繆明星，王 星，陸 琰，王 欣（.中國藥科大學藥學院，南京 0009；.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院藥劑科，南京 0008）

芹菜素對氧嗪酸鉀鹽致高尿酸血癥小鼠的降尿酸及腎保護作用機制研究Δ

繆明星1＊，王 星1，陸 琰1，王 欣2（#1.中國藥科大學藥學院，南京 210009；2.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院藥劑科，南京 210008）

目的：研究芹菜素對氧嗪酸鉀鹽致高尿酸血癥小鼠的降尿酸及腎保護作用機制。方法：將50只小鼠按體質量隨機分為正常組、模型組、別嘌呤醇組（5 mg/kg）與芹菜素低、高劑量組（40、80 mg/kg），每組10只。除正常組外，其余各組小鼠ig氧嗪酸鉀250 mg/kg復制高尿酸血癥模型，造模后1 h，各給藥組小鼠ig相應藥物，正常組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。測定各組小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平和腎臟轉運體相關蛋白（mURAT1、mOCT1、mOCT2、mOCTN1、mOCTN2）表達水平。結果：與正常組比較，模型組小鼠血尿酸、尿尿酸、mURAT1水平顯著升高，mOCT1、mOCT2、mOCTN1、mOCTN2水平和24 h尿肌酐水平顯著降低（P＜0.01或P＜0.001）；與模型組比較，芹菜素低、高劑量組及別嘌呤醇組小鼠血尿酸、尿尿酸、mURAT1水平顯著降低，24 h尿肌酐水平、mOCT1、mOCT2、mOCTN1和mOCTN2水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）。結論：芹菜素能降低氧嗪酸鉀鹽致高尿酸血癥小鼠的尿酸水平，保護腎臟；其作用機制可能與下調小鼠腎臟中mURAT1水平，上調mOCTN1、mOCTN2、mOCT1及mOCT2水平相關。

芹菜素；高尿酸血癥；腎保護作用；腎臟轉運體相關蛋白；機制；小鼠

高尿酸血癥是一種嚴重危害人類健康的代謝性疾病，可造成腎功能不全。高尿酸血癥與痛風、高血壓、腎臟疾病及代謝綜合征有關[1-2]，其標志是腎臟尿酸鹽分泌功能受損[3]。目前有文獻報道腎臟陰離子轉運子，如尿酸鹽轉運子1（URAT1，編碼為SLC22A12），在腎臟中介導尿酸鹽的轉運[4]。因此，高尿酸血癥藥物作用的靶點與腎臟有機離子轉運子有關[5-6]。

芹菜中含有大量芹菜素，前期研究表明芹菜素可以降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平[7]。還有研究報道芹菜素對氧嗪酸鹽誘導的高尿酸血癥大鼠具有促尿酸排泄功能[8]。芹菜素對肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）活性的抑制作用與別嘌呤醇相比不足以逆轉高尿酸血癥小鼠的尿酸水平，表明芹菜素可能是通過其他途徑調控腎臟尿酸鹽轉運的。目前關于芹菜素對氧嗪酸鉀致小鼠高尿酸血癥的降尿酸及腎保護作用機制研究尚不是很清楚，而小鼠腎臟尿酸鹽轉運系統(tǒng)和人比較相似[9]。因此，在本研究中筆者ig氧嗪酸鉀以復制高尿酸血癥小鼠模型，給藥后評價芹菜素降尿酸活性，同時研究其與mURAT1、mOCT1、mOCT2、mOCTN1和mOCTN2等尿酸鹽轉運蛋白表達水平的相關性，為芹菜素的進一步研究提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

XHF-D高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；5810R高速冷凍離心機（德國Eppendrof公司）；754紫外-可見分光光度計（上海菁華科學儀器有限公司）；7500實時定量熒光聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國ABI公司）、ChemiDoc XRS化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試劑

芹菜素（陜西慧科植物開發(fā)有限公司，批號：Ap20010124，純度：≥98%）；別嘌呤醇（批號：13053006，規(guī)格：25 g，含量：98%）、氧嗪酸鉀（批號：12042001，規(guī)格：25 g，純度：98%）均購自德國Sigma公司；尿酸測定試劑盒（南京拜傲斯生物科技有限公司，貨號：700320）；肌酐測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：201401622）；Trizol RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司，貨號：15596026、18080051）；小鼠mOCT1、mOCT2兔源單克隆抗體（美國Thermo Scientific公司，貨號：PA528209、PA532526）；小鼠mOCTN1、mOCTN2兔源單克隆抗體（美國Santacruze公司，貨號：SC-19819、SC-19822）；小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（mGAPDH）、mβ-actin單克隆抗體（上海百研生物科技有限公司，貨號：E021010、E021020）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（南京生興生物技術有限公司，貨號：ESN134）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

