許 麗， 梁 文， 李 妍， 任淑貞， 劉 剛

(上海市計量測試技術(shù)研究院 化學(xué)與電離輻射計量技術(shù)研究所， 上海 201203)

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·實驗技術(shù)·

4種阪崎腸桿菌檢測質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

許 麗， 梁 文， 李 妍， 任淑貞， 劉 剛

(上海市計量測試技術(shù)研究院 化學(xué)與電離輻射計量技術(shù)研究所， 上海 201203)

實時熒光定量(PCR)方法已成為阪崎腸桿菌的可靠檢測方法。為了保證該方法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可比性，研制了4種質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其分別含有一種阪崎腸桿菌PCR檢測靶基因(MMS, ITS, 16S rDNA, ompA)。采用紫外分光光度法(UV)和高分辨電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HR-ICP-MS)對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值，對該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性進(jìn)行了評估，并對定值不確定度進(jìn)行了評定。結(jié)果顯示,4種質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值可靠，均勻性和穩(wěn)定性良好，可以在-20℃下保存1 a以上。4種質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的最終定值結(jié)果為(52.3±1.8)、(62.4±2.1)、(75.1±2.1)和(85.7±2.6)ng/μL(k=2)。對質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與阪崎腸桿菌基因組DNA的可替代性進(jìn)行了研究，證明研制的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以替代阪崎腸桿菌基因組DNA對阪崎腸桿菌進(jìn)行檢測，滿足阪崎腸桿菌檢測實驗室質(zhì)量控制和方法驗證的需求。

質(zhì)粒DNA; 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì); 實時熒光; 阪崎腸桿菌

0 引 言

目前,嬰兒配方奶粉廣泛使用，因此其安全性至關(guān)重要。阪崎腸桿菌(Cronobacterspp.，Enterobactersakazakii)是在乳制品中發(fā)現(xiàn)的一種致病菌[1-2]，由于其能污染嬰兒配方奶粉而導(dǎo)致嬰兒及早產(chǎn)兒腦膜炎、敗血癥和壞死性小腸結(jié)腸炎，死亡率高，故已引起多國相關(guān)部門的重視[3]。

傳統(tǒng)的阪崎腸桿菌檢測方法[3]依賴于生化與形態(tài)學(xué)特點，檢測周期較長，操作比較復(fù)雜，結(jié)果準(zhǔn)確性差。因此新型快速高準(zhǔn)確性的方法發(fā)展迅速，其中最重要的就是實時熒光定量PCR方法(QPCR)。由于其快速、靈敏、特異的特性，因此已經(jīng)成為食源性病原微生物的可靠檢測方法[4]。目前最常被用作PCR靶基因的有4個基因：大分子合成操縱子(MMS)基因[5]、16S rDNA基因[6]、16S～23S rDNA 間區(qū)(ITS)序列[7]和外膜蛋白A基因(ompA)[8]。

為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可比性，使用具有準(zhǔn)確量值、穩(wěn)定、均勻的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(RMs)就顯得非常重要。受到生物定量過程量值溯源整體水平的限制，目前可用于QPCR方法的DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還非常缺乏，影響了實驗室的結(jié)果確認(rèn)、能力驗證的活動。質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[9-10]是一種新興的生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具有純度高、穩(wěn)定性好以及研制成本低的優(yōu)點，不僅可以用作PCR定性陽性對照，也可以用作PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品，被認(rèn)為將在基因檢測量值溯源過程中起到關(guān)鍵作用。本文針對阪崎腸桿菌QPCR檢測質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的現(xiàn)狀，研制了4種質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每一個都含有一種阪崎腸桿菌PCR檢測靶基因(MMS, ITS, 16S rDNA, ompA)，對該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性進(jìn)行評估，并對定值不確定度進(jìn)行了評定。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

試劑：限制性內(nèi)切酶、全基因人工合成等(寶生物工程有限公司)；引物探針合成、Master Mix(Life technologies)；DNA測序(北京六合華大基因科技股份有限公司、上海博尚生物技術(shù)有限公司、上海英濰捷基貿(mào)易有限公司、上海杰李生物技術(shù)有限公司、上海美吉生物技術(shù)有限公司、上海生工生物技術(shù)有限公司、蘇州金唯智生物科技有限公司、寶生物生物工程有限公司)。實驗中用到的引物和探針序列見表1。

