徐天生， 歐 杰*， 馬晨晨， 董 博,2

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

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廢棄鋼廠耐Cr6+霉菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性

徐天生1， 歐 杰1*， 馬晨晨1， 董 博1,2

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

從廢棄鋼鐵廠內(nèi)土壤中分離出1株對Cr6+具有高去除性的微生物，對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究。采用馬丁氏培養(yǎng)基對上海某廢棄鋼鐵廠內(nèi)重金屬污染土壤中耐Cr6+真菌進(jìn)行分離篩選純化，用菌落形態(tài)及18S rRNA 序列分析鑒定菌株,研究菌株的Cr6+耐受性及還原率，分析不同影響因素對其修復(fù)Cr6+及總鉻的影響。結(jié)果表明M-13為橘綠木霉(Trichodermacitrinoviride)，可耐濃度為1.7 mmol/L的Cr6+，且每克菌絲修復(fù)20 mg以上的Cr6+，10 mg以上的總鉻。菌株生長到72 h時菌絲干重達(dá)到最高。在pH約1.09，溫度28 ℃，菌絲加入量0.25 g(干重)，Cr6+初始質(zhì)量濃度為100 mg/L時，Cr6+還原率最大為99.3%，幾乎能將50 mL溶液中的Cr6+完全去除，可將55.3%的總鉻吸附。橘綠木霉M-13能較好地去除Cr6+，可以作為試驗(yàn)材料應(yīng)用于生物修復(fù)廢水中Cr6+的研究。

耐Cr6+霉菌；分離鑒定；生物學(xué)特性

隨著電鍍、制革、印染等工業(yè)技術(shù)的快速發(fā)展，金屬鉻(Cr)被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)中，未經(jīng)處理的含Cr6+廢液、廢渣直接排到環(huán)境中，會給環(huán)境帶來嚴(yán)重污染。同時，Cr6+對人體的代謝系統(tǒng)有很強(qiáng)的毒性，對生物體有致突變、致癌和致畸作用，屬于一類污染物[1]。Cr6+化合物的毒性約為Cr3+的100倍，致突變率約為Cr3+的1 000倍[2]。因此，將毒性強(qiáng)、水溶性高的Cr6+轉(zhuǎn)化為毒性較低、水溶性差的Cr3+進(jìn)而被微生物吸附被認(rèn)為是一種有效的恢復(fù)鉻酸鹽污染土壤和水系統(tǒng)的方法?，F(xiàn)有的化學(xué)和電化學(xué)處理過程一般是將水溶液中的Cr6+還原為Cr3+，隨后調(diào)整溶液的pH值至接近中性的條件下生成沉淀從而降低Cr6+的濃度[3]。通過微生物去除作用來降低或減緩重金屬對生態(tài)的破壞在國內(nèi)外已有很多相關(guān)研究[4]，各種生物機(jī)制可轉(zhuǎn)換重金屬的可溶和不可溶的形態(tài)，改變環(huán)境中金屬的活性和有效性，加速其被生物吸收的過程。因此，生物去除技術(shù)對環(huán)境中重金屬的防治具有重要意義[5-6]。微生物修復(fù)在治理Cr6+污染上有廣闊的應(yīng)用前景，已經(jīng)逐漸引起人們的重視，成為研究的熱點(diǎn)。近年來，有學(xué)者在微生物修復(fù)重金屬污染方面進(jìn)行了研究，Ozer等[7]研究啤酒酵母S.cerevisiae發(fā)現(xiàn)，啤酒酵母對Cr6+的去除能力達(dá)到32.6 mg/g，黃順紅[8]研究了土著微生物對Cr6+的去除效果。本研究從上海某廢棄鋼鐵廠附近土壤篩選出1株橘綠木霉，該霉菌對Cr6+具有較高的耐受性和較強(qiáng)的修復(fù)能力，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)鑒定，同時對菌株的修復(fù)特性進(jìn)行初步研究, 以期為微生物修復(fù)環(huán)境中水體Cr6+污染的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 土壤樣品于2012年采自上海某廢棄鋼鐵廠，采集量為5 kg，經(jīng)分析該土壤樣品中常見重金屬含量依次為錳574 mg/kg，鐵21 523 mg/kg，銅140 mg/kg，鉛78.8 mg/kg，鎘0.569 mg/kg，鉻 88.1 mg/kg。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬丁氏培養(yǎng)基，馬丁氏液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 耐Cr6+真菌的分離、純化 將5 g土壤樣品加入至45 mL馬丁氏培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，取1 mL土壤懸液于含100 mg/L Cr6+的新鮮培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)基渾濁后移1 mL培養(yǎng)液接種于含150 mg/L Cr6+的馬丁氏液體培養(yǎng)基中，依此類推逐級提高Cr6+濃度，在100～500 mg/L Cr6+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取0.2 mL 250 mg/L Cr6+的培養(yǎng)液涂布于500 mg/L Cr6+的馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)120 h，分離出對Cr6+具較高耐性的霉菌。菌株形態(tài)及生理、生化特性鑒別參考《真菌鑒定手冊》[9]、《普通真菌學(xué)》[10]。根據(jù)菌落形態(tài)鑒定M-13單菌落菌株為木霉屬。

