木 蘭 托 婭

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

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MicroRNA-31在肝癌中的腫瘤抑制作用

木 蘭 托 婭1

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

目的 分析微小RNA-31(MicroRNA-31)在肝癌中的腫瘤抑制作用和影響機(jī)制。方法 選取2014年6月至2016年1月收治的HBV感染者為研究對(duì)象，依照患者病情分為急性肝炎組、慢性肝炎組、肝硬化組、肝癌組，另外選取同期健康體檢人員30例作為健康組，采集患者外周靜脈血，測(cè)定MicroRNA-31表達(dá)情況。肝癌手術(shù)患者留取肝癌組織和癌旁正常組織，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，實(shí)施平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。選取健康裸鼠，在無菌條件正常飲食下，將轉(zhuǎn)染肝癌組織經(jīng)皮下注射置入裸鼠，3 w后處死，取出腫瘤組織，測(cè)量體積。同時(shí)開展Western印跡，采用實(shí)時(shí)熒光RNA和免疫組織化學(xué)法測(cè)定觀察。結(jié)果 感染HBV后，細(xì)胞MicroRNA-31存在高表達(dá)情況，肝癌組患者組織核細(xì)胞MicroRNA-31表達(dá)顯著高于其他組(P<0.05)。平板克隆實(shí)驗(yàn)測(cè)定，轉(zhuǎn)染MicroRNA-31的腫瘤細(xì)胞克隆數(shù)增殖減少50%(P<0.05)。體外成瘤實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染MicroRNA-31后的肝癌細(xì)胞成瘤能力下降，而且腫瘤體積縮小。Western印跡檢測(cè)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，LATS2表達(dá)水平提高1.5倍，PPP2R2A表達(dá)無明顯變化，轉(zhuǎn)染LATS2siRNA細(xì)胞中LATS2表達(dá)顯著下降(P<0.05)。MicroRNA-31表達(dá)與LATS2呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(P<0.05)。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)顯示，肝癌組織中LATS2表達(dá)水平顯著低于正常組織。 結(jié)論 肝癌組織中MicroRNA-31可能通過調(diào)節(jié)LATS2抑制腫瘤增殖，MicroRNA有望成為分子指標(biāo)靶向藥物。

肝癌；微小RNA-31;腫瘤抑制；熒光定量RNA

乙型肝炎病毒(HBV)感染與肝癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。HBV感染疾病中，微小(Micro)RNA能夠參與調(diào)節(jié)作用。MicroRNA屬于比較保守的單鏈非編碼RNA，能夠與靶基因結(jié)合〔1〕，調(diào)控轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)，參與多種生理過程，發(fā)揮抑癌基因或者癌基因作用。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上的MicroRNA基因固定在腫瘤基因相關(guān)區(qū)域，并且腫瘤發(fā)生發(fā)展中，常出現(xiàn)異常表達(dá)。MicroRNA-31最早在Hela細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，位于染色體9P21.3。MicroRNA-31短鏈非編碼RNA長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸〔2〕。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA-31能夠參與多種生物學(xué)作用，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡，很多研究指出MicroRNA-31能夠參與肺癌、食管癌等疾病發(fā)生進(jìn)展，不同惡性腫瘤中MicroRNA-31發(fā)揮作用的研究結(jié)果也不一致〔3〕。本研究重點(diǎn)分析MicroRNA-31在肝癌中的抑制作用和影響機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2014年6月至2016年1月收治的HBV感染者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合急慢性HBV感染納入標(biāo)準(zhǔn)；排除標(biāo)準(zhǔn)：化療、其他肝臟疾病、妊娠期、嚴(yán)重肝腎衰竭等患者。依照患者病情分為急性肝炎組、慢性肝炎組、肝硬化組、肝癌組。急性肝炎組30例中男19例，女11例；年齡34～63歲，平均(45.3±7.5)歲。慢性肝炎組29例中男18例，女11例；年齡36～69歲，平均(48.2±10.3)歲。肝硬化28例中男16例，女12例；年齡31～62歲，平均(46.3±8.5)歲。肝癌組32例中男22例，女10例；年齡34～68歲，平均(48.3±9.7)歲。另外選取同期來我院健康體檢人員30例作為健康組，男18例，女12例；年齡32～68歲，平均(46.2±9.8)歲。5組患者一般資料具有可比性(P>0.05)。

主要試劑：RNA提取試劑盒(上海巖鑫生物科技有限公司)、RNA酶抑制劑(上海禾興生物科技有限公司)、RNA-DNA嵌合探針(上海吉瑪生物公司)、Trizol(大連寶生物有限公司)、探針序列(上海生工生物有限公司)、微球捕捉序列(Bio-Rad)、DMEM(Gibco公司)、抗體(Abcam公司)、RNA試劑盒(Qiagen公司)、反轉(zhuǎn)錄酶(Fermentas公司)。

主要儀器：PCR儀器(Bio-Rad)、Luminex液態(tài)芯片分析系統(tǒng)(Luminex)、紫外分光光度計(jì)(上海儀電分析儀)、離心機(jī)(Termo)。

