張 雪， 錢冬萌， 胡 明， 陳 豪， 李 玲， 張 麗， 宋旭霞， 王 斌

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，山東 青島 266071)

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神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ATF5表達(dá)水平對HCMV復(fù)制的影響

張 雪， 錢冬萌， 胡 明， 陳 豪， 李 玲， 張 麗， 宋旭霞， 王 斌*

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，山東 青島 266071)

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV) 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的復(fù)制水平不一，其機(jī)制尚不清楚。本研究通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，檢測HCMV感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞后病毒復(fù)制水平的變化。首先用HCMV AD169 (MOI=5) 分別感染U87、SY5Y及A172細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)變化，分別在24、48、72、96、120 h取各時間點(diǎn)上清液檢測病毒滴度；Real-time PCR檢測HCMV即刻早期基因(IE2)、早期基因(UL44)、晚期基因(UL99)及ATF5的表達(dá)情況;Western-blot檢測病毒基因編碼蛋白及ATF5表達(dá)的情況。結(jié)果顯示HCMV在U87、SY5Y細(xì)胞中復(fù)制水平與病毒在A172細(xì)胞中復(fù)制水平相比，U87、SY5Y細(xì)胞組明顯高于A172細(xì)胞組(P<0.05)，ATF5表達(dá)在U87、SY5Y細(xì)胞組與A172細(xì)胞組相比，U87、SY5Y細(xì)胞組ATF5表達(dá)明顯高于A172組(P<0.05)；利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)下調(diào)ATF5在U87、SY5Y細(xì)胞的表達(dá)，用HCMV感染細(xì)胞檢測病毒基因及蛋白的表達(dá)，結(jié)果ATF5表達(dá)下調(diào)可抑制HCMV的復(fù)制(P<0.05)。以上結(jié)果表明，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中下調(diào)ATF5表達(dá)水平可以抑制HCMV的復(fù)制水平。

