石 慧， 肖 暢， 杜小鳳 ， 向星杰 ， 張俊紅

(1.武漢設(shè)計工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

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高效抑制O157∶H7B.s.2012的選育及抗菌物質(zhì)提取的研究

石 慧1， 肖 暢1， 杜小鳳1， 向星杰1 ， 張俊紅2*

(1.武漢設(shè)計工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

對枯草芽胞桿菌2012進(jìn)行誘變，提高抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量，并提取抗菌物質(zhì)。用紫外線及亞硝基胍協(xié)同誘變處理對數(shù)生長中期的枯草芽胞桿菌2012 (B.s.2012)，在大腸埃希菌為敏感菌的生物鑒定板上篩選產(chǎn)量提高的菌株。比較用乙酸乙酯法、80%乙醇法和甲醇法提取抗菌物質(zhì)的優(yōu)劣。正交試驗(yàn)優(yōu)化甲醇提取法。突變株B.s.2012-21和B.s.2012-28的抑菌圈直徑比原菌株分別增大84.62%和40.38%。甲醇法提取的得率最高。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，提取pH為2.0，菌株發(fā)酵時間為36 h，4 ℃處理時間為36 h時，抗菌物質(zhì)的得率最高。獲得抗菌物質(zhì)產(chǎn)量大幅提高的B.s.2012-21突變菌株。甲醇法是提取抗菌物質(zhì)得率最高的方法。

枯草芽胞桿菌；抗菌物質(zhì)；紫外誘變；NTG誘變；提取

枯草芽胞桿菌能分泌具有潛在生物醫(yī)藥價值的低分子量的抗菌肽和細(xì)菌素類的抗菌活性物質(zhì)，且對人及動物無害，這對于人類和動物疾病治療具有重要意義[1]，目前產(chǎn)抗菌物質(zhì)的芽胞桿菌主要用于植物病害防治并投產(chǎn)[2]，也廣泛用于動物飼料添加劑[3]。在防治人和動物疾病上，由于枯草芽胞桿菌分泌的抗菌物質(zhì)濃度低，生產(chǎn)及提取成本高，這一領(lǐng)域的應(yīng)用還有很大的拓展空間。O157∶H7是一種主要通過食物傳播的致病菌[4]，在肉及肉制品、奶制品、水、蔬菜沙拉、水果及果醬中都有發(fā)現(xiàn)[55]，可以引起嬰幼兒腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒綜合癥 (HUS) 和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，甚至死亡[6]。本文篩選到1株枯草芽胞桿菌B.s.2012 能有效抑制大腸埃希菌O157∶H7的生長，在控制大腸埃希菌O157∶H7食源性食物中毒及其引起的人畜共患疾病上有很好的應(yīng)用前景，并通過誘變育種改良有效提高了其生產(chǎn)能力，初步研究了其抗菌物質(zhì)的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 枯草芽胞桿菌2012 (B.s.2012)，大腸埃希菌(O157∶H7)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①活化培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，蛋白胨20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；②種子培養(yǎng)基：葡萄糖3.5 g，蛋白胨0.83 g，酵母膏0.5 g，KH2PO40.35 g，CaCO30.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；③發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO40.03 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；④軟瓊脂 LB：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉 7.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。

1.1.3 試劑 4 mg/mL亞硝基胍 (NTG) 溶液[7]，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2 方法

1.2.1B.s.2012 對數(shù)生長中期的測定 取B.s.2012劃線轉(zhuǎn)接至活化培養(yǎng)基平板上，37 ℃ 培養(yǎng)12 h。取活化后的單菌落接入種子培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h備用。以1%的接種量將B.s.2012接入另一瓶種子培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)。從接入液體菌種開始計時，每隔2 h取樣，以種子培養(yǎng)基為空白對照，在波長為600 nm處用分光光度計測定OD600。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制B.s.2012 的生物量曲線，找到生長到對數(shù)生長中期所需的時間。