1.2 方法 采集患者外周靜脈血5 ml，加入Ficoll提取液，離心，吸出灰色外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。在PBMC中加入Trizol共1 ml，反復(fù)吹打，嚴(yán)格按照說明書抽取總RNA，采用分光光度法測(cè)定吸光度。當(dāng)A260/A280比值1.9～2.1時(shí)，加入RNA酶抑制劑。采用RNA-DNA嵌合探針液態(tài)芯片檢測(cè)MicroRNA-31表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)中用到的探針序列采用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)，由生物工程公司合成，登錄號(hào)：407035。RNA-DNA嵌合探針序列：AGC AUG CCA GCA AGC AUC UUG CUC CGC CGT TGT CCT GTC；微球捕捉DNA序列：GAC AGG ACA ACG GCG G。檢測(cè)時(shí)，取3次熒光信號(hào)平均讀數(shù)作為有效數(shù)值。

肝癌患者采取手術(shù)治療，留取肝癌組織和正常癌旁組織。細(xì)胞轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照脂質(zhì)體說明書操作。轉(zhuǎn)染4 h后換培養(yǎng)液，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

實(shí)施平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到孔板中，每3 d換培養(yǎng)液，直至大部分腫瘤細(xì)胞克隆成功，PBS清洗并計(jì)數(shù)。

建立腫瘤模型。獲得動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，選取健康裸鼠(SCXK2014-0002)，在無菌條件正常飲食下，將轉(zhuǎn)染的肝癌組織經(jīng)皮下注射置入裸鼠，3 w后處死，取出腫瘤組織，測(cè)量體積。

Western印跡。將細(xì)胞轉(zhuǎn)染LATS2的MicroRNA表達(dá)作為對(duì)照，轉(zhuǎn)染48 h后，分析LATS2表達(dá)。采用PBS溶液清洗裂解細(xì)胞，蛋白濃度采用BCA法測(cè)定，同時(shí)采用SDS-PACE膠分析，分析條帶強(qiáng)度。

采用實(shí)時(shí)熒光RNA和免疫組織化學(xué)法測(cè)定觀察。嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒操作，RNA濃度采用NanoDropND-1000分光光度計(jì)法測(cè)定，取500 ng RNA合成CDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。將腫瘤組織切片脫水處理，加入3%醫(yī)用雙氧水，孵育5 min，清晰后采用PBS洗滌，山羊血封閉，滴加一抗孵育；然后采用生物素標(biāo)記的二抗孵育，最后滴加辣根酶標(biāo)記，顯微鏡下觀察。

將含有MicroRNA-31結(jié)合位點(diǎn)的LATS克隆到載體GFP下游，細(xì)胞轉(zhuǎn)后，轉(zhuǎn)染RFP作為內(nèi)參，轉(zhuǎn)染48 h后，測(cè)定GFP熒光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 HBV感染不同時(shí)期MicroRNA-31表達(dá)比較 感染HBV后，細(xì)胞MicroRNA-31存在高表達(dá)情況。不同病情，MicroRNA-31表達(dá)存在一定差異。健康組MicroRNA-31表達(dá)水平(0.56±0.19)最低，肝癌組患者組織核細(xì)胞MicroRNA-31表達(dá)(0.83±0.31)顯著高于其他組(急性肝炎組、慢性肝炎組、肝硬化組分別為0.58±0.21、0.62±0.30、0.71±0.28)(P<0.05)。

2.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 利用平板克隆實(shí)驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞、SLC-1 細(xì)胞和MicroRNA-31ASO細(xì)胞生長(zhǎng)情況。與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染MicroRNA-31的腫瘤細(xì)胞克隆數(shù)增殖減少50%，差異顯著(P<0.05)。

2.3 體外成瘤實(shí)驗(yàn) 將對(duì)照細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染MicroRNA-31細(xì)胞注入到裸鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染MicroRNA-31后的肝癌細(xì)胞成瘤能力下降，而且腫瘤體積縮小。見圖1、圖2。

圖1 體外成瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤體積觀察

圖2 MicroRNA-31對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.4 Western印跡檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，LATS2表達(dá)水平提高1.5倍，PPP2R2A表達(dá)無明顯變化。

2.5 預(yù)測(cè)MicroRNA-31候選靶基因 生物學(xué)信息學(xué)法測(cè)定，MicroRNA-31與LATS2結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)。

2.6 GFR報(bào)道載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MicroRNA-31靶基因 對(duì)照設(shè)為1，轉(zhuǎn)染MicroRNA-31細(xì)胞LATS2 3/UTR強(qiáng)度增強(qiáng)(1.5)，MicroRNA-31轉(zhuǎn)染對(duì)突變熒光強(qiáng)度(OP)無明顯影響。