人巨細(xì)胞病毒；轉(zhuǎn)錄激活因子5；復(fù)制；人膠質(zhì)瘤細(xì)胞；病毒基因

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)屬于β皰疹病毒亞科，是人類皰疹病毒中最大的一組病毒。在人群中，HCMV感染相當(dāng)普遍，大多數(shù)感染呈臨床隱性感染或潛伏感染；但在新生兒、免疫抑制或免疫功能低下的人群中則可引起臨床顯性感染，出現(xiàn)明顯癥狀， 甚至發(fā)生致死性疾病。HCMV基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)呈現(xiàn)一定時序性,即表達(dá)可分為即刻早期(immediately，early IE)、早期(early，E)和晚期(late，L)，IE基因編碼產(chǎn)生的即刻早期蛋白可激活E基因編碼的蛋白參與病毒復(fù)制，L基因編碼蛋白參與病毒顆粒的結(jié)構(gòu)組成[1]。HCMV感染和惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤關(guān)系密切，Cobbs等[2]對27例不同級別的膠質(zhì)瘤組織(Ⅱ～Ⅳ級)、腦膜瘤組織、正常腦組織進(jìn)行免疫組化檢測，結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤均可檢測到HCMV基因的表達(dá)，且隨惡性程度增高而增高，而腦膜瘤組織、正常腦組織均未檢測到HCMV基因的表達(dá)。有研究表明CREB-A可以和IE蛋白相互作用，并可以激活HCMV UL112-113啟動子，從而啟動病毒基因表達(dá)[3-6]。有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)機(jī)體感染HSV-1時，ATF5可以通過某些潛在的機(jī)制促進(jìn)HSV-1病毒的復(fù)制[7]。而我們研究中的轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)是轉(zhuǎn)錄因子ATF/CREB家族成員之一，具有亮氨酸拉鏈(bZIP)的特征結(jié)構(gòu)域，能與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白分子相互作用，共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[8-9]。因此推測：神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ATF5的表達(dá)水平可影響HCMV在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的復(fù)制水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細(xì)胞 HCMV AD169毒株由法國巴斯德研究所贈送，按常規(guī)方法傳代，滴定。人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)由本實(shí)驗(yàn)室保存，用于HCMV病毒的擴(kuò)增。U87、SY5Y、A172細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫，按常規(guī)方法培養(yǎng)、傳代后，第5代后用于本實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清(FBS，Hyclone)、MEM(Hyclone)、DMEM(Hyclone)、DMEM/F12(Hyclone)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma)、Trizol(Invitrogen)、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)、Real-time PCR Master Mix(Roche)、RIPA 細(xì)胞裂解液(Solarbio)、PMSF(Solarbio) 、Anti-Cytomegalovirus IE(ViroStat)、anti-UL44 (Santa Cruz Biotechnology)、anti-UL99(Santa Cruz Biotechnology)、Anti-ATF5 antibody(abcom)、HRP山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG、BIO RAD Real-time PCR儀(My-iQ Optics Module)、蛋白凝膠電泳系統(tǒng)(韋伯)、激光共聚焦顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 HCMV病毒增殖和滴度測定 取出凍存的HCMV AD169毒株(法國巴斯德研究所惠贈)，在流水中迅速融化，將對數(shù)生長期的HELF更換2%血清培養(yǎng)基，加入200 μL病毒懸液，將其放入37 ℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)2 h，期間每隔15 min輕輕搖動培養(yǎng)瓶。棄掉培養(yǎng)液后，加入含有2%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，觀察并記錄細(xì)胞的變化，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)達(dá)80%以上時用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液，-86 ℃反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞破裂病毒顆粒被釋放，1 000 r/min離心10 min，收集上清液為病毒儲存液，分裝于EP管放于-86 ℃冰箱保存?？瞻叨繖z測病毒滴度為106pfu/mL。

1.2.2 HCMV感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞后收集上清檢測病毒滴度 HCMV AD169 (MOI=5)分別感染U87、SY5Y、A172和HELF細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)變化，分別在24、48、72、96、120 h取各時間點(diǎn)上清液離心。將HELF接種于24孔板，細(xì)胞形成單層后棄掉培養(yǎng)液，分別取上清0.2 mL/孔加到24孔板內(nèi)，每個樣品設(shè)3個平行對照，并以不接種病毒的HELF作正常對照，于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)使病毒充分吸附后棄掉病毒液，加入1 mL含1%低熔點(diǎn)瓊脂糖、2% FBS的培養(yǎng)液，室溫下凝固后，置于恒溫箱中倒置培養(yǎng)后加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),10 d后取出培養(yǎng)板,顯微鏡下計(jì)數(shù)空斑數(shù)?？瞻咝纬蓡挝唬簆fu/mL=每孔內(nèi)空斑平均數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)/每孔接種的病毒量(mL)。

1.2.3 熒光定量PCR分別檢測IE2、UL44、UL99 及ATF5 mRNA的表達(dá)水平變化 HCMV AD169 (MOI=5)分別感染U87、SY5Y及A172細(xì)胞，分別在0、12、24、48、72 h 用Trizol法提取RNA，紫外分光光度計(jì)定量后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 置于-20 ℃用于Real-time PCR的模板。Real-time PCR 采用β-actin作為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因與目的基因各設(shè)3個平行反應(yīng)管。引物由上海生工生物有限公司合成， β-actin上游引物5′-TCGTGGGCCGCTCTAGGCAC-3′，下游引物5′-TGGCCTTAGGGTTCAGGGGG-3′； IE2上游引物5′-TGACCGAGGATTGCAACGA-3′，下游引物5′-CGGCATGATTGACAGCCTG-3′； UL44上游引物5′-TACAACAGCGTGTCGTGCTCCGCG -3′，下游引物5′-GGCGTGAAAAACATGCGTATCAAC-3′； UL99上游引物5′-GTGTCCCATTCCCGACTCG-3′，下游引物5′-TTCACAACGTCCACCCACC-3′；ATF5上游引物5′-AAGTCGGCGGCTCTGAGGTA-3′，下游引物5′-GGACTCTGCCCGTTCCTTCA-3′。反應(yīng)體系為20 μL，其中10 μL SYBR green mixture，上下游引物分別1 μL，cDNA 2μL，加水至20 μL。94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，循環(huán)40次。在55 ℃ 30 s時讀取熒光值。