1.2.2 菌株生長曲線 將篩選所得菌株M-13接種于50 mL馬丁氏液體培養(yǎng)基中活化24 h，取1 mL至裝有150 mL馬丁氏液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，28 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)；每6 h取出三瓶抽濾，收集菌體，25 ℃烘干，稱量其干重。繪制M-13的生長曲線。

1.2.3 pH和溫度對M-13修復(fù)Cr6+及總鉻的影響 利用HCl和NaOH 溶液將Cr6+溶液的pH分別調(diào)至0.30、0.61、0.81、1.11、1.42、2.41、3.63、4.28(實(shí)測pH值)，稱取0.25 g(干重)M-13菌絲，置于50 mL 100 mg/L上述不同pH的Cr6+溶液中，28 ℃、150 r/min震蕩24 h。測定各pH值Cr6+及總鉻的終濃度。稱取0.25 g(干重)M-13菌絲，置于50 mL 100 mg/L Cr6+溶液中，在20、25、28、30、35、40 ℃下，150 r/min震蕩24 h，測定各溫度下Cr6+及總鉻的終濃度。

1.2.4 不同Cr6+初始濃度對M-13去除Cr6+及總鉻的影響 配制50、150、200、250、300、400 mg/L Cr6+水溶液，量取50 mL置于250 mL錐形瓶中，向各錐形瓶投入0.25 g(干重)M-13菌絲，28 ℃、150 r/min震蕩24 h。測定不同Cr6+濃度下Cr6+及總鉻的終濃度。

1.2.5 不同菌體投入量對Cr6+及總鉻去除的影響 分別稱量0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22、0.24、0.26、0.28、0.30 g(干重)M-13菌絲，置于50 mL 100 mg/L Cr6+溶液中，28 ℃、150 r/min震蕩24 h，測定不同菌體投入量Cr6+及總鉻的最終濃度。

1.2.6 菌株M-13對Cr6+及總鉻的去除曲線 根據(jù)以上不同的條件制作修復(fù)曲線。該菌株對Cr6+及總鉻的還原率及修復(fù)量按照下列公式計算：

(1)

q=(Ci-Cf)×V/W

(2)

式中：Q表示還原率(%)，Ci和Cf 分別表示Cr6+及總鉻的起始濃度和修復(fù)后濃度(mg/L)；q表示修復(fù)量(mg/g),V表示溶液體積(L)，W表示修復(fù)劑干重(g)。

1.2.7 Cr6+和總鉻的檢測 ① Cr6+檢測方法：根據(jù)GB/T 5750.6-2006標(biāo)準(zhǔn)稱取0.141 4 g重鉻酸鉀，105～110 ℃烘至恒量后溶于去離子水中，定容至500 mL容量瓶中，移取該溶液10.0 mL定容至1 000 mL容量瓶中。在50 mL比色管中分別加入上述六價鉻溶液0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL，加去離子水至刻度線，再加入2.5 mL硫酸溶液(7倍稀釋)和2.5 mL二苯碳酰二肼溶液(顯色劑)，立即搖勻，放置10 min。利用分光光度計測定吸光度[11]。② 總鉻檢測方法：根據(jù)GB/T5009.123-2003標(biāo)準(zhǔn)分別吸取標(biāo)準(zhǔn)鉻溶液(100 mg/mL)0、0.10、0.30、0.50、0.70、1.00、1.50 mL于10 mL容量瓶中，用1.0 mol/L硝酸稀釋至刻度，混勻。條件調(diào)整為357.9 nm；干燥110 ℃，40 s；灰化1 000 ℃，30 s；原子化2 800 ℃，5 s[12]。

1.2.8 耐Cr6+真菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將菌株M-13在察氏培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)及顯微形態(tài)。

