于鵬程，閆江泓，吳未辰，由淑貞，陶曉燕，朱武洋，紀(jì) 軍△

(1.中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206；2.北京博雅晟康醫(yī)學(xué)科技有限公司 100872)

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·臨床研究·

狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒的效果評價*

于鵬程1，閆江泓1，吳未辰1，由淑貞2，陶曉燕1，朱武洋1，紀(jì) 軍2△

(1.中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206；2.北京博雅晟康醫(yī)學(xué)科技有限公司 100872)

目的 應(yīng)用快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)對狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒的檢測效果進(jìn)行評價。方法 用RFFIT和狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒分別對135份人血清和164份動物血清進(jìn)行狂犬病病毒中和抗體(RVNA)效價檢測，應(yīng)用SPSS22.0分析兩種檢測方法所得結(jié)果的相關(guān)性和一致性。結(jié)果 兩種方法所得結(jié)果的陽性檢出符合率為99.33%(297/299)；兩種方法對動物血清和人血清的檢測結(jié)果之間有較好的直線相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.897和0.941；同一份標(biāo)本的重復(fù)性檢驗顯示，試劑盒檢測方法具有較好的穩(wěn)定性。結(jié)論 狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒可以用于人和動物血清狂犬病病毒中和抗體的檢測。

狂犬病病毒； 中和抗體； 快速熒光灶抑制試驗

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種人獸共患傳染病，病死率幾乎100%。中國是狂犬病的高發(fā)區(qū)，目前每年仍有近千人死于狂犬病。疫苗免疫接種是預(yù)防該病發(fā)生的唯一途徑，按世界衛(wèi)生組織(WHO)及國際獸疫局(OIE)的要求，人或動物接種狂犬病疫苗后，需測定其血清內(nèi)的抗狂犬病病毒中和抗體效價，不低于 0.5 IU/mL時，方可認(rèn)為達(dá)到有效保護(hù)，否則應(yīng)予加強(qiáng)免疫，直至達(dá)到保護(hù)水平[1-2]?？焖贌晒庠钜种圃囼?RFFIT)是WHO推薦的檢測狂犬病病毒中和抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法，也是2015年版《中華人民共和國藥典》第四部規(guī)定的檢測人免疫球蛋白效價的標(biāo)準(zhǔn)方法。北京博雅晟康醫(yī)學(xué)科技有限公司研制的狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒以RFFIT為基礎(chǔ)，以自主制備的FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白熒光抗體為亮點，可應(yīng)用于人和動物血清狂犬病病毒中和抗體效價的檢測。商品化試劑盒可解決RFFIT操作中熒光抗體、CVS毒株及所用BSR細(xì)胞株的標(biāo)準(zhǔn)化問題，有利于RFFIT的推廣使用，但其檢測效能需要進(jìn)一步評價。鑒于此，本研究分別以人和動物臨床血清標(biāo)本為檢測對象，運(yùn)用本科室所建立的標(biāo)準(zhǔn)RFFIT對該狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒的檢測效果進(jìn)行評價。

1 資料與方法

1.1 材料來源 動物血清為鼠血清，共164份，為狂犬病疫苗免疫前或免疫后采集的試驗標(biāo)本，由本實驗室保存并提供。人血清135份，為狂犬病疫苗免疫前或免疫后采集的標(biāo)本，由本實驗室保存并提供。

1.2 儀器與試劑 RFFIT所用試劑：DMEM高糖培養(yǎng)液、胰酶、雙抗、胎牛血清均購自Gibico公司；抗狂犬病病毒核蛋白熒光抗體，購自美國FDI Fujirebio Diagnostics公司；倒置顯微鏡為日本奧林巴斯CXX41型；熒光顯微鏡為日本奧林巴斯IX51型。狂犬病毒CVS-11標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株，由本實驗室(中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所狂犬病室)保存；BSR細(xì)胞，為倉鼠腎細(xì)胞BHK-21的克隆，由本實驗室保存。WHO標(biāo)準(zhǔn)品效價為30 IU/mL，購自英國國立生物制品和控制標(biāo)準(zhǔn)品研究所。狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒由北京博雅晟康醫(yī)學(xué)科技有限公司提供。

1.3 方法 RFFIT方法操作程序：將待測血清于56 ℃滅活30 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于96孔板做3倍系列稀釋；標(biāo)準(zhǔn)血清、強(qiáng)陽性血清、弱陽性血清和陰性血清用同樣方法進(jìn)行系列稀釋；病毒對照孔做連續(xù)的倍比稀釋；除病毒對照孔外，其他各孔均加入50 μL最適攻擊量病毒，于37 ℃ 5% CO2孵箱孵育1 h進(jìn)行中和后，每孔加入50 μL濃度為 1×106cells/mL 的細(xì)胞懸液；于37 ℃ 5% CO2孵箱孵育24 h。將96孔板從孵箱內(nèi)取出，于P2實驗室安全柜內(nèi)，丟棄培養(yǎng)上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)液洗1遍；用80%冷丙酮4 ℃固定30 min；將丙酮棄去，加入50 μL抗狂犬病毒核蛋白熒光抗體染色液，37 ℃孵育 30 min后用PBS液洗3遍；加入60%甘油，在熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光灶讀數(shù)。以應(yīng)用軟件 Microsoft Excel為基礎(chǔ)，根據(jù)操作程序中確定的稀釋梯度，結(jié)合Reed & Muench法公式，以血清標(biāo)準(zhǔn)品滴度為參照系數(shù)，被測標(biāo)本50%感染孔前后稀釋倍數(shù)為變量的中和抗體滴度計算公式計算中和抗體滴度。應(yīng)用狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒進(jìn)行平行檢測時嚴(yán)格遵守試劑盒的操作規(guī)程。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)一的Excel記錄標(biāo)本的檢測信息，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行檢測結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析，包括兩種檢測方法所得檢測結(jié)果的陽性檢出符合率的比較、相關(guān)性分析以及重復(fù)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 陽性檢出符合率分析 按照達(dá)到或超過0.5 IU/mL者為陽性結(jié)果，低于0.5 IU/mL者為陰性結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計和計算。全部299份標(biāo)本中，兩種檢測方法的陽性檢出符合率為99.33%(297/299)。