1.2.4 蛋白提取及Western-blot檢測IE2、UL44、UL99 及ATF5蛋白的表達(dá) HCMV AD169 (MOI=5)分別感染U87、SY5Y及A172細(xì)胞，分別在0、24、48、72、96 h提取總蛋白，將細(xì)胞培養(yǎng)皿放于冰上用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入200 μL含有1 μmol/L PMSF的細(xì)胞裂解液，冰浴10 min后，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到EP管中，再放冰上20 min使其充分裂解，12 000 r/min 4 ℃離心6 min，上清液為總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE將蛋白分離，濕法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用TBST清洗膜3次，每次10 min，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別按要求稀釋后加入β-actin，IE2、UL44、UL99及ATF5抗體4 ℃孵育過夜，用TBST清洗膜3次，每次10 min，再加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h，TBST清洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光。以β-actin作為內(nèi)參，Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)含量。

1.2.5 慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)對感染條件進(jìn)行篩選，將細(xì)胞接種于96孔板,病毒感染時使細(xì)胞融合度達(dá)20%～30%保持細(xì)胞狀態(tài)良好。設(shè)4個組分別為Complete Medium、Complete Medium+5 μg/mL Polybrene、Enhanced Infection Solution(Eni.S.)及Eni.S.+5 μg/mL Polybrene，每組設(shè)5個復(fù)感染指數(shù)(MOI=1、5、10、15、50)，每個孔設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)8～12 h以后觀察細(xì)胞形態(tài)，并更換新鮮培養(yǎng)液，感染3～4 d后，觀察熒光表達(dá)情況，確認(rèn)最佳感染條件和感染參數(shù)。在最佳感染狀態(tài)下，將陰性對照慢病毒CON053及LV-ATF5-RNAi分別感染U87和SY5Y細(xì)胞，待細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，提取蛋白，WB檢測ATF5的表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HCMV感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞后收集上清檢測病毒滴度

HCMV感染U87、SY5Y、A172后觀察細(xì)胞形態(tài)變化, U87、SY5Y細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的變化，細(xì)胞觸角由細(xì)長變粗鈍，細(xì)胞由瘦變粗圓(見圖1)，收集不同時間點(diǎn)上清，將上清加入接種HELF的24孔板中，空斑定量檢測病毒滴度。加24、48 h收集的上清液的孔未出現(xiàn)變化，72 h的可檢測到空斑且隨時間延長空斑數(shù)量增多，120 h的空斑數(shù)量最多，病毒滴度最高(見圖2)；而A172細(xì)胞形態(tài)無明顯變化(見圖1)，也未檢測到空斑，對照HELF組在HCMV感染72 h時開始出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(見圖1)，收集上清檢測病毒滴度，加72 h的可檢測到空斑，120 h的空斑數(shù)量最多，病毒滴度最高(見圖2)。

圖1 A172、U87、SY5Y和HELF感染HCMV后形態(tài)變化Fig.1 The morphology changes of the A172、U87、SY5Y and HELF which were infected with HCMVA、C、E、G：未感染HVMV細(xì)胞；B、D、F、H：感染HVMC 72 h后細(xì)胞A，C，E，G：mock infected；B，D，F(xiàn)，H：infected with HCMV 72 h

圖2 HCMV感染膠質(zhì)瘤和HELF收集上清檢測病毒滴度Fig.2 HCMV infection HELF and glioma cells then the supernatant was collected to detect the virus titer