1.2.9 耐Cr6+菌株的分子系統(tǒng)學(xué)鑒定 DNA提取方法：采用石英砂研磨CTAB(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化銨)提取[13]。遺傳標(biāo)記：選用翻譯延伸因子(tef 1-alpha)基因(tef)，擴(kuò)增引物：EF1T、EF2T[14]。PCR產(chǎn)物檢測和測序：PCR產(chǎn)物與100 bp DNA用2.0%的瓊脂糖凝膠在0.5×TBE電泳緩沖液中于80 V電壓下電泳20 min，然后置于0.5 μg/mL 的溴乙錠溶液中染色15 min，在波長365和254 nm紫外光下檢測為明顯單一條帶，純化后用ABI3700進(jìn)行雙向直通測序[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株M-13的生長曲線

M-13的生長曲線見圖1。由圖1可知，M-13的延滯期約24 h，此時菌絲量約為0.1 g；24 h后進(jìn)入對數(shù)期，快速生長；在72 h達(dá)到穩(wěn)定期，微生物量達(dá)到最大，質(zhì)量約為1.2 g。圖1還顯示了M-13在不同濃度Cr6+中的生長曲線。

圖1 菌株M-13生長曲線

2.2 不同pH對Cr6+及總鉻還原率的影響

不同pH下M-13對Cr6+及總鉻的修復(fù)結(jié)果見圖2。由圖2可知，pH值小于1.5時，M-13對Cr6+的去除可達(dá)到60%；pH值大于1.5后，Cr6+修復(fù)率處于較低水平。這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)基本吻合[16-18]，對總鉻的吸附由于在高濃度H+下菌絲會被質(zhì)子化因而吸附率有所下降。

圖2 pH對M-13修復(fù)Cr6+及總鉻的影響Fig.2 Effect of different pH on removing Cr6+ and total chromium by M-13

2.3 不同溫度對Cr6+及總鉻還原率的影響

在不同溫度條件下(10、15、20、28、32 ℃)測定M-13對Cr6+及總鉻的修復(fù)率，由圖3可以看出，溫度對該菌株去除Cr6+及總鉻影響不大，在20 ℃后修復(fù)能力仍較強(qiáng)。

圖3 溫度對Cr6+及總鉻還原率的影響Fig.3 Influence of different temperature on removing Cr6+ and total chromium

2.4 菌絲量對修復(fù)Cr6+及總鉻的影響

菌株M-13的菌絲初始加入量不同，對Cr6+及總鉻去除效果也不相同。M-13的初始添加量對Cr6+及總鉻修復(fù)的影響見圖4。由圖4可知，Cr6+及總鉻的還原率隨著菌絲加入量的增多而逐漸增大，在0.25 g后達(dá)到飽和，對總鉻的還原率大致趨勢也類似。

圖4 菌絲加入量對Cr6+及總鉻修復(fù)的影響Fig.4 Effect of the mycelium quantity on removing Cr6+ and total chromium

2.5 Cr6+濃度對M-13修復(fù)Cr6+及總鉻的影響

不同Cr6+初始濃度對M-13還原率的影響見圖5。由圖5可知，在80 mg/L后，隨著Cr6+濃度的升高，M-13對Cr6+及總鉻的還原率趨于下降，當(dāng)Cr6+初始濃度100 mg/L時，M-13對Cr6+的還原率可達(dá)98.97%，對總鉻的還原率可達(dá)58%；而當(dāng)Cr6+濃度為350 mg/L時，Cr6+的還原率低于50.0%，總鉻的還原率低于35%。在Cr6+濃度處于較低水平時，菌體表面與總鉻量的比值較高，因而在低濃度下Cr6+及總鉻更易被修復(fù)[19]。

圖5 不同Cr6+濃度對M-13修復(fù)Cr6+及總鉻的影響Fig.5 Effect of removing efficiency at different concentrations

圖6 基于tef 的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on tef

2.6 耐Cr6+真菌的鑒定

2.6.1 形態(tài)特征 菌株M-13在察氏培養(yǎng)基 25 ℃培養(yǎng)5 d，菌落布滿平皿，直徑可達(dá)70 mm，稀疏但中央稍厚，近于水綠色，無滲出液，無可溶性色素，菌落反面呈黃色，分生孢子梗瓶型，直或稍彎曲，瓶梗頸明顯，分生孢子膠囊型，壁光滑。

