王永剛, 孫尚琛, 馬雪青, 秦健宇, 冷非凡

(1.蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

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Ca2+和Sr2+誘導大腸埃希菌感受態(tài)細胞的形成及轉(zhuǎn)化的影響

王永剛1, 孫尚琛1, 馬雪青2, 秦健宇1, 冷非凡1

(1.蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

為研究金屬離子誘導下感受態(tài)細胞形成的機理及揭示轉(zhuǎn)化發(fā)生的機制，分別用Ca2+和Sr2+(0～140 mmol/L)制備大腸埃希菌感受態(tài)細胞并轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果表明，不同濃度的Ca2+和Sr2+誘導的感受態(tài)細胞的效價不同，兩種金屬離子對大腸埃希菌細胞內(nèi)外膜的通透性均有較大影響，但細胞內(nèi)外膜的改變程度與轉(zhuǎn)化率無直接關系；電鏡結(jié)果顯示，未處理的細胞呈簇聚集發(fā)生粘連現(xiàn)象，感受態(tài)細胞整體呈分散狀態(tài)，局部發(fā)生聚集，而轉(zhuǎn)化后的細胞獨立存在，邊緣異常清晰。

Ca2+； Sr2+； 通透性； 感受態(tài)細胞；轉(zhuǎn)化

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞是基因工程中常用的手段之一。早在1970年，Mandel等[1]研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的Ca2+可以誘導大腸埃希菌形成感受態(tài)細胞，攝取外源DNA。Chu等[2]從Micromonosporaechinospora的細胞壁中提取肽聚糖并研究了肽聚糖、慶大霉素和金屬離子之間的吸附關系。研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子與慶大霉素可以競爭性吸附肽聚糖，在金屬離子存在下，肽聚糖對慶大霉素的吸附量很少。 Subrata等[3]研究發(fā)現(xiàn)DNA與脂多糖(LPS)有較強的結(jié)合作用，且DNA-LPS復合物在Ca2+濃度為100 mmol/L時結(jié)合作用最強，DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)最緊密。關于金屬離子在感受態(tài)細胞的形成及轉(zhuǎn)化發(fā)生中的生理機制尚不明確，一般認為是宿主細胞在低溫、金屬離子的刺激等條件下，細胞膜的通透性發(fā)生了變化，進而為外源DNA的進入提供了條件。本研究利用Ca2+和Sr2+誘導大腸埃希菌細胞，研究兩種金屬離子對宿主細胞膜通透性及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率的影響，并采用電鏡等手段對宿主細胞的形態(tài)等進行研究，以期揭示金屬離子對宿主細胞生理性調(diào)節(jié)的相關作用，探索金屬離子誘導下感受態(tài)細胞的形成及轉(zhuǎn)化發(fā)生的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸埃希菌DH5α，由蘭州理工大學馬建忠實驗室保存。

1.1.2 質(zhì)粒 質(zhì)粒DNA pUC19(AMP+)，為本實驗室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(體積分數(shù)，%)：每1 000 mL培養(yǎng)基中含蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；抗性平板：LB培養(yǎng)基加氨芐青霉素至終濃度50 μg/mL，瓊脂1.5%(體積分數(shù))。

1.2 方法

1.2.1 感受態(tài)細胞的制備 依據(jù)文獻[4]提供的制備感受態(tài)細胞的方法，分別用濃度為0、60、80、100、120 和140 mmol/L的Ca2+和Sr2+制備大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，于-80 ℃下保存于終濃度為15%的甘油中，備用。

1.2.2 不同離子濃度對大腸埃希菌內(nèi)膜(IM)通透性影響的檢測 將已活化的大腸埃希菌按1%的量接種至含2%乳糖的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩(180 r/min)培養(yǎng)2～3 h至對數(shù)期(OD600=0.4～0.6)，收集細胞，經(jīng)過生理鹽水洗滌后分別用濃度為0、60、80、100、120 和140 mmol/L的Ca2+與Sr2+制備大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞。在感受態(tài)細胞中加入終濃度為1.5 mmol/L 的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)[5]，37 ℃輕微震動2 min，溶液顏色呈黃色后用紫外分光光度計測量不同濃度下415 nm處的吸光值，3組平行，繪制曲線。1.2.3 不同離子濃度對大腸埃希菌外膜(OM)通透性影響的檢測 在1.2.1方法制備的感受態(tài)細胞中加入終濃度為10 μmol/L的N-苯基-1-萘胺(NPN)[5]溶液，37 ℃輕微振蕩2 min后用熒光分光光度計測量其熒光值：激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長420 nm。每個濃度下做3組平行，記錄數(shù)值并繪制標準曲線。