2.2 HCMV感染U87、SY5Y及A172后其IE2、UL44、UL99及ATF5基因mRNA表達(dá)

Real-time PCR檢測顯示，HCMV感染U87、SY5Y細(xì)胞在12 h IE2基因表達(dá)顯著增高，UL44在12 h開始表達(dá)48 h達(dá)高峰，UL99在12 h開始有表達(dá)72 h達(dá)高峰，ATF5在72 h表達(dá)出現(xiàn)高峰；而HCMV感染A172細(xì)胞僅UL44在72 h有少量表達(dá)，ATF5的表達(dá)較低。U87、SY5Y及A172中IE2、UL44、UL99及ATF5 mRNA相對表達(dá)含量見圖3。

圖3 Real-time PCR檢測A172、U87和SY5Y組IE、UL44、UL99、ATF5 mRNA的表達(dá)Fig.3 Expressions of IE、UL44、 UL99、ATF5 mRNA in A172、U87 and SY5Y cells infected with HCMV by Real-time PCRA：A172細(xì)胞；B：U87細(xì)胞；C：SY5Y細(xì)胞，圖4同A：A172 cell；B：U87 cell；C：SY5Y cell,same figure 4

2.3 HCMV感染U87、A172后其IE2、UL44、UL99及ATF5蛋白表達(dá)

Western-blot檢測顯示，HCMV感染U87、SY5Y細(xì)胞，IE2蛋白在24 h顯著表達(dá)，在96 h達(dá)高峰，UL44在24 h開始表達(dá)72 h明顯增高，96 h達(dá)高峰，UL99在48 h開始有表達(dá)96 h達(dá)高峰，ATF5表達(dá)在72 h明顯增高96 h出現(xiàn)高峰，IE2、UL44、UL99及ATF5四種蛋白相對表達(dá)含量均高于未感染組和A172組(P<0.05)；而HCMV感染A172細(xì)胞僅UL44在96 h有少量表達(dá)， ATF5的表達(dá)低于U87、SY5Y細(xì)胞(見圖4)。結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果一致，A172、U87及SY5Y中IE2、UL44、UL99及ATF5 蛋白相對表達(dá)含量見表1。

HCMV感染U87、SY5Y兩組細(xì)胞后，Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示IE2與ATF5表達(dá)具有明顯正相關(guān)性，U87(r=0.955,P<0.05)，SY5Y(r=0.956,P<0.05)。而HCMV IE基因編碼產(chǎn)生的即刻早期蛋白可激活E基因,E基因編碼的蛋白參與病毒復(fù)制[1]，IE基因編碼兩種重要的調(diào)控蛋白IE1(IE72)和IE2(IE86)；有文獻(xiàn)報(bào)道CREB-A可以和IE蛋白相互作用，并可以激活HCMV UL112-113啟動子，從而啟動病毒基因表達(dá)[3-6]，而本研究的轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)隸屬轉(zhuǎn)錄因子ATF/CREB家族，能與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白分子相互作用，共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，因此下調(diào)ATF5在U87、SY5Y細(xì)胞表達(dá)，檢測ATF5對HCMV復(fù)制水平的影響。

圖4 Western-blot檢測A172、U87和SY5Y組IE、UL44、UL99、ATF5蛋白的表達(dá)Fig.4 Expressions of IE，UL44， UL99 and ATF5 protein in A172，U87 and SY5Y cells infected with HCMV by Western-blot