1.2.2B.s.2012 的紫外線誘變劑量的選擇 將B.s.2012 單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，待生長到對數(shù)生長中期(OD600=0.4～0.5)時，稀釋菌懸液到10-5，取10-5稀釋液10 mL 至無菌平皿，放置在超凈工作臺上，用磁力攪拌器低速攪拌。黑暗中，用紫外燈(約 60 cm高)分別照射5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 min。取各個照射處理后的菌懸液 0.1 mL，在紅光下均勻涂布在活化培養(yǎng)基平板上，用黑色塑料袋包裹，37 ℃培養(yǎng)12 h，計活菌數(shù)，計算致死率。以照射時間為橫坐標(biāo)，B.s.2012 的致死率為縱坐標(biāo)，繪制曲線，找到致死率為70%時的照射時間，即為紫外線誘變劑量。

1.2.3B.s.2012 的亞硝基胍誘變劑量的選擇 以20、40、80、160、320、640 μg/mL 的 NTG 質(zhì)量終濃度處理稀釋到10-5對數(shù)生長中期的B.s.2012 1 h，取0.1 mL 涂布在活化培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h，計活菌數(shù)。以處理質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，B.s.2012 的致死率為縱坐標(biāo)，繪制曲線，找到致死率為70%時 NTG 的工作濃度，即為最適的 NTG 誘變劑量。

1.2.4B.s.2012 的誘變及突變菌株的篩選 將培養(yǎng)到對數(shù)生長中期的B.s.2012 10-5稀釋液10 mL 先在超凈工作臺上用紫外燈照射35 min，再加入質(zhì)量終濃度為 250 μg/mL的 NTG 處理 1 h，取誘變處理后的菌懸液 0.1 mL 涂布于平板上，37 ℃ 培養(yǎng)12 h。分別挑取平板中的單菌落接到種子培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)過夜備用。控制接種量為1%，將各菌株分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)30 h。發(fā)酵液在5 000 r/min 離心10 min 后用 0.22 μm 的無菌過濾膜過濾除菌備用。以大腸埃希菌O157∶H7 為敏感指示菌，取20 μL過夜培養(yǎng)液，混入3 mL 滅菌軟瓊脂 LB，輕輕搖勻，傾倒在活化培養(yǎng)基平板上，鋪平冷卻。取各菌株無菌濾液 10 μL 點(diǎn)接在平板上，晾干1 h，37 ℃ 培養(yǎng)過夜，觀察并測量各個抑菌圈直徑的大小，篩選突變菌株，整個篩選過程以未做誘變處理的B.s.2012 做對照，并始終保持菌體位于黑暗之中。

1.2.5B.s.2012-21 發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的提取 取B.s.2012-21 單菌落接入到種子培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)9 h后轉(zhuǎn)接100 μL至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)30 h。將B.s.2012-21 發(fā)酵液在5 000 r/min下離心15 min，收集上清液備用。①乙酸乙酯法提取抗菌物質(zhì)：取B.s.2012-21 100 mL 發(fā)酵上清液，用等體積乙酸乙酯萃取 2 遍，收集有機(jī)相減壓濃縮至約 30 mL，得到抗菌物質(zhì)的粗提物。將抗菌物質(zhì)粗提物于50 ℃干燥至恒重，用1 mL 甲醇把富集粗提物溶解為溶液，再將其放于50 ℃ 下干燥至恒重，得到抗菌物質(zhì)粗提物結(jié)晶體，稱重。②乙醇法提取抗菌物質(zhì)：取B.s.2012-21 100 mL 發(fā)酵上清液，用 6 mol/L HCl 調(diào)節(jié) pH 值到 2.0，在4 ℃冰箱中靜置24 h (提取時間)后，5 000 r/min 離心15 min，棄上清液。用 2 mL 80%乙醇在室溫下反復(fù)抽提2～3次，5 000 r/min 離心15 min，收集每次離心的上清液，在50 ℃的烘箱中干燥至恒重，得黃褐色粗提物結(jié)晶體，稱重。③甲醇法提取抗菌物質(zhì)：方法同 ②，僅將甲醇置換掉80%的乙醇。將提取所得的結(jié)晶體稱重。④不同方法提取的抗菌物質(zhì)的抑菌試驗(yàn)：用管蝶法檢測不同樣品的抑菌能力[8]。 將不同方法純化的樣品晶體均溶解在2 mL PBS 緩沖液中備用。以O(shè)157∶H7 為敏感菌，過夜培養(yǎng)，取0.1 mL 1 000 倍稀釋的菌液涂布在活化培養(yǎng)基平板上，以提取溶劑乙酸乙酯、甲醇、80%的乙醇溶液及原發(fā)酵液為對照，測試不同樣品的抑菌能力。各樣品均取50 μL到牛津杯中，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑。

