鄧霞 白石

1.核工業(yè)四一六醫(yī)院口腔科，成都 610051；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科，重慶 400015

電紡聚己內(nèi)酯引導(dǎo)骨再生膜的仿生礦化研究

鄧霞1白石2

1.核工業(yè)四一六醫(yī)院口腔科，成都 610051；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科，重慶 400015

目的 探討組織工程化電紡聚己內(nèi)酯支架材料的生物礦化特性及其用作引導(dǎo)骨組織再生膜的可能性。方法 利用靜電紡絲法制備聚己內(nèi)酯（PCL）超細(xì)纖維膜支架，采用體外過飽和礦化液（SCS）浸泡法，在電紡膜上仿生沉積磷灰石。該復(fù)合材料采用掃描電子顯微鏡（SEM）、X射線衍射儀（XRD）、傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征；采用接觸角實(shí)驗(yàn)評價(jià)其親水性；將成骨細(xì)胞與復(fù)合材料共培養(yǎng)，用SEM觀察并評價(jià)其細(xì)胞相容性。結(jié)果 PCL電紡薄膜由超細(xì)纖維交織形成三維多孔結(jié)構(gòu)，隨著礦化時(shí)間增加，PCL電紡纖維上沉積的結(jié)晶物數(shù)量增多，形態(tài)增大并覆蓋整個(gè)薄膜表面，形成磷酸氫鈣及類骨磷灰石晶體。成骨細(xì)胞在復(fù)合材料表面黏附、鋪展，呈正常生長形貌。結(jié)論 PCL電紡膜經(jīng)過SCS處理是一種簡便有效的制備復(fù)合材料的仿生礦化方法，該材料具有良好的細(xì)胞相容性，在仿細(xì)胞外基質(zhì)組織工程化材料及引導(dǎo)骨組織再生膜研制方面具有一定的應(yīng)用前景。

引導(dǎo)骨組織再生； 靜電紡絲； 聚己內(nèi)酯； 仿生礦化； 磷酸鈣

Correspondence: Bai Shi, E-mail: 2296059@qq.com.

靜電紡絲技術(shù)是一種簡便易行的制備超細(xì)纖維的有效方法。紡織物具有較高的比表面積和高孔隙率，其微觀結(jié)構(gòu)與天然細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）相近，可以為細(xì)胞的生存提供良好的微環(huán)境，是較理想的組織工程支架[1]。目前已有膠原、殼聚糖、聚乳酸、聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）等數(shù)十種天然或合成的高分子材料[2]被應(yīng)用于靜電紡絲研究中。這些材料中，PCL是一種人工合成的聚酯類生物高分子材料[3]，安全無毒，生物降解性、力學(xué)性能、生物相容性均良好且具有形狀記憶效應(yīng)[4]，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有誘人的應(yīng)用前景。

引導(dǎo)骨組織再生（guided bone regeneration，GBR）是目前促進(jìn)牙槽骨組織再生的有效手段，而GBR生物屏障膜是決定其臨床效果的主要因素之一。近年來，學(xué)者們致力于研制能促使牙槽骨、牙骨質(zhì)及牙周膜全方位再生的復(fù)合結(jié)構(gòu)屏障膜，并賦予其生物活性、載藥抗菌等復(fù)合功能來滿足臨床需要[5]。

仿生礦化是將生物礦化的方法引入材料合成的過程，以有機(jī)基質(zhì)為模板，與無機(jī)礦物離子在界面處相互作用，對晶體的成核和生長進(jìn)行分子調(diào)控，制造性能優(yōu)良的有機(jī)-無機(jī)復(fù)合生物材料[6]。如何實(shí)現(xiàn)磷灰石微細(xì)晶體的快速沉積及均勻分布，一直是仿生礦化薄膜的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合靜電紡絲法和仿生礦化法，將PCL電紡膜作為有機(jī)模板，利用氫氧化鈣對其進(jìn)行預(yù)處理，采用過飽和鈣磷混和液（supersaturated calcification solution，SCS）仿生礦化法在PCL電紡超細(xì)纖維膜上快速礦化沉積磷灰石微晶體，制備GBR復(fù)合生物屏障膜，考察其仿生礦化特征，并進(jìn)行初步的材料體外細(xì)胞學(xué)研究，為進(jìn)一步研制在結(jié)構(gòu)和功能上更適合頜面骨組織缺損修復(fù)的電紡PCL/磷酸鈣（PCL/calcium phosphate，PCL/ CAP）復(fù)合生物屏障材料提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要原料及儀器設(shè)備