組別IEUL44UL99ATF5A172組0h0000．23±0．0624h0000．19±0．0448h0000．11±0．03?72h0000．05±0．08?96h00．10±0．04?00．02±0．05?U87組0h0000．27±0．0224h0．46±0．05?▲0．27±0．09?▲00．33±0．05▲48h0．52±0．11?▲0．40±0．13?▲0．23±0．07?▲0．43±0．08?▲72h0．69±0．06?▲0．62±0．08?▲0．43±0．09?▲0．64±0．03?▲96h1．13±0．10?▲0．71±0．16?▲0．73±0．13?▲0．79±0．07?▲SY5Y0h0000．25±0．0724h0．37±0．07?▲0．11±0．04?▲00．29±0．03▲48h0．50±0．04?▲0．14±0．02?▲00．40±0．07?▲72h0．63±0．09?▲0．51±0．05?▲0．23±0．06?▲0．51±0．06?▲96h1．00±0．10?▲0．60±0．08?▲0．58±0．12?▲0．67±0．05?▲

注:A172、U87、SY5Y三組細(xì)胞與自身未感染病毒組細(xì)胞相比*P<0.05 ，在相同時間點(diǎn)U87、SY5Y分別與A172相比 ▲P<0.05

2.4 慢病毒感染U87、SY5Y細(xì)胞效率檢測

在Complete Medium+5 μg/mL Polybrene條件下U87(MOI=1)、SY5Y(MOI=15)慢病毒感染效率最高(感染效率=每個高倍鏡下熒光細(xì)胞數(shù)量/同一鏡下普通顯微鏡計(jì)數(shù))在感染72 h時轉(zhuǎn)染效率可達(dá)95 %，激光共聚焦顯微鏡下可見紅色熒光蛋白(圖5)。

圖5 熒光顯微鏡檢測慢病毒感染效率Fig.5 Detect the lentivirus infection efficiency by fluorescence microscopyA:慢病毒感染的U87細(xì)胞(微分干涉顯微鏡(DIC))；B:慢病毒感染的U87細(xì)胞(熒光顯微鏡)；C:merge；D:慢病毒感染的SY5Y的細(xì)胞(微分干涉顯微鏡(DIC))；E:慢病毒感染的SY5Y細(xì)胞(熒光顯微鏡)；F:mergeA:U87 cell infected with lentivirus(differential interference contrast microscope (DIC))；B:U87 cell infected with lentivirus(Fluorescence microscope)；C:merge；D:SY5Y cell infected with lentivirus(differential interference contrast microscope (DIC))；E: SY5Y cell infected with lentivirus(Fluorescence microscope)；F:merge

2.5 慢病毒對ATF5沉默效率的檢測

慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U87和SY5Y細(xì)胞后提取蛋白，Western-blot檢測，結(jié)果顯示LV-ATF5-RNAi組中ATF5表達(dá)明顯減低，而正常組和陰性對照CON053組ATF5的表達(dá)無明顯變化(圖6)，其中U87細(xì)胞正常組、陰性對照CON053組和LV-ATF5-RNAi組ATF5的相對表達(dá)量分別為0.31±0.02、0.29±0.02、0.07±0.03，SY5Y細(xì)胞正常組、陰性對照CON053組和LV-ATF5-RNAi組ATF5的相對表達(dá)量分別為0.29±0.01、0.28±0.04、0.06±0.03。

圖6 Western-blot 檢測慢病毒對ATF5的沉默效率Fig.6 Western-blot analyzes the efficiency of lentiviral silencing ATF51～3:U87細(xì)胞；4～6：SY5Y細(xì)胞；1、4正常細(xì)胞組；2、5：陰性對照CON053組；3、6：LV-ATF5-RNAi組1～3:U87 cell；4～6：SY5Y cell，1，4 the normal group；2，5：the CON053 group；3，6：LV-ATF5-RNAi group

2.6 沉默ATF5表達(dá)，病毒在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平的變化

Real-time PCR檢測顯示，沉默ATF5的U87、SY5Y細(xì)胞IE2在12 h開始表達(dá)72 h表達(dá)最多；UL44、UL99在24 h開始有表達(dá)72 h表達(dá)最多。IE2、UL44、UL99與相應(yīng)時間點(diǎn)陰性對照CON053組相比其相對表達(dá)量均下降(見圖7)。