KM小鼠50只，♂，體質量（20±2）g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司[合格證號：SCXK（滬）2007-0005]。飼養(yǎng)環(huán)境：照明12 h/d，環(huán)境溫度（25±2）℃，濕度（55±5）%。

2 方法

2.1 分組、造模、給藥與取樣

將50只小鼠按體質量隨機分為正常組、模型組、別嘌呤醇組（5 mg/kg）與芹菜素低、高劑量組（40、80 mg/kg），每組10只（劑量依據預實驗及參考文獻[8]確定）。除正常組外，其余各組小鼠ig氧嗪酸鉀250 mg/kg以復制高尿酸血癥模型。造模后1 h，各給藥組小鼠ig相應藥物，正常組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，各組小鼠于眼球靜脈叢取血，離心（離心半徑為10 cm，3 000 r/min，下同）10 min，取血清，備用。之后脫頸椎處死小鼠，在冰臺上取小鼠肝臟和腎組織，用液氮冷凍后置于－80℃冰箱保存，備用。

2.2 各組小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平測定

給藥第6 d，于給藥1 h后每組取5只小鼠置于代謝籠內，適應1 d后，于給藥第7 d收集24 h尿液。尿液離心10 min，取上清液，測量尿液體積，另取“2.1”項下血清，按試劑盒說明書方法操作分別測定各組小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平。

2.3 各組小鼠腎臟轉運體蛋白表達水平的測定

取腎臟皮質刷狀緣膜（BBMV）蛋白測定mURAT1、mOCTN1、mOCTN2和mβ-actin的蛋白表達，取腎臟皮層蛋白測定mOCT1、mOCT2和mGAPDH的蛋白表達。按文獻[10]的方法提取“2.1”項下小鼠腎組織中BBMV蛋白及腎臟皮層蛋白。采用考馬斯亮藍法測定BBMV和腎皮質上清中的蛋白含量，以牛血清蛋白為標準品。蛋白統(tǒng)一稀釋后，在沸水中煮5 min備用。樣品經12%的分離膠行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離后，在300 mA條件下將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上100 min，在5%脫脂奶粉封2 h后取出膜，刷狀緣膜蛋白分別用mURAT1（1∶1 000，V/V，下同）、mOCTN1（1∶1 000）、mOCTN2（1∶1 000）一抗和內參mβ-actin（1∶1 000），腎臟皮層蛋白分別用mOCT1（1∶2 000）、mOCT2（1∶2 000）和內參mGAPDH（1∶5 000），在4℃條件下孵育過夜。磷酸鹽-吐溫緩沖液（PBST）洗膜后加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗（1∶10 000），化學發(fā)光法顯影。采用Chemi-Doc XRS凝膠成像系統(tǒng)進行信號掃描，測定條帶灰度值，采用Quantity One 4.62軟件進行定量分析，以目的基因與內參mβactin灰度值比值表示目的基因的相對表達水平。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對所得數據進行分析。所用數據采用±s表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠血尿酸、尿尿酸及24 h尿肌酐水平測定結果

與正常組比較，模型組小鼠血尿酸、尿尿酸水平顯著升高，24 h尿肌酐水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素低、高劑量組及別嘌呤醇組小鼠血尿酸、尿尿酸水平顯著降低，24 h尿肌酐水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），詳見表1。

表1 各組小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平測定結果（±s，n＝10）Tab 1 Results of blood uric acid，urine uric acid and 24 h creatinine levels of mice in each grou（p±s，n＝10）

表1 各組小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平測定結果（±s，n＝10）Tab 1 Results of blood uric acid，urine uric acid and 24 h creatinine levels of mice in each grou（p±s，n＝10）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組芹菜素低劑量組芹菜素高劑量組別嘌呤醇組劑量，mg/kg 40 80 5血尿酸，mg/L 34.78±2.09 45.85±3.08＊＊35.29±4.27##30.57±4.02##18.38±2.44##尿尿酸，mg/L 0.95±0.08 1.26±0.07＊＊1.08±0.05##0.96±0.08##1.03±0.09##24 h尿肌酐，mg/dl 24.19±1.46 17.13±1.26＊＊23.44±2.01##25.82±1.97##19.99±1.28#

3.2 各組小鼠腎臟轉運體相關蛋白表達水平的測定

與正常組比較，模型組小鼠mURAT1水平顯著升高，mOCT1、mOCT2、mOCTN1、mOCTN2水平顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，芹菜素低、高劑量組、別嘌醇組小鼠mURAT1水平顯著降低，mOCT1、mOCT2、mOCTN1和mOCTN2水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001），詳見圖1、圖2。

圖1 各組小鼠腎臟尿酸轉運體相關蛋白水平測定電泳圖Fig 1 Electrophoretogram for the determination of renal uric acid transporter related protein of mice in each group

