楊 梅，李玉先（重慶市中醫(yī)院藥劑科，重慶 400011）

溫胃調腸顆粒對便秘型腸易激綜合征模型大鼠的改善作用及機制研究

楊 梅＊，李玉先（#重慶市中醫(yī)院藥劑科，重慶 400011）

目的：觀察溫胃調腸顆粒對便秘型腸易激綜合征（IBS-C）模型大鼠的改善作用，并探討其可能的作用機制。方法：將60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、莫沙必利組（陽性藥物，50 mg/kg）和溫胃調腸顆粒低、中、高劑量組（3、6、12 g/kg），每組10只。除正常組外，其余各組大鼠ig冰水混合物復制IBS-C模型。造模后，各給藥組大鼠ig相應藥物，正常組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。給藥結束后，測定大鼠24 h排便粒數(shù)、糞便含水率；采用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠血清中5-羥色胺（5-HT）和降鈣素基因相關肽（CGRP）的含量；分別采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應法和Western blot法測定大鼠結腸組織中5-羥色胺轉運蛋白（SERT）、CGRP mRNA及其蛋白表達水平。結果：與正常組比較，模型組大鼠24 h排便粒數(shù)、糞便含水率減少，血清中5-HT和CGRP含量增加，結腸組織中SERT和CGRP mRNA及其蛋白水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠上述指標均得到不同程度改善，除溫胃調腸顆粒低劑量組大鼠結腸組織SERT mRNA降低不顯著外，其余各組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結論：溫胃調腸顆粒可促進IBS-C模型大鼠的排便，改善便秘癥狀；其機制可能與降低血清和腸組織中5-HT、CGRP等神經(jīng)遞質的水平有關。

溫胃調腸顆粒；便秘型腸易激綜合征；排便；大鼠

腸易激綜合征（IBS）是指以腹痛或腹部不適并伴排便習慣改變和/或大便性狀異常的功能性腸病[1]，發(fā)病率較高，任何年齡階段均有可能發(fā)病，發(fā)病人群中以青、壯年居多，且女性的發(fā)病率高于男性[2]。該病的生理、病理學基礎包括腸道動力和腸道平滑肌功能障礙、內(nèi)臟感覺異常、精神心理因素及全腸道感染、小腸細菌過度生長或小腸細菌移位等[3]。就病因和發(fā)病機制而言，IBS是多因素疾病，且與胃腸動力、內(nèi)臟感知、心理因素、社會因素等都有關系[4]。雖有大量學者從不同方面對該病的病因和發(fā)病機制進行研究，但其發(fā)病機制至今尚未完全闡明。

化學藥多單一針對某一癥狀或某一靶點起效，治療IBS的效果不佳[5]，然而中藥在治療IBS方面有獨特優(yōu)勢。溫胃調腸顆粒為我院院內(nèi)制劑，主要由柴胡、陳皮、炙甘草、芍藥等藥材組成。臨床結果顯示，該制劑對IBS具有一定療效，且與治療IBS的常用化學藥相比，該藥效果更為顯著。在本研究中，筆者擬采用冰水誘導便秘型腸易激綜合征（IBS-C）大鼠模型，探討溫胃調腸顆粒對IBS-C模型大鼠的改善作用，并探討其可能的作用機制，為其臨床上用于治療IBS提供實驗支持。

1 材料

1.1 儀器

BSA124S分析天平（塞多利斯科儀器有限公司）；AFD9600實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）儀（杭州安杰思生物科技有限公司）；5300凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Multiskan FC酶標儀、MicroCL 17R高速低溫離心機（賽默飛世爾儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

溫胃調腸顆粒（重慶市中醫(yī)院自制，批號：20151009，規(guī)格：5 g/包）；枸櫞酸莫沙必利片（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：11080932，規(guī)格：5 mg/片）；5-羥色胺（5-HT）、降鈣素基因相關肽（CGRP）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20151119023、20151022760）；RT-PCR試劑盒（大連寶生物科技有限公司，批號：A650t-1）；實驗所用抗體均購自Santa Gruz Biotechnology公司；5-羥色胺轉運蛋白（SERT）、CGRP、GAPDH引物由南京巴傲得生物科技有限公司合成。

