宋必衛(wèi)，章方珺，劉潔瓊，楊軼安，付再林

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

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香附超臨界CO2提取物體外抗肝癌作用

宋必衛(wèi)，章方珺，劉潔瓊，楊軼安，付再林

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

為研究香附超臨界CO2萃取物(XF)的體外抗肝癌活性，采用MTT比色法研究XF對人肝癌細(xì)胞HepG2、人正常肝細(xì)胞LO2的殺傷作用及其量-效和時-效關(guān)系；采用Annexin V-EGFP/PI雙染、Rh123染色測定線粒體膜電位(Δψ)分析細(xì)胞凋亡及其機(jī)制.結(jié)果表明：XF對HepG2細(xì)胞具有強(qiáng)力殺傷作用，且呈明顯的量-效和時-效關(guān)系.相比對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞均有較大毒性的陽性藥順鉑(cis-Dichlorodiamineplatinum，DDP)，XF對LO2細(xì)胞毒性較小，相對安全.Annexin V-EGFP/PI雙染結(jié)果顯示XF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.Rh 123熒光染色檢測表明XF引起Δψ崩潰.表明XF具有良好的體外抗肝腫瘤作用，其機(jī)制是破壞線粒體導(dǎo)致內(nèi)源性凋亡，值得開發(fā)成安全有效的抗肝腫瘤藥.

超臨界CO2萃?。幌愀?；抗腫瘤；HepG2細(xì)胞

腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)具有非常重大的意義.傳統(tǒng)的化療藥物毒副作用大，易產(chǎn)生耐藥性.從中草藥中發(fā)現(xiàn)、篩選抗癌藥已成為目前國內(nèi)外研究的熱點.

香附為莎草科植物莎草Cyperus rotundus L.的干燥根莖.有疏肝解郁，理氣寬中，調(diào)經(jīng)止痛功效.其藥理作用廣泛，具有抗炎鎮(zhèn)痛[1]、抗抑郁[2]、降血糖[3]和抑制血小板聚集[4]等多種作用.文獻(xiàn)報道香附醇提物有抗癌作用[5]，但未進(jìn)行深入研究.本實驗采用超臨界CO2萃取技術(shù)對香附的有效成分進(jìn)行提取，研究其對肝癌細(xì)胞HepG2的抗瘤活性和作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞HepG2購自南京凱基生物科技有限公司；正常人肝細(xì)胞LO2購自上海中科院細(xì)胞所.

1.1.2 試 劑

香附購自杭州中藥飲片廠；DMEM高糖培養(yǎng)液、RPMI.1640培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶和PBS購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；MTT(噻唑蘭)、DMSO和Rhodamine123：SIGMA公司；澳洲胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)購自CLARK Bioscience公司；注射用順鉑(凍干型)購自齊魯制藥有限公司，批號H20023461；Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司.

1.1.3 儀 器

HA221-50-03型超臨界萃取裝置(南通華安超臨界萃取有限公司)、生物安全柜(Nuaire，NU-425-400S)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo electron corporation，NU-5510E)、倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon eclipse，TS100-FDH1)、多功能酶標(biāo)儀(BioTek，synergy HI)和離心機(jī)(Heraeus，LDZ5-2).

1.2方 法

1.2.1 超臨界CO2流體萃取香附揮發(fā)油(以下簡稱XF)

將香附粉碎成粗粉，稱取粉末1 000 g裝入萃取釜Ⅰ(2 L)中萃取[6-7]：溫度55 ℃，壓強(qiáng)20 MPa，時間4 h.計算萃取率為

萃取率=(XF質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100%

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力

抑制率=(1-實驗組吸光度/陰性對照組吸光度)×100%

1.2.3 Annexin V-EGFP/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞[12-14]以1×104個/孔接種于24孔板，培養(yǎng)24 h，再分為4個組：正常對照組不做任何處理；XF組(據(jù)預(yù)實驗，終質(zhì)量濃度為100 μg/mL)分別在加藥3，6，12 h后，小心吸棄培養(yǎng)液并用冷PBS清洗3 次，每孔加入500 μL Binding Buffer + 5 μL Annexin-V-EGFP+5 μL PI，室溫下避光反應(yīng)10 min，熒光顯微鏡觀察、拍照.

1.2.4 細(xì)胞線粒體膜電位(Δψ)的檢測

Rhodamine 123(Rh123)為膜電位敏感親脂性陽離子熒光染料，能選擇性地在活細(xì)胞線粒體內(nèi)聚集，發(fā)出黃綠色熒光，其強(qiáng)度間接反映Δψ水平[11-12].取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞以5.0×103個/孔種于96孔板中，分為正常對照組、不同質(zhì)量濃度XF組，每組6 個復(fù)孔.培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，PBS清洗3 次，加入含10 mg/L Rh 123的無酚紅DMEM培養(yǎng)液，37 ℃孵育30 min，移棄培養(yǎng)液，PBS清洗多次至背景較淺，加入適量無酚紅DMEM培養(yǎng)液，熒光顯微鏡觀察.多功能酶標(biāo)儀檢測熒光值，其中激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm.