2.6.2 測序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析 原始序列用生物軟件Bioedit 7.0.9[20]編輯后得到準(zhǔn)確無誤的序列，與GenBank下載的模式和權(quán)威菌株序列組成序列數(shù)據(jù)矩陣。對于序列矩陣，在Bioedit 7.0.9下做必要的人工編輯和調(diào)整得到的新矩陣。將該矩陣用MEGA5.0[21]進(jìn)行鄰接法(neighbor-joining, NJ)分析，推斷出系統(tǒng)發(fā)育樹，并用自展法(bootstrap) 進(jìn)行1 000次重復(fù)評估各分支的可靠性。圖6顯示了菌株M-13與其他木霉家族的關(guān)系(以M-13E表示)，M-13與Trichodermacitrinoviride聚成一簇，相似性為99%，自舉值為99%。鑒定結(jié)果顯示，M-13初步可定為橘綠木霉(Trichodermacitrinoviride)。M-13菌株保藏號為CGMCC NO.8332。

3 討 論

生物去除法可以有效去除溶液中的Cr6+及總鉻，并且不同的條件會影響菌株的還原率。本研究從上海某廢棄鋼鐵廠分離出1株能去除高濃度Cr6+霉菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定為橘綠木霉(TrichodermaM-13)。分別用分光光度法和原子吸收法測定濾液中的Cr6+和總鉻，結(jié)果相差較大，推測該霉菌可以將Cr6+還原成Cr3+。pH和Cr6+初始濃度對M-13的還原能力影響最大，pH在1.09左右去除效率最佳，為99.3%，M-13幾乎能將100 mg/L Cr6+全部去除，能將55%左右的總鉻吸附，從高還原率角度來看，與Preeti研究相似[22]；溫度和初始投菌量對修復(fù)100 mg/L Cr6+及總鉻的影響較小，雖然25 ℃是M-13修復(fù)Cr6+及總鉻的最適溫度，但在20～35 ℃還原率變化并不明顯，因此溫度不是影響還原率的主要條件；在初始投菌量為0.25 g(干重)時M-13可將超過99%的50 mL 100 mg/L Cr6+完全還原，可吸附55.3%的總鉻。該霉菌還原Cr6+溶液需要24 h，比相關(guān)文獻(xiàn)[23]中微生物需要8 h左右修復(fù)時間要長。雖然去除時間較長，但從去除高濃度Cr6+和最終效果來看，該霉菌對Cr6+及總鉻有著較強(qiáng)的修復(fù)能力。

總之，該霉菌可作為較好的試驗(yàn)材料應(yīng)用于生物修復(fù)Cr6+污染廢水的研究中，今后可進(jìn)一步研究去除Cr6+的機(jī)理，為研究微生物治理Cr6+污染廢水提供必要的理論依據(jù)。

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Isolation and Identification, and Biological Characteristics of Cr6+-Tolerant Fungi from Abandoned Steel Mill

XU Tian-sheng1, OU Jie1, MA Chen-chen1, DONG Bo1,2

(1.Coll.ofFoodSci. &Technol.,ShanghaiOceanUni.,ShanghaiEngin.Res.Ctr.ofAquatic-ProductProcess. &Preser’n,Shanghai201306; 2.ShanghaiInst.ofFoodandDrugInspection，Shanghai201203)

A microbial strain possessing high chromium-depletable was isolated and obtained from polluted soil in an abandoned steel mill in Shanghai and studied its biological characteristics. The chromium-tolerant microbe was isolated, screened, and purified from heavy metals polluted soil around the abandoned steel mill by Martin medium, and identified the strain by colony morphology and 18S rDNA sequence analysis, and studied its Cr6+tolerance and repairing rate, analyzed different affecting factors on its redemption and the influence of total Cr6+. The results showed the strain was identified asTrichodermacitrinovirideand named as M-13. The strain could tolerate 1.7 mmol/L of Cr6+, and it could repair above 20 mg of Cr6+per gram of mycelium, over 10 mg of total Cr6+. When the strain was cultured 72 h, its dried mycelium reached to the maximum. When pH was about 1.09, temperature at 28 ℃, mycelium adding amount at 0.25 g (dried weight), initial concentration of Cr6+at 100 mg/L, the removal rate of Cr6+reached to the maximum, it was at 99.3% and almost all Cr6+could be completely removed, and could adsorb 55.3% of total chromium.TrichodermacitrinovirideM-13 could comparatively well remove Cr6+, and the strain could be used as research material apply on bio-reparation Cr6+in wastewater.

chromium-tolerant fungus; isolation and identification; biological characteristics

上海市科委工程中心建設(shè)項(xiàng)目(11DZ2280300)

徐天生 男，碩士研究生。主要研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail :757659553@qq.com

* 通訊作者。男，副教授，碩士生導(dǎo)師。主要從事生物技術(shù)及食品微生物研究。Tel：021-61900382，E-mail: jou@shou.edu.cn

2015-04-28；

2015-05-20

Q93-331

A

1005-7021(2016)02-0056-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.010