儀器：快速梯度PCR儀(Bio-rad)；實時熒光定量PCR儀(Life technologies)；微量核酸蛋白定量儀(nanodrop2000)；高分辨電感耦合等離子體質(zhì)譜(Thermo Element 2)。

表1 實驗中的引物和探針序列

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

在數(shù)據(jù)庫中檢索阪崎腸桿菌4個目標(biāo)基因(MMS, ITS, 16S rDNA, ompA)序列。序列經(jīng)軟件分析后在5′端和3′端加上合適的限制性內(nèi)切酶位點。將修改后的序列進(jìn)行人工合成，并插入到克隆載體pUC19上，形成4個重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒再經(jīng)提取和純化。提取后的4個質(zhì)粒經(jīng)測序進(jìn)行測序驗證，確認(rèn)4個靶基因序列被正確克隆。

1.3 質(zhì)粒純度檢測

(1) 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。根據(jù)圖譜中有無其他雜帶來判斷核酸純度。具體方法：將4種質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SalI消化成線性片段后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。取10 μL酶切液上樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80～100 V，30 min，電泳完成后進(jìn)行EB染色，凝膠成像分析DNA條帶，觀察條帶是否單一。

(2) 紫外分光光度法鑒定。通過測出樣品在260、280、230 nm波段的紫外光下的吸光度值(A260、A280、A230)，從A260/A280和A260/A230的比值判斷樣品的純度。純DNA的A260/A280應(yīng)大于1.8，而A260/A230應(yīng)該達(dá)到2.0[11-12]。

1.4 質(zhì)粒定值方法

使用紫外分光光度法(UV)和高分辨電感耦合等離子體質(zhì)譜(HR-ICP-MS)多家實驗室聯(lián)合定值的方法對質(zhì)粒進(jìn)行定值。共有9家單位參與該套標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值，其中8家采用UV法，1家采用HR-ICP-MS法。

UV：基于Beer-Lamber定律[13]，用超純水做空白對照，通過測定質(zhì)粒溶液在260 nm處的吸光值即可換算出質(zhì)粒濃度。DNA樣品的濃度為OD260核酸稀釋倍數(shù)×酸稀，濃度單位ng/μL。

HR-ICP-MS：該方法是一種基于DNA分子中的磷含量對DNA定量的重要方法14]。對于DNA分子來說，磷元素含量是一個確定的值，由DNA長度和序列決定[11]。因此，只要通過HR-ICP-MS檢測出DNA溶液中的磷含量，就可以通過下式計算出質(zhì)粒濃度：

其中:c為質(zhì)粒濃度;cp為檢測得出的磷含量;P為質(zhì)粒DNA分子的磷含量。定量前，質(zhì)粒溶液的純度必須進(jìn)行充分證實，以排除其他磷元素的干擾。

1.5 均勻性檢驗

使用UV法對質(zhì)粒DNA物質(zhì)的均勻性進(jìn)行檢驗，同時考察質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的瓶內(nèi)均勻性和瓶間均勻性。按照《JJG1006-1994一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》[15]均勻性抽取樣品要求抽取樣品。

瓶內(nèi)均勻性檢測方法：隨機(jī)抽取一管質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將樣品管按取樣位置分上層，中層，下層3個子樣，各抽取3個樣本，每個1 μL，共9個樣本。UV檢測，并按照方差分析法(F-檢驗法)[16]對該質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行瓶內(nèi)均勻性進(jìn)行評價。

瓶間均勻性檢測方法：從質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取15瓶；對所取每個樣品取樣3次，每次取樣量為1 μL。每個取樣量用UV重復(fù)測定3次，取平均值； 對測定結(jié)果用方差分析法(F-檢驗法)進(jìn)行統(tǒng)計，判斷均勻性檢驗結(jié)果。

1.6 穩(wěn)定性考察

使用UV法對質(zhì)粒DNA物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，包括短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性：短期穩(wěn)定性考察采用同步穩(wěn)定性研究，即使所有穩(wěn)定性研究的測量能在重復(fù)性條件下進(jìn)行，一次測量做一次校準(zhǔn)。實驗?zāi)M樣品在運(yùn)輸中可能遇到的條件，將制備的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)放置在室溫20℃和4℃下，進(jìn)行測試考察短期穩(wěn)定性，每個樣品重復(fù)測定3次。