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

各組實驗數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，采用One-way ANOVA檢測均數(shù)差異顯著性，以P<0.05為差異有顯著性意義[10].

2 結(jié) 果

2.1 XF超臨界CO2流體萃取

萃取得棕黃色XF為

萃取率=(10.45 g/1 000 g)×100%=1.045%

2.2 XF對細(xì)胞殺傷作用

2.2.1 一般形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示，正常對照組生長正常，細(xì)胞數(shù)量隨時間延長增加.XF作用于HepG2細(xì)胞，隨著時間延長和質(zhì)量濃度增加，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞皺縮變小變圓，出現(xiàn)凋亡特征性膜泡，部分細(xì)胞脫落懸浮，最終死亡、破碎.

圖1 光鏡觀察不同質(zhì)量濃度的XF作用24 h對HepG2形態(tài)的變化(100倍)Fig.1 Effects of different concentrations of XF on morphological changes of HepG2 cells after 24h observed by light microscope

2.2.2 XF對HepG2細(xì)胞殺傷作用的時效和量效關(guān)系

分析表1數(shù)據(jù)可知：XF在12.5～200 μg/mL范圍內(nèi)，均極顯著降低HepG2細(xì)胞活力，且隨時間延長和質(zhì)量濃度增加，作用增強(qiáng)，呈明顯的質(zhì)量濃度依賴性和時間依賴性.短時間(24 h)、高質(zhì)量濃度(200 μg/mL)即達(dá)峰效應(yīng)(99.9%)，而DDP(4 μg/mL，短時用藥作用僅達(dá)26.6%，連續(xù)使用72 h，抑制率為82.3%，遠(yuǎn)不及XF的效果(P<0.001)，而此時DDP對LO2細(xì)胞抑制高達(dá)97.9%(表2)，如此毒性是臨床難以接受的.連續(xù)用藥72 h，100 μg/mL的XF作用與高質(zhì)量濃度DDP(4 μg/mL)相當(dāng)，但對LO2抑制率僅20.2%，臨床可以接受.本實驗證明，XF對正常細(xì)胞毒性比DDP小，抗癌效果明顯高于DDP.

表1 XF對HepG2細(xì)胞的殺傷作用的時-量-效關(guān)系(Mean±SD，n=6)

注: 1) 與正常對照組相比較，P<0.001；2) 與DDP同時間比較，P<0.001.

表2 XF作用24，48，72 h對LO2細(xì)胞的抑制率 (Mean±SD，n=6)

Table 2 Inhibition rate of XF against LO2 cells after 24, 48 and 72 h exposure(Mean±SD，n=6)

時間/hDDP/%4μg/mLXF/%100μg/mL140μg/mL200μg/mL2420．1±3．61)18．9±1．11)28．8±2．21)55．5±1．72)4853．7±1．31)8．1±2．72)30．6±4．52)94．7±2．42)7297．9±0．11)20．2±3．92)50．1±2．22)99．6±0．21)

注: 1) 與正常對照組相比較，P<0.001；2) 與DDP同時間比較，P<0.001.

2.2.3 XF對正常人肝細(xì)胞的毒性

如表2所示，XF與DDP對LO2細(xì)胞均有很強(qiáng)殺傷作用.但XF對LO2殺傷的質(zhì)量濃度高于對肝癌細(xì)胞.考慮到：1) 抗癌治療現(xiàn)狀；2) 臨床上肝細(xì)胞死亡50%以上時才有明顯表現(xiàn)；3) 肝細(xì)胞再生能力強(qiáng).XF在肝內(nèi)質(zhì)量濃度達(dá)到100～140 μg/mL(作用72 h，抑制率為20.2%～50.1%)，是可接受的選擇.XF高質(zhì)量濃度(200 μg/mL)作用24 h，正常肝細(xì)胞抑制55.5%，提示短期沖擊療法，值得進(jìn)一步研究.

2.2.4 XF殺傷HepG2細(xì)胞和LO2細(xì)胞的IC50

XF，DDP對HepG2細(xì)胞和LO2的IC50見表3.XF對LO2有一定的毒性，但所需的劑量更大.比較XF對兩種細(xì)胞的IC50值，24 h時對LO2是對HepG2的2.1 倍；72 h時對LO2是對HepG2的3.1 倍，說明XF對HepG2有較好選擇性.在較低

質(zhì)量濃度時，對正常細(xì)胞相對安全.而陽性對照藥DDP對HepG2選擇性很小(該比值24 h接近1，72 h為1.4)，安全性遠(yuǎn)差于XF.上述結(jié)果還表明：XF作用24 h即可極大殺傷癌細(xì)胞(99.9%)，對正常細(xì)胞的毒性相對小(55.5%)，提示XF可實施短期沖擊治療；而DDP需要作用72 h，此時對正常細(xì)胞毒性極大.