1.3 動物

SD大鼠60只，SPF級，♂，體質量（180±20）g，由昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司提供[許可證號：SCXK（蘇）2013-0030]。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只SD大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常組、模型組、莫沙必利組（陽性藥物，50 mg/kg，相當于人用量的10倍劑量）和溫胃調腸顆粒低、中、高劑量組（3、6、12 g/kg，相當于人用量的5、10、20倍劑量）。除正常組外，其余各組大鼠每天上午8：30開始ig冰水混合物2 ml，連續(xù)14 d，復制IBS-C模型[6]。造模期間大鼠正常喂水、喂食。造模結束后，各給藥組大鼠均按1 ml/100 g（溶劑為羧甲基纖維素鈉）ig相應藥物，每天1次，連續(xù)14 d；正常組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水。

2.2 大鼠排便情況測定

給藥14 d后，各組大鼠禁食12 h，正常組、模型組大鼠再次ig等體積生理鹽水，各給藥組大鼠按“2.1”項下方法再給藥1次，記錄每只大鼠的給藥時間。大鼠均單籠飼養(yǎng)，正常飲水、進食。記錄再次給藥后每只大鼠24 h內(nèi)的排便粒數(shù)。將各只大鼠的糞便收集至玻璃皿中，做好標記，稱質量并記錄。于105℃烘干糞便至恒質量，稱質量并記錄。計算糞便含水率[糞便含水率（%）＝（1－烘干后質量/烘干前質量）×100%]。

2.3 血清中5-HT、CGRP含量測定

采用ELISA法檢測血清中5-HT、CGRP含量。排便實驗結束后，于各組大鼠眼眶取血，并做好標記。待血液凝固后，離心吸取血清，按照相應試劑盒說明書操作測定各組大鼠血清中5-HT、CGRP含量。

2.4 結腸組織中SERT、CGRP mRNA水平測定

各組大鼠眼眶取血后，麻醉，仰臥位固定，解剖，取結腸組織，快速凍存于液氮中。各組隨機抽取3只大鼠的結腸組織，采用Trizol法提取其總RNA，然后按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄。以逆轉錄后cDNA為模版，按照RT-PCR試劑盒說明書進行RT-PCR試驗。引物序列：SERT上游引物序列為5′-CCATCAGCCCTCTGTTTCTC-3′、下游引物序列為5′-GGACGACATCCCTATGCAGT-3′，產(chǎn)物大小為397 bp；CGRP上游引物序列為5′-CTCTAGTGTCACTGCCCAGAA-3′，下游引物序列為5′-CTTCAGAGCCCACATTGGT-3′，產(chǎn)物大小為131 bp；GAPDH上游引物序列為5′-ACAGCAACTCCCATTCTT-3′，下游引物序列為5′-TCCAGGGTTTCTTACTCC-3′，產(chǎn)物大小為223 bp[7-9]。反應體系：2x SYBR Green混合物10 μl、上下游引物各1 μl、逆轉錄后的cDNA 1 μl、去離子水7 μl，體系共20 μl。PCR熱循環(huán)參數(shù)：95℃、5 min；然后兩步反應，即95℃、30 s，60℃、30 s，進行40個循環(huán)。于每個循環(huán)的第2步（即60℃、30 s）收集熒光信號，以2－ΔΔct法計算目的基因的相對定量。