圖2 各組小鼠腎臟尿酸轉運體相關蛋白表達測定結果注：與正常組比較，＊＊＊P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001Fig 2 The expression of kidney transporter associated protein in mice in each groupNote：vs.normal group，＊＊＊P＜0.001；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

4 討論

芹菜素具有促尿酸排泄、改善腎功能的作用，具體表現為其可顯著降低高尿酸血癥小鼠血尿酸、尿尿酸水平。食物和細胞中若含有大量的嘌呤類化合物，則伴隨著尿液尿酸鹽水平的上升，可能會導致患者體內血清尿酸鹽水平的升高，由于人缺乏尿酸酶無法將尿酸降解成尿囊素，故尿酸是人體內嘌呤代謝的終產物。目前有研究顯示連續(xù)ig芹菜素7 d可明顯降低小鼠24 h尿尿酸水平[11]。本研究結果表明，芹菜素低、高劑量及別嘌呤醇均可顯著降低高尿酸血癥小鼠的血尿酸、尿尿酸水平，同時顯著升高24 h尿肌酐水平。

芹菜素還可能通過其他機制降尿酸以保護腎功能。腎臟有機離子轉運子對尿酸鹽轉運及改善腎功能發(fā)揮著重要作用。目前已有研究證實氧嗪酸鉀誘導的高尿酸血癥大鼠腎臟組織有機陰離子轉運蛋白1（rOAT1）的mRNA和蛋白表達同時降低[12]。同時芹菜素可以改善四氧嘧啶造成的糖尿病小鼠腎功能異常從而發(fā)揮其腎保護作用，這可能與芹菜素調節(jié)腎臟尿酸轉運體的作用相關[13]。本研究表明，芹菜素對氧嗪酸鉀鹽致小鼠高尿酸血癥具有明顯的改善作用，其作用機制可能與下調高尿酸血癥小鼠腎臟mURAT1水平的表達，降低腎臟尿酸鹽重吸收能力，以及上調腎臟mOCT1、mOCT2、mOCTN1和mOCTN2表達水平相關。

綜上所述，本研究證實芹菜素是防治小鼠高尿酸血癥合并腎功能不全的一種潛在藥物，這為研究芹菜素降尿酸活性及腎功保護機制提供了新思路。

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Mechanism Study on Effects of Apigenin on Reducing Uric Acid and Renal Protection in Oteracil Potassium-induced Hyperuricemia Mice

MIAO Mingxing1，WANG Xing1，LU Yan1，WANG Xin2（1.School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School，Nanjing 210008，China）

OBJECTIVE：To investigate the mechanism of the effects of apigenin on reducing uric acid and renal protection in oteracil potassium-induced hyperuricemia mice.METHODS：50 mice were randomly divided into normal group，model group，allopurinol group（5 mg/kg），apigenin low-dose and high-dose groups（40，80 mg/kg），with 10 mice in each group.Except for normal group，other groups were given oteracil potassium 250 mg/kg intragastrically to induce hyperuricemia model；1 h after modeling，treatment groups were given relevant medicine intragastrically，and normal group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically，once a day，for consecutive 7 d.Blood uric acid，urine uric acid and 24 h creatinine levels，the expression of kidney transporter associated protein（mURAT1，mOCT1，mOCT2，mOCTN1 and mOCTN2）were all determined in each group.RESULTS：Compared with normal group，blood uric acid，urine uric acid and mURAT1 levels of model group were significantly increased，while the expressions of mOCT1，mOCT2，mOCTN1 and mOCTN2，24 h creatinine were significantly decreased（P＜0.01 or P＜0.001）.Compared with model group，blood uric acid，urine uric acid and mURAT1 levels of apigenin low-dose and high-dose groups，allopurinol group were significantly decreased，while 24 h creatinine，the expressions of mOCT1，mOCT2，mOCTN1 and mOCTN2 were increased significantly（P＜0.05 or P＜0.01 or P＜0.001）.CONCLUSIONS：Apigenin can reduce uric acid level of oteracil potassium-induced hyperuricemia mice and propect kidney，the mechanism of which may be associated with down-regulating the expression of mURAT1 and up-regulating the expressions of mOCTN1，mOCTN2，mOCT1 and mOCT2.

Apigenin；Hyperuricemia；Renal protection；Kidney transporter associated protein；Mechanism；Mice

R966

A

1001-0408（2016）34-4794-04

2016-06-13

2016-09-18）

（編輯：劉明偉）

中國藥科大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費項目（No. ZJ16197）

＊講師，碩士。研究方向：藥動學。電話：025-86185307。E-mail：mmx0224@cpu.edu.cn

#通信作者：主管藥師。研究方向：藥理學與藥房管理。電話：025-83304616。E-mail：20031269@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.13