1.2.6 甲醇法中影響抗菌物質(zhì)提取得率的主要因素的正交試驗(yàn) 發(fā)酵時間(A)、提取pH(B)、提取時間(C)這3個因素為影響甲醇法提取得率的最重要因素，本試驗(yàn)選取這3個因素做正交試驗(yàn)，每個因素均取3個水平，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)。其正交試驗(yàn)設(shè)計見表1。

表1 3 因素 3 水平正交試驗(yàn)設(shè)計

選取抑菌圈直徑作為試驗(yàn)處理優(yōu)劣的鑒定指標(biāo)，抑菌圈直徑可以直接反映抗菌物質(zhì)提取得率的高低，這樣設(shè)計的正交試驗(yàn)就可說明不同試驗(yàn)號抗菌物質(zhì)的提取效果，進(jìn)而確定最佳的提取方案。

2 結(jié)果與分析

2.1B.s.2012 對數(shù)生長中期的測定結(jié)果

在不同培養(yǎng)時間下取樣，將B.s.2012 原菌液稀釋3倍后，測定OD600，根據(jù)所測得的數(shù)據(jù)繪制其生物量曲線如圖 1。

圖1 B.s.2012 生物量曲線Fig.1 The biomass curve of Bacillus subtilis 2012

由圖 1可知，B.s.2012 培養(yǎng)至約 4 h 開始進(jìn)入對數(shù)生長期，在培養(yǎng)至約 9 h 時，結(jié)束對數(shù)生長，開始進(jìn)入穩(wěn)定期，對數(shù)生長中期的時間約為 6～7 h。本試驗(yàn)選擇培養(yǎng)7 h 的B.s.2012 菌懸液進(jìn)行誘變處理，可以有效地避免芽胞的干擾，有利于誘變處理。

2.2 紫外線誘變劑量的選擇結(jié)果

B.s.2012 在紫外燈照射處理后，根據(jù)照射時間和該照射時間下的致死率繪制了致死率曲線，其結(jié)果如圖 2 所示。

圖2 B.s.2012紫外誘變致死率曲線Fig.2 The death rate curve of B.s.2012 mutagensised by UV

由圖 2可知，枯草芽胞桿菌B.s.2012 用超凈工作臺上紫外燈照射35 min 時，其致死率可達(dá)到70%。在照射距離和紫外燈管的額定功率不變時，35 min即為B.s.2012 合適的紫外線誘變劑量。

2.3B.s.2012 的亞硝基胍誘變劑量的選擇結(jié)果

B.s.2012 經(jīng) NTG 處理1 h 后，根據(jù)處理濃度和該處理濃度下的致死率繪制了致死率曲線，其結(jié)果如圖 3 所示。由圖 3可知，當(dāng) NTG 的濃度為 250 μg/mL時，致死率為70%，此濃度即為 NTG 的最適誘變濃度。

圖3 B.s.2012 NTG誘變致死率曲線

2.4B.s.2012 的誘變處理及突變菌株的篩選結(jié)果

誘變處理后，各存活菌株發(fā)酵液抑菌能力的變化見表 2 及圖 4a、圖 4b。

表2 誘變后各存活菌株發(fā)酵液的抑菌能力測試

Table 2 The antibacterial activity test of

菌株編號抑菌圈直徑/cm各菌株抑菌能力相對提高的百分?jǐn)?shù)/%B．s．20120．52-B．s．2012?10．52↑0．00B．s．2012?20．52↑0．00B．s．2012?30．60↑15．38B．s．2012?40．52↑0．00B．s．2012?50．52↑0．00B．s．2012?60．52↑0．00B．s．2012?70．52↑0．00B．s．2012?80．52↑0．00B．s．2012?90．61↑17．31B．s．2012?100．42↓19．23B．s．2012?110．44↓15．38B．s．2012?120．45↓13．46