1.2.4 不同離子濃度對質(zhì)粒pUC19轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α轉(zhuǎn)化率的影響 各個濃度的Ca2+與Sr2+介導下的感受態(tài)細胞200 μL和2 μL質(zhì)粒(pUC19)吹吸混勻，冰上放置30 min后42 ℃熱激90 s，快速將離心管轉(zhuǎn)入冰上放置3 min，加入800 μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)45 min，取10 μL菌液加入490 μL LB培養(yǎng)基，吹吸均勻后再從稀釋液中取10 μL加入190 μL無菌水，涂在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，計數(shù)。

1.2.5 掃描電鏡的樣品制備 取對數(shù)培養(yǎng)期的大腸埃希菌懸浮液，3 000 r/min離心5 min，棄上清液，向大腸埃希菌沉淀中加入菌體體積40倍的2.5%戊二醛混勻，使其成為懸浮液, 靜置固定2 h；再以3 000 r/min離心5 min，沉降細菌，棄上清液；以蒸餾水重新懸浮菌體沉淀，再以 3 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復3次，以清洗細菌；然后依次把30%、50%、70%、80%、90%的梯度濃度酒精加入細菌沉淀，脫水，每次懸浮混勻后靜置10 min再離心，棄去上清液，加入下一梯度濃度的酒精重復以上操作，然后用純酒精按同樣方法將細菌脫水3次，30 min /次；接著換用純叔丁醇代替酒精離心置換酒精3次，30 min/次；最后用叔丁醇將菌體沉淀懸浮成濃度為105個/mL 吸取懸液，滴在覆有蓋玻片的樣品臺上，置于-10 ℃預冷的冷凍干燥機內(nèi)進行真空干燥。將以上干燥脫水后的大腸埃希菌用鍍膜儀以10 Pa 的真空度，15 mA的離子電流鍍金160 s并拍照[6-10]。

1.2.6 熒光顯微鏡觀察 用丙酮配制2 mg/mL的FDA貯備液，按菌含量1×106個/mL的要求加入125 μL FDA液，使FDA終濃度為0.25 mg/mL，20 ℃反應5 min后，制片并在熒光顯微鏡下觀察[11-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca2+對大腸埃希菌內(nèi)膜通透性和質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化率的影響

圖1為Ca2+對大腸埃希菌內(nèi)膜通透性的變化及轉(zhuǎn)化率的影響。當Ca2+濃度小于100 mmol/L時，隨著Ca2+濃度的增加質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化率增大，在Ca2+濃度為100 mmol/L時轉(zhuǎn)化率達到最大，隨后隨著Ca2+濃度的逐漸增大，轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢。與此同時，隨著Ca2+濃度的增大，內(nèi)膜的通透性逐漸增高，但轉(zhuǎn)化率與內(nèi)膜通透性的變化并不完全呈正相關。

圖1 Ca2+對大腸埃希菌內(nèi)膜通透性的變化及轉(zhuǎn)化率的影響

Fig.1 The effect on inner membrane permesbility and transformation ofE.coliby Ca2+

2.2 Ca2+對大腸埃希菌外膜通透性和質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化率的影響

Ca2+對大腸埃希菌外膜通透性的變化和轉(zhuǎn)化率的影響如圖2所示。當Ca2+濃度小于100 mmol/L時，質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化率與Ca2+濃度呈正相關，外膜通透性在Ca2+濃度為80 mmol/L時達到最大。而當Ca2+濃度大于100 mmol/L時，由于離子濃度過大，細胞失水破裂失去活性，轉(zhuǎn)化率和外膜通透性減小。

圖2 Ca2+對大腸埃希菌外膜通透性的變化及轉(zhuǎn)化率的影響

Fig.2 The effect on outer membrane permesbility and transformation ofE.coliby Ca2+