2.7 MicroRNA-31對(duì)LATS2表達(dá)的影響 對(duì)照設(shè)為1，轉(zhuǎn)染LATS2 siRNA細(xì)胞中LATS2表達(dá)(0.2)顯著下降(P<0.05)。

3 討 論

MicroRNA是乙組內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，能夠廣泛參與細(xì)胞增殖、分化以及炎癥等生理過程，能夠與目的基因3/端非編碼結(jié)合，通過降低信使RNA含量，組織DNA的翻譯。當(dāng)前MicroRNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)1 400多種，由于其廣泛具有生物學(xué)作用〔4〕，研究MicroRNA-31對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)作用對(duì)分子靶向治療有重要理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

有關(guān)MicroRNA-31的研究論文較多，多集中在皮膚癌、乳腺癌、食管癌等惡性腫瘤研究中，肝癌方面的研究不多〔5〕。研究證實(shí)MicroRNA在調(diào)節(jié)腫瘤生物學(xué)作用時(shí)，能夠發(fā)揮類似抑癌基因或者癌基因作用。關(guān)于不同MicroRNA的表達(dá)研究觀點(diǎn)也存在一定差異。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為在大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞中，MicroRNA-31均呈現(xiàn)高表達(dá)，認(rèn)為在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中，MicroRNA-31能夠發(fā)揮癌基因的效果〔6〕。但是有關(guān)MicroRNA-31的研究觀點(diǎn)卻都存在較大的差異。乳腺癌研究中，發(fā)現(xiàn)MicroRNA-31能夠參與肺部轉(zhuǎn)移灶荷瘤減少，抑制乳腺癌的活動(dòng)性、侵襲性，認(rèn)為在乳腺癌中，MicroRNA-31屬于一種抑癌基因。在結(jié)腸癌相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)MicroRNA-31高表達(dá)會(huì)提高腫瘤的侵襲性〔7〕，認(rèn)為MicroRNA-31同樣具有癌基因的特點(diǎn)。MicroRNA-31在不同腫瘤中的研究觀點(diǎn)一直沒有統(tǒng)一，結(jié)腸癌、肺癌等高表達(dá)，卵巢癌、胃癌中則呈低表達(dá)。

有學(xué)者分析MicroRNA-31表達(dá)對(duì)肝纖維化的影響〔8〕，發(fā)現(xiàn)MicroRNA-31的表達(dá)受到TGF-β1的影響，認(rèn)為MicroRNA-31表達(dá)與腫瘤血管生長(zhǎng)有關(guān)〔9〕。本組臨床研究以HBV感染患者為研究對(duì)象，提示MicroRNA-31表達(dá)水平與HBV感染密切相關(guān)，可能參與病情進(jìn)展，MicroRNA-31在肝癌中能夠發(fā)揮癌基因作用。MicroRNA-31在其他惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)存在高表達(dá)情況，如在皮膚癌患者中miR-31呈現(xiàn)高表達(dá)，并且與患者病情嚴(yán)重程度、預(yù)后相關(guān)〔10〕。為進(jìn)一步分析MicroRNA-31對(duì)肝癌惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，在以往研究中發(fā)現(xiàn)MicroRNA-31能夠參與血管平滑肌的生長(zhǎng)，認(rèn)為MicroRNA-31表達(dá)與腫瘤進(jìn)展有關(guān)〔11〕。本組研究結(jié)果，提示MicroRNA-31在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中是癌基因的角色。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MicroRNA與靶基因3/UTR并不是完全互補(bǔ)的，因此多認(rèn)為MicroRNA-31能夠通過調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因表達(dá)發(fā)揮癌基因作用〔12〕。有學(xué)者對(duì)肺癌患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MicroRNA-31能夠通過影響LATS2以及PPP2R2A參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。LATS2位于13號(hào)染色體上，能夠編碼蛋白激酶；很多學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)，LATS2編碼的蛋白酶屬于腫瘤抑制信號(hào)途徑，能夠誘導(dǎo)癌基因失活，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用。本組研究結(jié)果顯示MicroRNA-31能夠參與調(diào)節(jié)LAST2蛋白的表達(dá)，但是并沒有影響PPP2R2A表達(dá)，可能是因?yàn)椴煌[瘤細(xì)胞中PPP2R2A的表達(dá)也存在變化，這點(diǎn)在皮膚癌研究中也觀察到。通過GFR實(shí)驗(yàn)報(bào)告進(jìn)一步證實(shí)MicroRNA-31能夠直接作用LATS1，MicroRNA-31抑制腫瘤細(xì)胞增殖可能是通過與3/URT結(jié)合抑制LATS2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞增殖。采用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定以及免疫組織化學(xué)法分析，肝癌匯總LATS1表達(dá)降低，敲除該基因后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，與轉(zhuǎn)染MicroRNA-31的相反，進(jìn)一步說明LATS2是MicroRNA-31的靶基因，未來基因靶向治療中，可以考慮抑制MicroRNA-31表達(dá)，提高LATS2的水平。

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〔2016-08-29修回〕

(編輯 曲 莉)

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014MS08116，2014MS0854)

1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院

托 婭(1974-)，女，主任檢驗(yàn)師，主要從事寄生蟲學(xué)、病院生物學(xué)研究。

木 蘭(1973-)，女，副教授，主要從事寄生蟲學(xué)、病院生物學(xué)研究。

R73

A

1005-9202(2016)23-5802-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.013