長期穩(wěn)定性考察采用經(jīng)典穩(wěn)定性，即同時制備的樣品在相同條件下隨著時間的推移進(jìn)行測量。分別在樣品制備完成后1、2、3、4、6、8、10、12個月對制備的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)隨機(jī)抽取3瓶，每個樣品重復(fù)測定3次，進(jìn)行長期穩(wěn)定性考察。

1.7 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與阪崎腸桿菌基因組DNA的可替代性

為證明質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以替代阪崎腸桿菌基因組DNA進(jìn)行QPCR擴(kuò)增，分別以梯度稀釋的阪崎腸桿菌基因組DNA和質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，各制作6條標(biāo)準(zhǔn)曲線，對各標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)、斜率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以確定兩者之間不存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 4個質(zhì)粒的構(gòu)建

4個DNA片段(MMS、ITS、16S rRNA、ompA)被成功合成，并插入到克隆載體和pUC19上，形成4個重組質(zhì)粒，命名為pXL04、 pXL05、pXL06、pXL07。4個質(zhì)粒經(jīng)提取和純化后，經(jīng)8家生物測序公司測序確認(rèn)，重組質(zhì)粒中的外源插入片段序列正確率為100%，符合預(yù)期。

2.2 質(zhì)粒純度檢測

4個質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalI消化成線性片段后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見圖1。電泳結(jié)果顯示,DNA條帶清晰單一，無其他DNA存在，并無RNA、蛋白質(zhì)污染，證明4個質(zhì)粒的純度優(yōu)良。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

泳道M—DNA marker, 泳道1—pXL04, 泳道2—pXL05,泳道3—pXL06, 泳道 4—pXL07

另外,通過UV法測定了4個質(zhì)粒的A260、A280和A230(見表2)。結(jié)果顯示各質(zhì)粒A260/A280比值均超過1.8，A260/A230比值均超過2.0。因此可以證明4個質(zhì)粒溶液中沒有乙醇、蛋白質(zhì)或RNA污染。

表2 紫外檢測結(jié)果

2.3 均勻性檢驗

采用UV法，以質(zhì)粒濃度為主要量值，以1 μL為最小取樣量，采用方差分析法對4個質(zhì)粒進(jìn)行瓶內(nèi)均勻性和瓶間均勻性檢驗。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，在95%置信水平下，F(xiàn)檢驗值小于F臨界值，表明4個質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)符合《JJG1006-94 一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》均勻檢驗合格要求。具體統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表3、4。

2.4 穩(wěn)定性考察

采用同步穩(wěn)定性研究，利用UV法對質(zhì)粒在室溫20℃和4℃下的短期穩(wěn)定性進(jìn)行了跟蹤考察。結(jié)果表明各質(zhì)粒在20℃及4℃條件下可以穩(wěn)定保存10 d。

采用經(jīng)典穩(wěn)定性研究對質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長期穩(wěn)定性進(jìn)行考察，結(jié)果表明各質(zhì)?？梢栽?20℃條件下穩(wěn)定保存12個月。長期穩(wěn)定性考察結(jié)果見圖2。

表3 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)瓶內(nèi)均勻性統(tǒng)計結(jié)果

表4 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)瓶間均勻性統(tǒng)計結(jié)果

圖2 4個質(zhì)粒的長期穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.5 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值和不確定度評估

4種質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用9家實驗室協(xié)同定值，匯總?cè)吭紨?shù)據(jù)后經(jīng)統(tǒng)計檢驗確認(rèn)各組數(shù)據(jù)無離群值、各組數(shù)據(jù)等精度、每組數(shù)據(jù)的平均值之間不存在顯著性差異后，取9家實驗室檢測結(jié)果的平均值為各質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值。

質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度來源由三部分組成:① 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性引起的不確定度；② 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在有效期內(nèi)的變動性引起的不確定度；③ 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程帶來的不確定度，包括數(shù)據(jù)統(tǒng)計引入的不確定度和通過對定值方法中測量影響因素進(jìn)行分析評定的不確定度。對以上三部分的不確定度分別進(jìn)行評估，再將三部分的不確定度進(jìn)行合成，得到最終質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度度。將質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值標(biāo)準(zhǔn)值的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子k(對應(yīng)置信概率95%，取k=2)，即為質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值標(biāo)準(zhǔn)值的擴(kuò)展不確定度。各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果見表5。