PCL（美國Sigma公司）；氫氧化鈣、碳酸鈉、無水氯化鈣、碳酸氫鈉、二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF），氯仿均為分析純（成都市科龍化工試劑廠）。

THZ-C型恒溫水浴搖床（江蘇常州市萬合儀器制造有限公司）；10-1-S型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海喆鈦機(jī)械制造有限公司）；AH250型電子天平（奧豪斯公司，美國）；高壓靜電紡絲機(jī)（四川大學(xué)紡織工程學(xué)院紡織研究所提供）；X’Pert Pro MPD 型X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD，Philips公司，荷蘭）；Nicolet 510P型傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR，Nicolet公司，美國）；JSM-5900LV型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM，JEOL公司，日本）；IX50/IX70型倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；OCA20視頻光學(xué)接觸角測量儀（北京東方德菲膠體化學(xué)儀器有限公司）。

1.2 PCL電紡膜的制備及表征

[7]配制PCL電紡溶液，將10 mL電紡溶液置于液體推注裝置中，裝置末端連接噴絲頭（內(nèi)徑0.5 mm）。推注裝置恒定以0.05 mL·min-1的加載速度將液體推出噴絲頭。噴絲頭同時(shí)與高壓電源的正極相連，在噴絲頭正下方放置玻璃蓋玻片做收集板，并作為接地負(fù)極。在設(shè)定條件下制備電紡產(chǎn)物。樣品噴金，SEM下觀察電紡超細(xì)纖維的形態(tài)，采用SigmaScan Pro 2.0圖像分析軟件測量纖維直徑。

1.3 PCL電紡膜的仿生礦化及檢測

按文獻(xiàn)[8]配制SCS仿生礦化液。將載有PCL電紡膜的蓋玻片經(jīng)新鮮配制的飽和氫氧化鈣溶液浸泡，預(yù)礦化1 h，去離子水漂洗后， 37 ℃恒溫浸泡于礦化溶液中。實(shí)驗(yàn)分組分別為12、24、48 h，礦化結(jié)束后，標(biāo)本用去離子水漂洗，去除未反應(yīng)的離子，自然干燥后送檢。在SEM下觀察形貌，用XRD及FTIR檢測材料的物相分布。以滴躺法檢測0.2 μL去離子水在純PCL電紡膜及PCL電紡膜礦化12、48 h組待測材料表面的接觸角，闡釋其潤濕性質(zhì)。

1.4 成骨細(xì)胞與材料的復(fù)合培養(yǎng)

成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)采用剛出生3～5 d的SD乳鼠顱蓋骨組織塊法。將分離的SD乳鼠顱蓋骨用PBS洗滌3次，用眼科剪剪成0.5～1.0 mm3的小塊，放入含DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，加入4 mL DMEM培養(yǎng)液（含體積分?jǐn)?shù)15%小牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素）。培養(yǎng)瓶置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，6 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。用倒置相差顯微鏡逐日觀察細(xì)胞從組織塊的游出及生長情況，平均每3 d更換1次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞增殖貼壁融合成單層后，0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)分瓶傳代及細(xì)胞增殖致所需細(xì)胞量后備用。將試樣放置于6孔板內(nèi)，環(huán)氧乙烷冷消毒，PBS浸泡清洗 3次，每次 1 h，DMEM培養(yǎng)液孵育過夜。將第4代成骨細(xì)胞消化，制成密度為1×105·mL-1的懸浮液，分別接種于已備好的材料上，37 ℃條件下5%CO2孵箱內(nèi)繼續(xù)靜置培養(yǎng)3 d。分別于第3 h、1 d、2 d將試樣取出，10%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換乙醇，臨界點(diǎn)干燥，表面噴金，SEM觀察。

2 結(jié)果

2.1 SEM形貌

在SEM下可見，電紡PCL膜由亞微米級超細(xì)纖維交織而成，具有高孔隙率及比表面積的特殊三維結(jié)構(gòu)（圖1A）。在SCS液中浸泡12 h，電紡PCL膜即有沿纖維分布的細(xì)小結(jié)晶物沉積（圖1B）；隨著礦化時(shí)間的延長，24 h組樣品上的晶體體積逐漸增大，數(shù)目增多，但仍然可見PCL基體膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖1C）；48 h組樣品上礦化結(jié)晶密集堆積，連接成片，覆蓋整個(gè)基質(zhì)表面，單個(gè)晶體呈葉片狀，以原來形成的鈣磷沉積為核心，增高增厚，相互交織成叢，形成花團(tuán)狀外形（圖1D）。