表3 XF和DDP對HepG2和LO2細(xì)胞的IC50

Table 3IC50of XF and DDP against HepG2 and LO2 cells

時間/hDDP/(μg·mL-1)HepG2LO2XF/(μg·mL-1)HepG2LO22411．1813．982．14170．8482．662．7960．94152．0721．151．6343．44133．2

2.3 XF誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

如圖2(原圖為彩色，經(jīng)灰度轉(zhuǎn)變?yōu)閳D2，外圈暗灰色為原圖的細(xì)胞膜綠染，中間亮灰色為原圖的細(xì)胞核紅染)所示，正常對照組的細(xì)胞中有極少量暗灰色(極少量細(xì)胞膜綠染)；XF作用3 h后有少量暗灰色(少量細(xì)胞膜綠染)，顯示細(xì)胞凋亡早期的特征；6 h后部分細(xì)胞已呈外圈暗灰，中間亮灰色(部分細(xì)胞雙染)，細(xì)胞固縮但保持形態(tài)完整，提示部分細(xì)胞處于凋亡中晚期；12 h后細(xì)胞內(nèi)的亮灰色更亮，提示大多細(xì)胞都進(jìn)入了凋亡中晚期.本結(jié)果證明：1) 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是XF抗癌的主要作用機(jī)制；2) 作用迅速.

圖2 Annexin V-EGFP/PI雙重?zé)晒馊旧?HepG2細(xì)胞，200 倍)Fig.2 Fluorescence images of Annexin V-EGFP/PI double staining(HepG2 cells)

2.4 XF致HepG2細(xì)胞線粒體膜電位(Δψ)崩潰

圖3(原圖為綠色熒光圖，經(jīng)灰度轉(zhuǎn)變?yōu)閳D3)表示XF作用HepG2細(xì)胞24 h后Δψ崩潰，且隨著質(zhì)量濃度的升高而加劇，呈一定的劑量依賴性.本結(jié)果表明：損傷線粒體、激活內(nèi)源性凋亡通路而導(dǎo)致HepG2細(xì)胞凋亡是XF抗癌的主要作用機(jī)制.圖3(e)中：與正常對照組相比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.

圖3 XF致HepG2細(xì)胞線粒體Δψ崩潰(Rh 123標(biāo)記法)Fig.3 Inhibitory effect of XF on Δψ dissipation of HepG2 cells (labeled with Rh123 and detected by fluorescence microscope)

3 結(jié) 論

多數(shù)抗腫瘤藥物在殺死癌細(xì)胞的同時也對正常細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重毒性.篩選腫瘤藥物時，要求能選擇性毒殺腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞毒性小.本實驗采用超臨界CO2萃取技術(shù)對分離提取XF.預(yù)實驗表明：XF比醇提物抗癌活性更高，為更好地發(fā)揮XF抗癌作用提供了工藝路線.實驗發(fā)現(xiàn)XF對HepG2細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，且隨藥物質(zhì)量濃度和作用時間的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的量-效和時-效關(guān)系.而臨床廣泛使用、療效確切的DDP對癌瘤細(xì)胞的選擇性差，故認(rèn)為XF比順鉑更安全.Annexin V-EGFP/PI雙染及膜電位(Δψ)檢測結(jié)果證明XF損傷線粒體而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其抗癌作用主要機(jī)制.以上結(jié)果表明：XF具有高效體外抗腫瘤作用，相對安全，值得進(jìn)一步研究開發(fā)成有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗腫瘤新藥.

致謝：本文中超臨界CO2萃取部分工作得到藥學(xué)院錢俊青教授和郭輝副教授無私幫助和精心指導(dǎo)，謹(jǐn)致感謝！

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(責(zé)任編輯：陳石平)

Study on the anti hepatoma activity of cyperus rotundus by supercritical CO2fluid extraction in vitro

SONG Biwei, ZHANG Fangjun, LIU Jieqiong, YANG Yian, FU Zailin

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

This study was performed to investigate anti hepatoma activity of the effective component of rhizoma cyperi with the technique of supercritical CO2fluid extraction (XF) in vitro. The cytotoxicity of XF both on human hepatoma cells HepG2 and on normal human hepatocytes LO2 were evaluated by MTT assay. Annexin V-EGFP/PI double staining and Rhodamine123 (Rh123) staining were tested in the preliminary study of its mechanism. Results: XF showed a significant dose dependent and time dependent cytotoxicity to the tumor cells. Compared to the positive control drug cisplatin (DDP), which has a great toxicity on both tumor and normal cells, XF is less toxic to LO2 cells. Annexin V-EGFP/PI double staining showed that XF could strongly induce apoptosis. Rh123 method indicated that XF caused the loss of mitochondrial membrane potential. In Conclusion: XF has a remarkable anti hepatoma effect in vitro and is expected to be developed into an effective anti hepatoma drug.

supercritical CO2extraction; rhizoma cyperi; anti-tumor; HepG2 cell

2016-03-23

宋必衛(wèi)(1956—)，男，安徽岳西人，教授，研究方向為神經(jīng)分子藥理學(xué)，E-mail: bwsong@zjut.edu.cn.

R965

A

1006-4303(2016)06-0645-04