2.6 QPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將研制的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為工作標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用于QPCR檢測：梯度稀釋質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板進(jìn)行QPCR分析。各引物和探針序列見表1。每個反應(yīng)重復(fù)3次，根據(jù)不同濃度模板擴(kuò)增的Ct值與濃度之間的關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)。各標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99，線性良好，表明質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)pXL04～pXL07適用于QPCR檢測，可作為QPCR擴(kuò)增目前阪崎腸桿菌檢測常用的靶基因序列的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

表5 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果

圖3 以各質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與阪崎腸桿菌基因組DNA的可替代性

分別以梯度稀釋的阪崎腸桿菌基因組DNA和質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每條標(biāo)準(zhǔn)曲線重復(fù)6次，對各標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)、斜率進(jìn)行統(tǒng)計分析(F-檢驗)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2表明了標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)擬合度，斜率代表了PCR擴(kuò)增的效率。通過F-檢驗證明,基因組DNA建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線與質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線之間在95%的置信水平?jīng)]有顯著性差異(F值<臨界F值)，證明了以基因組DNA和質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合性很好。因此認(rèn)為本研究中的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以替代阪崎腸桿菌基因組DNA對阪崎腸桿菌進(jìn)行檢測。

3 結(jié) 語

本文研制的阪崎腸桿菌檢測質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，序列正確，純度良好，均勻性、穩(wěn)定性滿足《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》要求，可替代阪崎腸桿菌基因組DNA用于MMS、ITS、16S rDNA、ompA基因的PCR擴(kuò)增。該質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制為阪崎腸桿菌PCR相關(guān)檢測提供了量值溯源的依據(jù)，為阪崎腸桿菌檢測實驗室質(zhì)量控制提供有力保障。通過相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在我國阪崎腸桿菌檢驗實驗室的推廣應(yīng)用，能夠進(jìn)一步提高阪崎腸桿菌檢驗實驗室相關(guān)項目的檢測水平，保障各實驗室測量結(jié)果的可比性、準(zhǔn)確性，實現(xiàn)檢測互認(rèn)，有效解決檢測能力快速發(fā)展與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的矛盾。

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Development of Four Plasmid DNA Reference Materials forCronobacterspp. Detection

XULi,LIANGWen,LIYan,RENShu-zhen,LIUGang

(Chemical and Ionizing Radiation Metrology Institute, Shanghai Institute of Measurement and Testing Technology，Shanghai 201203, China)

Real-time quantitative PCR has become a reliable method to detectCronobacterspp. FourCronobacterspp. related plasmid DNA reference materials (RMs) were designed to contain respectively one of four main PCR target genes (MMS, ITS, 16S rDNA, ompA). RMs are commonly used in PCR-based detection ofCronobacterspp. All RMs were analyzed by both high resolution inductively coupled plasma mass spectrometry (HR-ICP-MS) and ultraviolet spectrophotometry (UV). Nine different laboratories participated in the quantification of the RMs，and the uncertainties of these quantification results were evaluated. The analysis results demonstrated that the four reference materials were homogeneous and stable for at least one year under -20℃ storage. The certified value and expanded uncertainty of the reference materials were as follows: (52.3±1.8), (62.4±2.1), (75.1±2.1) and (85.7±2.6)ng/μL, respectively (k=2). The perfect substitutability ofCronobacterspp. genomic DNA shows that the four RMs can replace theCronobacterspp. genomic DNA in quality control of real-time PCR detection. The development of the four RMs has provided scientific basis for the traceability of value ofCronobacterspp. real-time PCR detection.

plasmid DNA; reference material; real-time PCR;Cronobacterspp.

2015-08-06

國家自然科學(xué)青年基金項目(21305091);國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2012QK273);國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(201310016);國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2014QK141);上海市自然科學(xué)基金青年基金(12ZR1448300);上海市科委科研計劃項目(13QB1402900)

許 麗(1986-)，女，安徽馬鞍山人，工程師，現(xiàn)主要從事生物計量研究。Tel.:021-38839800*35350; E-mail:xuli@simt.com.cn

Q 819

A

1006-7167(2016)03-0004-05