圖1 電紡PCL膜及在SCS中不同礦化時(shí)間后的形貌 SEM × 1 000Fig 1 Micrographs of electrospun PCL and the coated PCL scaffolds after immersing in SCS at different times SEM × 1 000

2.2 XRD及FTIR分析

XRD結(jié)果（圖2）顯示，21.53°、23.85°為PCL的特征衍射峰，25.9°、31°、33°為磷灰石特征衍射峰。PCL+SCS培養(yǎng)12 h組僅出現(xiàn)PCL的特征峰，磷灰石特征峰基本未顯示；PCL+SCS培養(yǎng)24 h組，除了出現(xiàn)PCL的特征峰外，在25.9°和31°位置出現(xiàn)了磷灰石特征峰；PCL+SCS培養(yǎng)48 h組除PCL的特征峰外，在25.9°、31°和33°位置出現(xiàn)了磷灰石特征峰。將PCL+SCS培養(yǎng)48 h組樣品與PCL基體膜作FTIR對比分析，在1 629 cm-1出現(xiàn)羰基特征振動吸收峰，在1 726 cm-1出現(xiàn)酯基特征振動吸收峰，在560、600、1 037 cm-1區(qū)出現(xiàn)PO43-的特征振動吸收峰，在1 417和1 464 cm-1處出現(xiàn)CO32–的特征振動吸收峰。

2.3 材料的親水性接觸角檢測

經(jīng)滴躺法測定，純PCL電紡膜接觸角為91°，液滴在材料表面呈球形；礦化12 h后接觸角為23.5°，液滴明顯鋪展，但尚未完全浸潤；礦化48 h后材料接觸角為0°，液滴在材料表面完全浸潤。

2.4 成骨細(xì)胞在復(fù)合材料上的生長

以48 h組樣品的細(xì)胞培養(yǎng)為例，細(xì)胞接種于材料表面3 h后，細(xì)胞呈球形，其后逐漸伸出偽足黏附于材料表面（圖3A）；1 d后，細(xì)胞變成紡錘形及梭形定植，偽足細(xì)長，仍可見細(xì)胞核部分隆起（圖3B）；2 d后，細(xì)胞更加鋪展，呈多角形，并相互交聯(lián)（圖3C）。成骨細(xì)胞在材料表面的黏附、鋪展和生長行為符合正常生長形貌，提示該材料有良好細(xì)胞相容性。

圖2 電紡PCL膜及在SCS中不同礦化時(shí)間后的XRD圖譜 Fig 2 XRD pattern of electrospun PCL and the coated PCL scaf- folds after immersing in SCS at different times

圖3 成骨細(xì)胞在PCL+SCS 48 h組復(fù)合材料上的生長情況 SEM × 1 000Fig 3 Osteoblasts cultured on PCL+SCS 48 h composite SEM × 1 000

3 討論

GBR技術(shù)是膜引導(dǎo)性組織再生技術(shù)（guided tissue regeneration，GTR）在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域中的應(yīng)用[9]。隨著該技術(shù)在牙槽外科、牙周科和口腔種植臨床的廣泛應(yīng)用，對GBR生物屏障膜的要求也不斷提高，根據(jù)屏障膜兩側(cè)組織再生的不同特點(diǎn)，學(xué)者們致力于研制更適合臨床需要的不對稱結(jié)構(gòu)復(fù)合屏障膜，并賦予其生物活性和載藥抗菌等多種功能[10]。