續(xù)表2

注:“-”表示未計算出發(fā)菌株對自身抑菌能力提高的百分?jǐn)?shù)；“↑”表示該菌株比出發(fā)菌株抑菌能力提高的百分?jǐn)?shù)；“↓”表示該菌株比出發(fā)菌株抑菌能力低的百分?jǐn)?shù)

圖4 誘變后各菌株對O157∶H7的抑制作用Fig.4 The inhibition by different strains after mutation treatment to O157∶H7

由表2及圖 4a、圖 4b 可知，菌株B.s.2012-21、B.s.2012-28 與未處理的B.s.2012 對照相比抑菌圈直徑明顯增大。經(jīng)多次重復(fù)，這 2 株菌與未誘變處理B.s.2012 在相同的條件下發(fā)酵，當(dāng)敏感菌均為O157∶H7 時，菌株B.s.2012-21、B.s.2012-28 產(chǎn)生的抑菌圈直徑穩(wěn)定大于原B.s.2012 所產(chǎn)生的抑菌圈直徑，說明經(jīng)過誘變處理后，該 2 株菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)的能力提高了。其中， 菌株B.s.2012-21產(chǎn)抗菌物質(zhì)的能力提高了84.62%，B.s.2012-28提高了40.38%。

2.5 不同方法提取枯草芽胞桿菌B.s.2012-21 發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的結(jié)果

2.5.1 不同方法提取B.s.2012-21 發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)晶體質(zhì)量的比較 每種提取方法均取100 mL 相同發(fā)酵液來提取抗菌物質(zhì)，稱量提取后所得的晶體質(zhì)量，結(jié)果如圖 5 所示。由圖 5可知，3種方法中甲醇法提取的抗菌物質(zhì)平均質(zhì)量最高，乙酸乙酯法提取的抗菌物質(zhì)質(zhì)量最低。但由于不能判斷所提取的抗菌物質(zhì)的純度，故還不能判斷哪種提取方法抗菌物質(zhì)的得率最高。

圖5 不同方法提取抗菌物質(zhì)的質(zhì)量比較Fig.5 The quality comparison of antimicrobial substances from different extraction methods

圖6 不同提取法抗菌物質(zhì)溶液的抑菌效果對比Fig.6 The comparison of antibacterial effect of antibacterial substance solution from different extraction method1：乙酸乙酯對照；2：甲醇對照；3：80%乙醇對照；4：原發(fā)酵液對照；5：乙酸乙酯法提取物溶液；6：乙醇法提取物溶液；7：甲醇法提取物溶液1：Ethyl acetate control; 2：Methanol control; 3：80% ethanol control; 4：Control of original fermentation liquid; 5：The solution extracted by Ethyl acetate method; 6：The solution extracted by ethanol method; 7：The solution extracted by methanol method

2.5.2 不同方法提取B.s.2012-21 發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)溶液的抑菌效果比較 將不同方法提取的 抗菌物質(zhì)均用2 mL PBS緩沖液溶解，以O(shè)157∶H7 為敏感菌的抑菌效果見圖6。由圖5及圖6可知，排除對照的影響，甲醇法提取物溶液的質(zhì)量最大，在相同條件下抑菌直徑也最大，所提取的抗菌物質(zhì)溶液抑菌能力最強(qiáng)，乙酸乙酯所提取的抗菌物質(zhì)溶液的抑菌直徑最小，抑菌能力最弱。結(jié)合圖 5 可充分說明甲醇法提取的抗菌物質(zhì)得率最高，在三種方法中占有優(yōu)勢。

2.6 甲醇法中影響抗菌物質(zhì)提取得率的主要因素正交試驗(yàn)的結(jié)果

以發(fā)酵時間(A)、提取pH(B)、提取時間(C)這3個因素設(shè)計正交試驗(yàn)結(jié)果見表 3。

由表 3可知，極差值B>A>C，影響抑菌圈直徑最重要的因素為 pH，其次為發(fā)酵時間，影響最小的因素為樣品在4 ℃ 時的靜置時間。在9個試驗(yàn)組中，抑菌圈直徑最大的試驗(yàn)組合為A2B2C3，即為最優(yōu)組合?？莶菅堪麠U菌B.s.2012-21 在發(fā)酵36 h后，調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液的pH為2.0，4 ℃冰箱靜置36 h 時使用甲醇提取法抗菌物質(zhì)溶液的抑菌圈直徑最大，抗菌物質(zhì)的提取得率最高。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