2.5 結腸組織中5-HT、CGRP蛋白水平測定

采用Western blot法。各組隨機抽取3只大鼠的結腸組織，精密稱取50 mg加入EP管中，加入適量的含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，電動勻漿器勻漿，加入上樣緩沖液厚充分煮沸5 min。取樣本行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，然后電轉聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入GAPDH（內(nèi)參）、5-HT和CGRP一抗（1∶1 000），室溫孵育4 h。TBST緩沖液洗膜3次，加入第二抗體[小鼠抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體，1∶1 000]，室溫孵育2 h，再次用TBST緩沖液洗PVDF膜3次，顯影。使用Quantity One軟件測定蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊時采用t檢驗，方差不齊時采用Dunnett’T3檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 溫胃調腸顆粒對IBS-C模型大鼠排便的影響

與正常組比較，模型組大鼠24 h排便粒數(shù)顯著減少（P＜0.01），糞便濕質量、干質量以及含水率均顯著降低（P＜0.01），這說明IBS-C大鼠模型復制成功，出現(xiàn)了明顯的便秘癥狀。與模型組比較，莫沙必利組和溫胃調腸顆粒各劑量組大鼠24 h排便粒數(shù)顯著增多（P＜0.01），糞便濕質量、干質量以及含水率均顯著升高（P＜0.01），這說明溫胃調腸顆粒對IBS-C模型大鼠的治療作用顯著，測定結果詳見表1。

表1 各組大鼠24 h排便粒數(shù)和大便含水量測定結果（±s，n＝10）Tab 1 The results of 24 h dejection amounts and water content of manure in rat of each grou（p±s，n＝10）

表1 各組大鼠24 h排便粒數(shù)和大便含水量測定結果（±s，n＝10）Tab 1 The results of 24 h dejection amounts and water content of manure in rat of each grou（p±s，n＝10）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

組別正常組模型組莫沙必利組溫胃調腸顆粒低劑量組溫胃調腸顆粒中劑量組溫胃調腸顆粒高劑量組糞便粒數(shù)33.00±5.74 9.75±3.60＊＊37.17±5.89##23.00±5.36##26.17±6.38##31.33±7.85##糞便濕質量，g 8.94±2.66 3.23±1.42＊＊11.10±1.76##6.16±1.44##7.57±1.96##9.23±2.32##糞便干質量，g 4.01±1.21 1.98±0.87＊＊4.71±0.90##3.14±0.63##3.38±0.83##3.34±0.78##含水率，% 54.77±5.13 37.52±9.52＊＊56.17±12.88##48.22±7.10##54.68±7.56##61.16±14.26##

3.2 溫胃調腸顆粒對IBS-C模型大鼠血清中5-HT、CGRP含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中5-HT、CGRP含量均顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，莫沙必利組和溫胃調腸顆粒各劑量組大鼠血清中5-HT、CGRP含量均顯著減少（P＜0.01），測定結果詳見表2。

表2 各組大鼠血清中5-HT、CGRP含量測定結果（±s，n＝10）Tab 2 The results of serum 5-HT and CGRP level in rat of each grou（p±s，n＝10）

表2 各組大鼠血清中5-HT、CGRP含量測定結果（±s，n＝10）Tab 2 The results of serum 5-HT and CGRP level in rat of each grou（p±s，n＝10）

3.3 溫胃調腸顆粒對IBS-C模型大鼠結腸組織中SERT、CGRPmRNA及其蛋白水平的影響

組別正常組模型組莫沙必利組溫胃調腸顆粒低劑量組溫胃調腸顆粒中劑量組溫胃調腸顆粒高劑量組5-HT，μg/ml 25.95±3.11 40.40±4.86＊＊32.35±4.11##34.95±2.64##34.01±2.36##30.71±3.98##CGRP，ng/L 47.36±4.11 109.95±6.08＊＊89.73±15.02##101.29±5.46##90.71±3.70##83.40±4.86##

與正常組比較，模型大鼠結腸組織中SERT、CGRP mRNA及其蛋白水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，除溫胃調腸顆粒低劑量組大鼠結腸組織中SERT mRNA水平降低不顯著外，其余各組大鼠上述指標均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），測定結果詳見表3、圖1。

