躍祖）

袁小建，E-mail：hyyxj2003@163.com