圖7 Real-time PCR檢測ATF5 的U87和SY5Y細(xì)胞中 IE、UL44、UL99 mRNA的表達(dá)Fig.7 Expressions of IE，UL44， UL99 mRNA in U87，SY5Y cells after silencing ATF5 expression by Real-time PCRA:U87細(xì)胞CON053組；B:U87細(xì)胞LV-ATF5-RNAi組；C:SY5Y細(xì)胞CON053組；D:SY5Y細(xì)胞LV-ATF5-RNAi組，圖8同 A:U87 cell CON053 group;B:U87 cell LV-ATF5-RNAi group;C:SY5Y cell CON053 group;D:SY5Y cell LV-ATF5-RNAi group，same figure 8

2.7 沉默ATF5表達(dá)，病毒在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平的變化

Western-blot檢測顯示， HCMV感染沉默ATF5的U87、SY5Y細(xì)胞后IE2蛋白在24 h開始有表達(dá)，在96 h達(dá)高峰；UL44蛋白U87細(xì)胞在24 h開始表達(dá)，SY5Y細(xì)胞在48 h有表達(dá)，兩細(xì)胞在96 h達(dá)高峰；UL99蛋白在72 h開始有表達(dá)(見圖8)。IE2、UL44、UL99與相應(yīng)時間點(diǎn)陰性對照CON053組相比其表達(dá)量均下降(P<0.05)，結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果一致(見表2、3)，結(jié)果表明下調(diào)ATF5的表達(dá)后，HCMV在U87、SY5Y細(xì)胞中復(fù)制水平下降。

圖8 Western-blot檢測沉默ATF5 的U87和SY5Y 細(xì)胞中IE、UL44、UL99蛋白的表達(dá)Fig.8 Expressions of IE，UL44 and UL99 protein in U87 and SY5Y cells after silencing ATF5 expression by Western-blot

組別IEUL44UL99U87(CON053)0h00024h0．43±0．070．22±0．06048h0．49±0．050．34±0．070．21±0．0972h0．60±0．040．59±0．080．40±0．0696h0．98±0．050．65±0．060．67±0．08U87(LV?ATF5?RNAi)0h00024h0．12±0．08?0?048h0．23±0．03?0．12±0．07?0?72h0．27±0．05?0．17±0．05?0．24±0．08?96h0．35±0．09?0．26±0．05?0．28±0．06?

注:相同時間點(diǎn)U87(LV-ATF5-RNAi)組與U87(CON053)組相比*P<0.05

表3 沉默ATF5的SY5Y細(xì)胞IE、UL44和UL99蛋白相對表達(dá)量比較

注:相同時間點(diǎn)SY5Y(LV-ATF5-RNAi)組與SY5Y(CON053)組相比*P<0.05

3 討 論

人巨細(xì)胞病毒感染和神經(jīng)膠質(zhì)瘤關(guān)系密切, 調(diào)節(jié)HCMV復(fù)制和再激活的因素并不十分清楚，但細(xì)胞因子可能起到重要作用，在病毒基因激活時細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和病毒反式激活因子是必不可少的[10-13]。病毒編碼的主要即刻早期調(diào)控蛋白IE86可與宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子相互作用從而激活自身的表達(dá),而在一些非允許細(xì)胞系中IE的表達(dá)受到抑制，有研究已證明IE基因編碼產(chǎn)生的即刻早期蛋白可激活E基因編碼的蛋白參與病毒復(fù)制[1]。