表3 各組大鼠結腸組織中SERT、CGRP mRNA及蛋白水平測定結果（±s，n＝3）Tab 3 mRNA and protein expression of SERT and CGRP in colon tissue of rats in each grou（p±s，n＝3）

表3 各組大鼠結腸組織中SERT、CGRP mRNA及蛋白水平測定結果（±s，n＝3）Tab 3 mRNA and protein expression of SERT and CGRP in colon tissue of rats in each grou（p±s，n＝3）

注：與正常組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組莫沙必利組溫胃調腸顆粒低劑量組溫胃調腸顆粒中劑量組溫胃調腸顆粒高劑量組SERT mRNA 1.00±0.00 3.67±2.00＊0.75±0.40#0.78±0.32 0.61±0.47#0.46±0.31#蛋白1.00±0.00 2.63±0.55＊＊1.37±0.10#1.31±0.24#1.30±0.21#1.29±0.23#CGRP mRNA 1.00±0.00 7.87±4.90＊1.20±1.17#1.90±1.65#1.54±0.83#1.15±1.04#蛋白1.00±0.00 2.10±0.23＊＊1.13±0.10##1.27±0.33#1.20±0.39#1.26±0.22#

圖1 各組大鼠結腸組織中SERT、CGRP蛋白表達電泳圖Fig 1 Electrophoretogram for protein expression of SERT and CGRPin colon tissue of rats in each group

4 討論

IBS癥狀的突發(fā)性、發(fā)病機制的復雜性以及影響因素的多樣性給動物模型的選擇和構建帶來了很多困難。針對IBS模型大鼠內(nèi)臟高敏感性、胃腸動力及內(nèi)分泌改變等主要特點，采用多種動物模型對藥物進行研究是較為可靠的。筆者在前期研究了溫胃調腸顆粒對多種不同胃腸不適模型動物的治療作用，包括阿托品負荷小鼠、新斯的明負荷小鼠、番瀉葉腹瀉小鼠、甲狀腺素便秘小鼠等。IBS是一種多癥狀疾病，為了體現(xiàn)中藥治療該類疾病的優(yōu)勢，筆者再次復制了冰水致IBS-C大鼠模型。IBS都會有腸道運動功能紊亂的癥狀，冰水致IBS-C大鼠模型后，大鼠糞便粒數(shù)和含水量均有減少，且腸道黏膜不出現(xiàn)病理性表現(xiàn)；通過直腸內(nèi)球囊擴張刺激評價腸道敏感性發(fā)現(xiàn)，腸道動力及敏感性發(fā)生了改變[10]。研究顯示，高、中、低劑量溫胃調腸顆粒均可促進模型大鼠的排便作用，且使干燥糞便的含水率升高。

5-HT是一種在體內(nèi)分布廣泛的神經(jīng)遞質，參與了消化道功能的調節(jié)，幾乎參與了所有類型IBS的病理、生理過程。5-HT水平的升高會提高內(nèi)臟神經(jīng)系統(tǒng)的敏感性，并激活多種神經(jīng)活性物質，使參與腦-腸調節(jié)的某些化學信號異常表達。此外，當5-HT與其各種受體結合時，會作用于IBS患者的腸道運動、感知及分泌系統(tǒng)，進而產(chǎn)生各種臨床癥狀[7-8]。莫沙必利是治療IBS-C的常用藥物，為選擇性5-HT受體激動藥，可以興奮胃腸道膽堿能中間神經(jīng)元及肌間神經(jīng)叢的5-HT受體，促進乙酰膽堿的釋放，促進胃腸運動，增強消化系統(tǒng)排空能力[9]，其功效和溫胃調腸顆粒比較相似，因此本研究選其作為陽性對照藥。