2.3 Sr2+對大腸埃希菌內(nèi)膜通透性和質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化率的影響

由圖3可看出，隨著Sr2+濃度的變化大腸埃希菌內(nèi)膜的通透性和轉(zhuǎn)化率均發(fā)生變化。當Sr2+濃度為80 mmol/L時，大腸埃希菌內(nèi)膜的通透性最強，隨著離子濃度的增大，內(nèi)膜通透性逐漸減弱，而質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化率在Sr2+濃度小于100 mmol/L時逐漸增大，在100 mmol/L時達到最大，隨后由于Sr2+濃度過大導致細胞失水破裂喪失活性，轉(zhuǎn)化率逐漸降低。

圖3 Sr2+對大腸埃希菌內(nèi)膜通透性的變化及轉(zhuǎn)化率的影響影響

Fig.3 The effect on inner membrane permesbility and transformation ofE.coliby Sr2+

2.4 Sr2+對大腸埃希菌外膜通透性和質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化率的影響

Sr2+對大腸埃希菌外膜通透性和質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化率的影響如圖4所示。當Sr2+濃度為60 mmol/L時，外膜的通透性達到最強，Sr2+濃度為100 mmol/L時轉(zhuǎn)化率最大。

圖4 Sr2+對大腸埃希菌外膜通透性的變化及轉(zhuǎn)化率的影響

Fig.4 The effect on outer membrane permesbility and transformation ofE.coliby Sr2+

2.5 Sr2+和Ca2+介導質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化率的比較

圖5為Sr2+和Ca2+誘導下轉(zhuǎn)化率的變化。離子濃度<100 mmol/L時，Ca2+介導的細胞轉(zhuǎn)化率明顯高于Sr2+；離子濃度為100 mmol/L時，二者的介導作用相當；當離子濃度>100 mmol/L時，Sr2+介導的細胞的轉(zhuǎn)化率略高于Ca2+。

圖5 Sr2+和Ca2+介導大腸埃希菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化率

Fig.5 The transformation efficiency ofE.colicompetent cells induced by Sr2+and Ca2+, respectivly

2.6 Ca2+處理前后大腸埃希菌細胞傅里葉紅外光譜

Ca2+處理前后大腸埃希細胞紅外光譜如圖6所示。在3 750～3 000 cm、1 800～1 500 cm、1 500～1 000 cm均有特征吸收峰。在3 750～3 000 cm處有寬展圓滑的強吸收峰O-H鍵的伸縮振動；在1 800～1 500 cm處的吸收峰為-OH的變形振動；1 500～1 000 cm處的吸收峰為C-O的伸縮振動。對比a、b和c可以看出，b感受態(tài)細胞在1 500～2 000 cm處的強度增強，有蛋白質(zhì)和肽段的酰胺吸收區(qū)域(1 800～1 500 cm)；在3 400cm處(N-H和O-H鍵)的吸收峰感受態(tài)a、b要比參照組c寬。

圖6 Ca2+處理前后大腸埃希菌細胞的傅里葉紅外光譜

Fig.6 The FT-IR spectrum ofE.coliunder pre-and post-treatment by Ca2+

a:轉(zhuǎn)化后細胞的紅外光譜；b：Ca2+作用后的感受態(tài)細胞的紅外光譜；c：未被Ca2+處理的大腸埃希菌細胞紅外光譜

a:IR spectrun of transformation cells;b:IR spectrun of competent cells treated by Ca2+;c:IR spectrun of nature cells

2.7 掃描電鏡結(jié)果

掃描電鏡結(jié)果見圖7。未被Ca2+處理的大腸埃希菌細胞(圖7a)呈簇聚集，細胞發(fā)生粘連現(xiàn)象且邊緣較清晰，表面有微小的凸起；Ca2+處理后的感受態(tài)細胞(圖7b)整體呈分散狀態(tài)，局部發(fā)生聚集，細胞發(fā)生失水皺縮，表面出現(xiàn)很大的凹陷發(fā)生空化并有褶皺；轉(zhuǎn)化后的大腸埃希菌(圖7c)細胞融合了外源DNA呈獨立存在狀態(tài)，邊緣異常清晰，表面凸起并有細小亮光，細胞飽滿表面光滑度提高，亮度增強。

圖7 Ca2+處理前后大腸埃希菌細胞表面結(jié)構(gòu)

