秦 錚 張桂云 劉騰飛 楊文娟 姚春麗

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，吉林 長春 130041)

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α1抗胰蛋白酶治療皮膚光老化的作用及對(duì)抗氧化物水平的影響

秦 錚 張桂云 劉騰飛 楊文娟 姚春麗

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，吉林 長春 130041)

目的 探討α1抗胰蛋白酶(AAT)對(duì)豚鼠皮膚光老化的治療作用并檢測皮膚組織中抗氧化物的變化。方法 60只健康雌性豚鼠隨機(jī)分為空白組(SC)、預(yù)防治療組(Pre)和模型組(MC)，建立光老化模型，Pre組造模同時(shí)給予AAT預(yù)防治療。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒檢測皮膚組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、羥脯氨酸(Hyp)、丙二醛(MDA)的含量。結(jié)果 與SC組相比，MC組皮膚組織中MDA 含量明顯增多，GSH-Px、SOD 活力及Hyp含量降低(P<0.05)；與MC組相比，AAT治療后MDA 減少，GSH-Px、SOD活力及Hyp含量增加(P<0.05)。結(jié)論 AAT可延緩和治療豚鼠皮膚光老化，其作用機(jī)制可能與提高老化皮膚組織中抗氧化物含量并抑制氧化還原反應(yīng)有關(guān)。

皮膚光老化；α1抗胰蛋白酶(AAT)；抗氧化物

皮膚光老化是指暴露部位皮膚由環(huán)境因素如紫外線輻射、風(fēng)吹、日曬及接觸有害化學(xué)物質(zhì)等引起的急、慢性損傷，而紫外線是最重要的影響因素〔1〕。皮膚光老化的臨床表現(xiàn)包括暴露部位皮膚皺紋、色素沉著、皮膚粗糙、干燥脫屑、膚色灰黃、毛細(xì)血管擴(kuò)張、皮革樣外觀等，嚴(yán)重的可引起癌前病變，甚至皮膚惡性腫瘤〔2～4〕。大量研究證實(shí)α1抗胰蛋白酶(AAT)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有抗感染、調(diào)節(jié)免疫、抑制細(xì)胞凋亡、維系人體生理循環(huán)等作用，但在皮膚光老化中的應(yīng)用報(bào)道極少。本實(shí)驗(yàn)旨在探討AAT對(duì)皮膚光老化的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 白色健康雌性豚鼠60只，體重(220±20)g，長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 試劑 甲氧沙林溶液(邦力)：重慶華邦制藥有限公司；AAT：佛羅里達(dá)大學(xué)藥學(xué)院提供；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、羥脯氨酸(Hyp)、丙二醛(MDA)試劑盒：購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 建立豚鼠皮膚光老化模型及分組 60只豚鼠隨機(jī)分為空白組(SC)和模型組(MC)，應(yīng)用甲氧沙林聯(lián)合UVA+UVB造模。MC組中隨機(jī)選取6只為預(yù)防治療組(Pre)，造模同時(shí)給予AAT 20 mg/只預(yù)防治療。造模成功后隨機(jī)分為陽性組(Pos)、外用高(EH)、低劑量組(EL)、腹腔注射高(IH)、低劑量組(IL)、陰性對(duì)照組a(VC-a，腹腔注射鹽水)、陰性對(duì)照組b(VC-b，外用凝膠)，進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)治療。治療2 w后觀察各組豚鼠皮膚外觀變化。

1.2.2 檢測組織中抗氧化酶活性和MDA含量 治療結(jié)束，將動(dòng)物處死，取照射區(qū)新鮮皮膚組織制成10%組織勻漿，離心提取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分別測SOD、GSH-Px、Hyp、MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件行ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同干預(yù)治療后大體及病理變化 AAT治療后，各組皺紋、皮屑、色素沉著等均有所改善。Pre、IH組皺紋明顯淡化，無明顯靜態(tài)皺紋，無皮屑及色素沉著；HE染色皮膚略增厚。IL組皺紋也明顯變淺，僅見少量細(xì)小靜態(tài)周圍，有極少量皮屑和輕度色素沉著；HE染色見皮膚較IH組厚，皮膚結(jié)構(gòu)完整，纖維組織排列不規(guī)則，有少量炎癥細(xì)胞浸潤。Pos組暴露部位皮膚淺在靜態(tài)皺紋，僅有少量皮屑，色素沉著不明顯；HE染色見皮膚較SC組增厚，結(jié)構(gòu)稍有異常，纖維組織排列部分不規(guī)則，有少量炎癥細(xì)胞浸潤。VC-a、VC-b組皮膚有明顯靜態(tài)皺紋，大量皮屑，色素沉著明顯，皮膚彈性差，缺乏光澤；HE染色見皮膚明顯增厚，纖維組織排列紊亂，有炎細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.2 AAT對(duì)皮膚組織中抗氧化酶活力的影響 與SC組相比，MC組SOD、GSH-Px、Hyp均下降(P<0.05)。而與MC組相比，治療組(包括AAT預(yù)防治療、AAT腹腔注射、AAT外用、維甲酸治療)SOD、GSH-Px、Hyp均升高(P<0.05)。相同劑量AAT治療(包括預(yù)防治療、腹腔注射高劑量、外用高劑量)后SOD、GSH-Px、Hyp的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AAT高劑量組(包括腹腔注射和外用)組織中SOD、GSH-Px、Hyp的變化較低劑量組(包括腹腔注射和外用)明顯(P<0.05)。與陽性組相比，AAT高劑量組(包括腹腔注射和外用)中SOD、GSH-Px、Hyp變化明顯(P<0.05)。 見表1。