SERT廣泛存在于腸道、腦等器官的多種細胞（包括腸黏膜上皮細胞、腸嗜鉻細胞、神經(jīng)元和肥大細胞等）膜上的一種跨膜轉運蛋白，對5-HT有高度親和力。SERT基因轉錄水平的改變會影響SERT的數(shù)量及5-HT的重攝取，進而產(chǎn)生相應的臨床癥狀。本研究結果顯示，溫胃調腸顆?？梢燥@著降低冰水致IBS-C大鼠血清中5-HT含量和結腸組織中SERT mRNA及其蛋白表達水平，這說明受試藥物通過下調結腸組織中SERT基因及蛋白的表達，進而調節(jié)神經(jīng)遞質5-HT的水平，發(fā)揮了治療IBS-C的作用。CGRP是一種主要的炎癥促進型的感覺神經(jīng)肽，全身分布同樣廣泛，在結腸固有膜血管壁表達尤其豐富，且在腸壁各層均有分布，具有調節(jié)胃腸運動、血流及分泌的功能[11]。作為調節(jié)介質和神經(jīng)遞質的CGRP有促炎作用，能直接產(chǎn)生傷害作用，還參與內(nèi)臟傷害性遞質的傳遞[12-13]。本研究顯示，溫胃調腸顆?？梢燥@著降低冰水致IBS-C模型大鼠血清中CGRP含量以及結腸組織中mRNA及其蛋白的表達水平，這說明受試藥物也通過調節(jié)內(nèi)臟敏感性從而發(fā)揮對IBS-C大鼠的治療作用。

綜上所述，溫胃調腸顆?？娠@著調節(jié)冰水致IBS-C大鼠排便，改善便秘癥狀，其機制可能與降低血清和腸組織中5-HT、CGRP等神經(jīng)遞質的水平有關。本研究為該制劑的臨床應用提供了一定的實驗基礎。

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（編輯：林 靜）

Study on Improvement Effects of Wenwei Tiaochang Granule on Constipation-predominant Irritable Bowel Syndrome Model Rats and Its Mechanism

YANG Mei，LI Yuxian（Dept.of Pharmacy，Chongqing Hospital of TCM，Chongqing 400011，China）

OBJECTIVE：To observe the improvement effects of Wenwei tiaochang granule on constipation-predominant irritable bowel syndrome（IBS-C）model rats，and to discuss its mechanism.METHODS：60 SD rats were randomly divided into normal group，model group，mosapride group（positive drug，50 mg/kg）and Wenwei tiaochang granule low-dose，medium-dose and high-dose groups（3，6，12 g/kg），with 10 rats in each group.Except for normal group，other groups were given ice water mixture intragastrically to induce IBS-C model.After modeling，treatment groups were given relevant medicine intragastrically，and normal group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically，once a day，for consecutive 14 d.After medication，24 h dejection amounts and water rate of manure were measured.The serum contents of 5-HT and CGRP were determined by ELISA.RT-PCR and Western blot assay were used to determine mRNA and protein expression of SERT and CGRP in colon tissue.RESULTS：Compared with normal group，24 h dejection amounts and water rate of manure were decreased in model group，serum contents of 5-HT and CGRP were increased，and mRNA and protein expression of SERT and CGRP in colon tissue were also increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with model group，above indexes of treatment groups were all improved to different extent，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01），except the decrease of mRNA expression of SERT in colon tissue was not significant in Wenwei tiaochang granule low-dose group.CONCLUSIONS：Wenwei tiaochang granule can improve the dejection and symptoms of constipation in IBS-C model rats，which maybe associated with decreasing the levels of 5-HT，CGRP and other neurotransmitter in serum and intestinal tissue.

Wenwei tiaochang granule；Constipation-predominant irritable bowel syndrome；Dejection；Rat

R285

A

1001-0408（2016）34-4814-03

2016-05-31

2016-08-22）

＊主管中藥師。研究方向：中藥藥理學。電話：023-62610641。E-mail：184003642@qq.com

#通信作者：副主任藥師，碩士。研究方向：中藥藥理學。電話：023-63844465。E-mail：lyx531@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.19