誘變處理通常采用化學(xué)誘變劑處理、物理誘變處理及生物誘變處理。在枯草芽胞桿菌誘變處理中，紫外誘變是最常用的誘變育種方式，NTG 誘變劑也較常用。但兩種或多種誘變劑先后使用比單一誘變劑效果要好[9]。王瑞霞等[10]以枯草芽胞桿菌 B-903為出發(fā)菌株，利用 NTG 和微波聯(lián)合誘變處理，菌株的抑菌能力比出發(fā)菌株提高21.8%。盧燕回等[11]先用紫外線誘變，再用亞硝基胍誘變，得到抗菌活性提高了80%的枯草芽胞桿菌菌株B1。袁暉等[12]用鏈霉素和利福平結(jié)合紫外誘變篩選到高產(chǎn)他克莫司的菌株，產(chǎn)量提高82.6%。本試驗(yàn)先用紫外線誘變，再用亞硝基胍誘變，得到抗菌活性提高 84.62%和40.38%的突變菌株，菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量明顯增強(qiáng)，說明該方法是一種針對枯草芽胞桿菌誘變的有效方法，且經(jīng)過多次傳代后，穩(wěn)定性良好。

孔建等[13]在研究枯草芽胞桿菌 B-903 菌株所產(chǎn)的抗菌物質(zhì)的理化特性時，證明在強(qiáng)酸(pH 2～3)條件下，可使有效物質(zhì)從溶液中沉淀分離出來。王雅[14]經(jīng)鹽酸沉淀、甲醇萃取枯草芽胞桿菌菌株 Bv10 胞外抗菌物質(zhì)，得到抗菌活性較高的粗提物。別小妹等[15]發(fā)現(xiàn)乙醇、正丁醇和時間對枯草芽胞桿菌抗菌物質(zhì)的提取總量有顯著的正相關(guān)，pH 有顯著的負(fù)相關(guān)。本文也對抗菌物質(zhì)的提取做了初步研究，發(fā)現(xiàn)該菌株所產(chǎn)的抗菌物質(zhì)是一種胞外抗菌物質(zhì)。影響其提取的因素較多，但最主要的因素為pH、發(fā)酵時間、提取時間。

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Breeding ofB.s. 2012 and Antibiotic Substance Extraction that Efficiently Inhibit O157∶H7

SHI Hui1, XIAO Chang1, DU Xiao-feng1, XIANG Xing-jie1, ZHANG Jun-hong2

(1.SchoolofFoodandBiotechnology,Wuhan430205;2.Horticultre&ForestrySciences,Wuhan430070)

B.subtilis2012 was mutagenized to increase the production of antibiotic substances, and extracted its antimicrobial substances. TheB.s.2012 in mid-logarithmic growing period was mutagenized cooperatively treated with NTG and UV, and screened the strains with increased production on a bio-identifying plate with sensitive microbes. The good and bad of the extracted antibiotics were compared using the extraction with ethyl acetate method, 80% ethanol and methanol method. And optimized the methanol method with orthogonal experiment. The results showed that diameter of the inhibition zone of mutant strainsB.s.2012-21 andB.s. 2012-28 increased by 84.62% and 40.38% respectively as compared with the original strain. The extraction rate by methanol method was the highest. The results of orthogonal experiment showed that, when pH at 2.0, the fermentation time was 36 h and treated at 4 ℃, the recovery rate of antibiotics was the highest. This study obtained a mutant strainB.s.2012-21 with antibiotic substance production increased by big margin and methanol method to extract the antibacterial substances was the best method at the highest extraction rate.

Bacillussubtilis2012；antibacterial substances；UV mutation；NTG mutation;extraction

武漢設(shè)計工程學(xué)院(原華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院)重點(diǎn)科研基金項(xiàng)目(K201403)

石慧 女，碩士，副教授。研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。E-mail:ann.black@163.com

* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)槭卟瞬珊笮l(wèi)生及保鮮等方向的研究。 E-mail:zhangjunhng@mail.hzau.edu.cn

2015-05-19；

2015-06-13

Q939.92

A

1005-7021(2016)02-0039-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.007