Fig.7 The cells surface structure ofE.coliunder pre-and post-treatment by Ca2+

A：原始細胞；b：感受態(tài)細胞；c：轉(zhuǎn)化后的大腸埃希菌

a:primitive cells;b:competent cells;c:transformed cells

2.8 Ca2+與Sr2+介導后的大腸埃希菌熒光圖片

圖8為大腸埃希菌在Ca2+和Sr2+作用下的熒光圖片。由圖8可知，未被Ca2+處理的細胞內(nèi)外膜較完整，熒光素FDA無法進入細胞內(nèi)產(chǎn)生熒光，故在熒光顯微鏡下無法展現(xiàn)熒光。但在Ca2+和Sr2+的作用下，大腸埃希菌細胞內(nèi)外膜的通透性發(fā)生了改變，熒光素FDA進入細胞后發(fā)生水溶性反應進而產(chǎn)生熒光。

圖8 Ca2+ 、Sr2+ 作用前后的大腸埃希菌在熒光顯微鏡下的照片F(xiàn)ig.8 The fluorescent images of E.coli under under pre-and post-treatment by Ca2+ and Sr2+, respectivly a:原始大腸埃希菌DH5α； b: Ca2+處理大腸埃希菌DH5α；c: Sr2+處理大腸埃希菌DH5αa: primitive cells DH5α；b:E.coli DH5α treated by Ca2+； c: E.coli DH5α treated by Sr2+

3 討 論

本研究從宏觀和微觀層面研究了不同濃度的Ca2+和Sr2+對大腸埃希菌細胞膜及對質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸埃希菌的影響，以期揭示金屬離子介導的感受態(tài)細胞的形成及轉(zhuǎn)化發(fā)生的生物學機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ca2+與Sr2+均能介導質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化進入大腸埃希菌細胞，且在濃度為100 mmol/L時二者的轉(zhuǎn)化率一致；兩種金屬離子的誘導對宿主細胞內(nèi)外膜的通透性有很大影響，但細胞內(nèi)外膜通透性的強弱與轉(zhuǎn)化率并無明顯的相關性；電鏡觀察結(jié)果顯示：在金屬離子的作用下胞內(nèi)物質(zhì)釋放，導致大腸埃希菌細胞發(fā)生了明顯的空化現(xiàn)象，細胞變的光滑獨立，而轉(zhuǎn)化后的細胞形態(tài)飽滿[14]，菌體表面亮度增加[15]。以上結(jié)果表明，二價的金屬離子能夠誘導感受態(tài)細胞的形成及轉(zhuǎn)化的發(fā)生，但金屬離子是否最終作用于肽聚糖，為DNA進入宿主細胞提供離子通道還是改變了宿主細胞的物理結(jié)構(gòu)只是一種猜測，有待進一步研究論證。

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The Effects of Ca2+, Sr2+on the Induction of the Formation and Transformation ofE.coliCompetence Cells

WANG Yong-gang1, SUN Shang-chen1, MA Xue-qing2, QIN Jian-yu1, LENG Fei-fan1

(1.LanzhouUni.ofTechnol.;Schl.ofSci. &Engin.,Lanzhou730050; 2.LanzhouVet.Res.Inst.,ChineseAcad.ofAgric.Sci.,Lanzhou730046)

In order to study the formation mechanism of competence cells under the induction of metal ions and reveal the transformation mechanism, Ca2+and Sr2+(0～140 mmol/L) were respectively used in this study to prepareE.colicompetence cells and transform them. The results showed that the valence of competence cells induced by different concentration of Ca2+; Sr2+ions was different and the two metal ions all had fairly large effects onE.colicell internal and external membrane permeability, however, no direct relation to the degree of variation and transformation rate of the cell internal and external membrane. The results of EM observation showed that the untreated cells were adhered with each other into cluster; but the competence cells were disperse in total, adhered partly; the existence of cells after transformation were independent with clear edges.

Ca2+; Sr2+; permeability; competence cells; transformation

國家自然科學基金項目(31460032)；甘肅省自然科學基金項目(1308RJZA287)；蘭州理工大學紅柳青年計劃項目(10-061406)

王永剛 男，碩士，講師。研究方向為微生物生理與遺傳轉(zhuǎn)化。E-mail：412316788@qq.com

孫尚琛 男，碩士研究生。研究方向為微生物生理與遺傳轉(zhuǎn)化。E-mail：597520119@qq.com

2015-06-02；

2015-08-07

Q932

A

1005-7021(2016)02-0020-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.004