2.2 檢測結(jié)果相關(guān)性分析 對164份動物血清和135份人血清分別采用兩種檢測方法進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行回歸分析。針對動物血清標(biāo)本，兩種方法的檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(R=0.897，P<0.01)，但二者直線相關(guān)關(guān)系良好(R2=0.804)(圖1)。針對人血清標(biāo)本，兩種方法的檢測結(jié)果具有更好的直線相關(guān)關(guān)系(R2=0.886)(圖2)。

圖1 動物血清檢測結(jié)果的相關(guān)性分析

圖2 人血清檢測結(jié)果相關(guān)性分析

圖3 兩種方法檢測結(jié)果的重復(fù)性比較

2.3 檢測試劑盒穩(wěn)定性分析對同一血清標(biāo)本分別采用RFFIT方法和狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒兩種方法進(jìn)行檢測12次。RFFIT的檢測值在1.32～2.06 IU/mL，最大差值0.74 IU/mL，GMT=1.58 IU/mL，SD=0.20；狂犬病中和抗體檢測試劑盒的檢測值在1.32～2.09 IU/mL，最大差值0.77 IU/mL，GMT=1.57 IU/mL，SD=0.25(圖3)。該結(jié)果顯示，中和抗體檢測試劑盒具有良好的穩(wěn)定性。

3 討 論

目前，WHO 和 OIE 推薦的應(yīng)用于狂犬病病毒中和抗體檢測的方法主要有小鼠中和試驗(MNT)、RFFIT和狂犬病病毒熒光抗體中和試驗(FAVN)；2016版《狂犬病預(yù)防控制技術(shù)指南》、2014版《狂犬病監(jiān)測方案》及2009版《狂犬病暴露預(yù)防處置工作規(guī)范》明確指出，如需檢測狂犬病酶中和抗體水平，應(yīng)當(dāng)采取中和實驗進(jìn)行檢測，主要包括RFFIT及MNT 兩種方法。本實驗室于2009年建立RFFIT方法至今，已檢測上萬份人或動物血清標(biāo)本，以往實驗結(jié)果證明，本實驗室的RFFIT方法具有良好的穩(wěn)定性、敏感性及重復(fù)性[3]。但由于RFFIT需要使用狂犬病固定毒株CVS-11，以及價格昂貴的FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白熒光抗體，因此即便每年的《狂犬病監(jiān)測與檢測培訓(xùn)班》均會對該方法進(jìn)行培訓(xùn)與推廣，但僅有少數(shù)幾家省級疾控中心能建成該實驗方法并進(jìn)行應(yīng)用。為此，國內(nèi)外部分機(jī)構(gòu)和企業(yè)研制了狂犬病中和抗體或抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒、膠體金檢測試劑盒等[4-5]。但這些方法所包被的抗原多為狂犬病全病毒、狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白或者其他抗原成分，測定的抗體不只是狂犬病中和抗體，因此只能用于中和抗體的定性檢測。

狂犬病中和抗體檢測試劑盒在RFFIT原理上建立，自主制備FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白熒光抗體的狂犬病中和抗體檢測試劑盒。應(yīng)用RFFIT和狂犬病中和抗體試劑盒同時檢測人和動物血清標(biāo)本299份，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該試劑盒具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，能夠用于人和動物血清標(biāo)本狂犬病中和抗體的檢測。

[1]俞永新．狂犬病和狂犬病疫苗[M]．2版．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2009．

[2]WHO.WHO Expert Consultation on Rabies，second report[R].Geneva:2013.

[3]Yu P,Lv X,Shen X,et al.Establishment and preliminary application of a rapid fluorescent focus inhibition test(RFFIT) for rabies virus[J].Virol Sin,2013,28(4):223-227.

[4]呂新軍，王偉偉，李云云，等．采用快速熒光灶抑制試驗對一種狂犬病病毒抗體競爭性ELISA檢測法的評價[J]．國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，32(6)：640-641．

[5]范曉娟，李剛，邱文英，等．膠體金免疫層析檢測犬、貓抗狂犬病病毒IgG抗體的研究[J]．中國人獸共患病學(xué)報，2010，26(8)：753-757．

國家自然科學(xué)基金資助項目(31500152);國家科技支撐計劃資助項目(2014BAI13B04)；艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項資助項目(2014ZX10004-002)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.035

A

1673-4130(2016)23-3331-02

2016-06-13

2016-09-03)

△通訊作者，E-mail:boyask@bj_boyask.com。