轉(zhuǎn)錄激活因子 5(ATF5)是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一個標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子，最近研究表明CREB-A可以和IE蛋白相互作用，并可以激活HCMV UL112-113啟動子，從而啟動病毒基因表達(dá)[3-6]。轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)隸屬轉(zhuǎn)錄因子ATF/CREB家族，具有亮氨酸拉鏈(bZIP)的特征結(jié)構(gòu)域，能與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白分子相互作用，共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[8-9]。許多研究表明ATF5與細(xì)胞增殖分化凋亡有關(guān)[14-15]。然而有關(guān)ATF5的表達(dá)對HCMV復(fù)制水平的影響少見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，HCMV感染不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞后病毒復(fù)制水平不一，Real-time PCR 及Western-blot顯示在不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ATF5的表達(dá)與IE2的表達(dá)具有明顯正相關(guān)性，提示ATF5的表達(dá)可能促進(jìn)HCMV病毒的復(fù)制。為進(jìn)一步證明ATF5在HCMV感染中可能的作用，以慢病毒為載體構(gòu)建ATF5小干擾RNA下調(diào)ATF5在U87、SY5Y細(xì)胞的表達(dá)。沉默U87、SY5Y細(xì)胞內(nèi)源性ATF5后，觀察HCMV感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞后IE表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，下調(diào)ATF5的表達(dá)，病毒蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。結(jié)果表明，下調(diào)ATF5的表達(dá)可抑制HCMV病毒的復(fù)制。因此，預(yù)防HCMV感染或者下調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性ATF5表達(dá)，可作為治療膠質(zhì)瘤新的治療靶點(diǎn)。本研究僅對ATF5表達(dá)和HCMV在神經(jīng)膠質(zhì)瘤復(fù)制水平表型作了初步研究，其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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The Effects of ATF5 Expression Level in Glioma Cells on HCMV Replication

ZHANG Xue, QIAN Dong-meng, HU Ming, CHEN Hao, LI Ling, ZHANG Li, SONG Xu-xia, WANG Bin

(Teach. &Res.Div.ofPatho.Microb.,Col1.ofMed.QingdaoUni.,Qingdao266071)

The replication levels of human cytomegalovirus (HCMV) in gliomata are different, and the mechanism is still unknown. In this study the changes of replication levels of the virus after its infection of gliomata were detected through down-regulation of the expression of activation transcription factor 5 (ATF5) in gliomata. Firstly, cells U87, SY5Y, and A172 were infected with HCMV respectively, and observe the changes of their cellular morphology, and collect each of their supernatants at the time points of 24, 48, 72, 96, and 120 h to test their viral titers, and detect the expression situation of incontinent incipient gene IE2, incipient gene UL44, terminal gene UL99, and ATF5 with real-time PCR, and detect the expression situation of the HCMV coded protein and ATF5 with Western-blot. The results showed that as compared the replication level of HCMV in cells A172 with the ones in cells U87 and SY5Y, the group of U87 and SY5Y cells were significantly higher than that of the replication level in the group of A172 cells (P<0.05); and as compared the expression of ATF5 in the groups of U87 cell and SY5Y cell were significantly higher than the group of A172 (P<0.05); Using lentivirus mediation RNA interfering technique to down-regulate the expression of ATF5 in U87 and SY5Y, using HCMV infected cells to detect the expression of viral gene and protein, the results showed that the down-regulation of the expression of ATF5 could inhibit the replication of HCMV (P<0.05). The above results showed that down-regulate the expression level of ATF5 in glioma cell could inhibit the replication level of HCMV.

human cytomegalovirus (HCMV); activation transcription factor 5 (ATF5); replication; human glioma cell; viral gene

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81471958)；青島大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)青年教師培育項(xiàng)目；青島市博士后應(yīng)用研究項(xiàng)目資助(2015160)

張雪 女，碩士研究生。主要研究方向?yàn)椴《净蚬こ膛c蛋白質(zhì)組學(xué)研究。E-mail：zhangxueqy701@163.com

* 通訊作者。男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。主要研究方向?yàn)榉肿硬《緦W(xué)。Tel：0532-83780032，E-mail：wangbin532@126.com

2015-05-03；

2015-05-16

Q939.93; R 373.9

A

1005-7021(2016)02-0025-08

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.005