2.3 AAT對(duì)皮膚組織中MDA的影響 與SC組相比，MC組MDA升高(P<0.05)，而與MC組相比，治療組(包括AAT預(yù)防治療、AAT腹腔注射、AAT外用、維甲酸治療)MDA降低(P<0.05)。相同劑量AAT治療(包括預(yù)防治療、腹腔注射高劑量、外用高劑量)后MDA的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AAT高劑量組(包括腹腔注射和外用)MDA的變化較低劑量組(包括腹腔注射和外用)明顯(P<0.05)。與陽性組相比，AAT高劑量組(包括腹腔注射和外用)中MDA變化明顯(P<0.05)。見表1。

圖1 不同組治療后病理變化(HE染色)

組別SOD(U/mg)GSH-Px(U/mg)Hyp(μg/mg)MDA(nmol/mg)SC35.78±2.841)208.30±13.221)6.35±0.991)10.58±1.371)MC10.51±1.77105.21±9.963.62±0.9321.94±4.96Pre35.19±3.301)196.62±13.881)5.69±1.291)12.27±3.501)IH34.96±3.331)2)4)178.26±17.461)2)4)5.81±1.771)2)4)13.37±2.011)2)4)IL21.94±3.711)158.68±17.891)4.46±1.291)18.74±3.191)EH34.73±4.291)2)4)179.91±22.171)2)4)5.38±1.491)2)4)13.82±4.761)2)4)EL22.23±3.461)153.50±21.701)4.05±1.101)18.11±3.921)Pos29.00±4.921)170.52±20.531)4.81±1.331)16.88±2.981)VC-a10.78±2.91105.08±12.444.00±1.1620.85±1.84VC-b10.44±2.33104.75±10.603.70±0.9320.79±4.78

與MC組比較：1)P<0.05，與IL組比較：2)P<0.05；與EL組比較：3)P<0.05；與POS組比較：4)P<0.05

3 討 論

皮膚光老化多由過度紫外線照射引起氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致，而人體皮膚有復(fù)雜的內(nèi)源性抗氧化防御體系來對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。一般情況下，內(nèi)源性抗氧化酶(SOD、GSH-Px等)能夠有效地清除紫外線照射產(chǎn)生的自由基，以保護(hù)皮膚組織。但是，過度或長期暴露于紫外線中，組織內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，超過皮膚內(nèi)源性抗氧化能力，造成組織代謝紊亂，結(jié)構(gòu)破壞，最終皮膚表現(xiàn)出光老化癥狀，故提高抗氧化物活力是目前延緩皮膚老化的有效方法。

過量的自由基使皮膚組織中抗氧化體系破壞，導(dǎo)致氧化性損傷，使抗氧化酶活性下降及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物堆積；大量自由基還可破壞DNA結(jié)構(gòu)，使DNA鏈斷裂、堿基氧化〔5，6〕。SOD可以有效清除機(jī)體內(nèi)的自由基，防止或減輕自由基對(duì)機(jī)體的損傷，GSH-Px的活力是衡量機(jī)體抗氧化水平的重要指標(biāo)。Hyp含量可推斷皮膚老化程度〔7〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了光老化皮膚組織中抗氧化物含量減少，AAT可增加機(jī)體抗氧化反應(yīng)的能力。MDA含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度，間接反映細(xì)胞受損程度。紫外線照射通過催化脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引起MDA增加，AAT治療組后MDA含量明顯減少，可推斷AAT有抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用。AAT是分子量為52 kD的單鏈糖蛋白，能抑制多種絲氨酸內(nèi)切肽酶如彈性蛋白酶、胰蛋白酶、血漿素、凝血酶等蛋白酶的活性，以保護(hù)正常細(xì)胞和器官不受蛋白酶的損傷，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡。AAT還可通過與組織中性粒細(xì)胞相互作用，抑制活性氧的產(chǎn)生，起到抗炎作用〔8〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了AAT易被吸收，給藥途徑不影響其吸收效果，且AAT的治療效果在一定濃度范圍內(nèi)與濃度相關(guān)。

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7 Feng Y，Xu J，Qin Z，etal.Alpha-1 antitrypsin prevents the development of preeclampsia through suppression of oxidative stress〔J〕.Front Physiol，2016;7(119).

8 Bergin DA，Hurley K，Mcelvaney NG，etal.Alpha-1 antitrypsin: a potent anti-inflammatory and potential novel therapeutic agent〔J〕.Arch Immunol Et Ther Exp，2012;60(2):81-97.

〔2016-10-20修回〕

(編輯 曲 莉)

吉林省省級(jí)經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)戰(zhàn)略調(diào)整引導(dǎo)資金專項(xiàng)項(xiàng)目(No.2015Y030-1)； 吉林省科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.20140204021YY)

姚春麗(1970-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事皮膚外科疾病研究。

秦 錚(1990-)，女，在讀碩士，主要從事皮膚外科疾病研究。

R332

A

1005-9202(2016)23-5827-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.023