靜電紡絲技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用為制備理想的復(fù)合結(jié)構(gòu)GBR膜提供了契機(jī)[11]。電紡納米纖維膜的孔徑為4～6 μm，而真核細(xì)胞直徑范圍為10～100 μm，因此電紡纖維膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其具有細(xì)胞屏蔽功能，非常適合制備隔離屏蔽膜。同時(shí)，電紡超細(xì)纖維直徑與天然ECM（其中膠原纖維直徑為50～500 nm）相近，支架具有極大的比表面積、較高的孔隙率和較好的孔道連通，因而被用作仿生人體內(nèi)ECM結(jié)構(gòu)的組織工程支架材料[2]。進(jìn)一步優(yōu)化制備工藝，將電紡材料多層疊加，修飾改性，形成具有優(yōu)良性能的復(fù)合材料則是該領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。Bottino等[12]利用靜電紡絲技術(shù)設(shè)計(jì)并制備了一種功能梯度材料，該材料具有中間基層和兩側(cè)不同的功能表層，綜合了有機(jī)材料的良好機(jī)械性能、生物降解性和無機(jī)微粒的生物活性，兼顧了促進(jìn)根端牙周膜組織再生和牙槽骨缺損側(cè)骨再生的要求。因此，在電紡GBR膜阻擋軟組織，發(fā)揮良好屏障功能的同時(shí)，在膜的骨缺損側(cè)引入無機(jī)成分，增加材料的生物活性和骨誘導(dǎo)性，對骨組織的再生修復(fù)具有積極意義。

制備電紡有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料層有兩種途徑：一是將無機(jī)微粒如CaCO3和羥磷灰石直接加入電紡原液中，混紡形成復(fù)合材料[13-14]；二是將高分子電紡材料作為有機(jī)模板，在體外生物礦化[15-16]。前者的工藝過程中很難將無機(jī)微粒均質(zhì)地分散于有機(jī)基質(zhì)中，后者則更加體現(xiàn)了對天然骨組織中納米磷酸鈣在有機(jī)基質(zhì)模板調(diào)控下的形態(tài)發(fā)生和有序組裝的仿生設(shè)計(jì)。國內(nèi)外已開展了大量模板仿生的研究。本研究采用體外仿生礦化的方式在電紡PCL基膜上沉積磷灰石，著重考察其礦化特性，為后續(xù)研制電紡PCL多層復(fù)合GBR膜提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

仿生礦化常采用體外溶液浸泡法，以研究類骨磷灰石的形成。目前認(rèn)為，液相仿生礦化至少需兩個(gè)基本條件：其一是具有亞微米級的礦化成核生長點(diǎn)，即基質(zhì)材料表面具有帶有一定量負(fù)電荷的功能基團(tuán)，有利于順序吸附Ca2+和PO43-離子，為礦化物如磷灰石等的沉積提供成核位點(diǎn)，使礦化層與基質(zhì)材料通過化學(xué)鍵相互結(jié)合；其二是具有過飽和鈣磷離子濃度的微環(huán)境。一般的體外模型有模擬體液，交替礦化液及SCS[8,17-18]等。相比而言，SCS法礦化更簡單、快捷、高效，本實(shí)驗(yàn)即采用該方法對PCL電紡三維支架材料進(jìn)行生物礦化研究。由于PCL類可降解高分子生物材料表面疏水性強(qiáng)，細(xì)胞親和性欠佳，表面缺乏誘導(dǎo)礦化的功能基團(tuán)，如-PO4H2、-COOH、-OH、-CONH2、-NH2等，如何引入功能基團(tuán)是對高分子材料仿生礦化的關(guān)鍵。在Kawashita等[19]的相關(guān)研究中，將羧甲基殼聚糖纖維預(yù)先處理，使材料表面暴露游離的羧基。在本實(shí)驗(yàn)中，采用飽和Ca(OH)2溶液浸泡PCL電紡三維支架，進(jìn)行預(yù)礦化處理，酯基在水解過程中易開環(huán)形成游離的羧基，Ca(OH)2電離生成的部分Ca2+與游離的羧基絡(luò)合；SCS中含有部分(PO4)3-，(PO4)3-取代羧基形成磷灰石晶核，并逐漸長大成磷灰石微細(xì)晶粒。飽和Ca(OH)2溶液預(yù)礦化處理，有助于PCL膜發(fā)生表面水解，提供更多的晶核形成位點(diǎn)促進(jìn)了礦化結(jié)晶。本實(shí)驗(yàn)中，游離羧基與Ca2+形成的絡(luò)合物是啟動礦化成核的決定性因素。

XRD實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PCL+SCS培養(yǎng)12 h組僅出現(xiàn)PCL的特征峰，磷灰石特征峰基本未顯示，說明其結(jié)晶很差；PCL+SCS培養(yǎng)24 h組除PCL的特征峰外，在25.9°、31°位置出現(xiàn)了磷灰石特征峰，說明其結(jié)晶度優(yōu)于PCL+SCS培養(yǎng)12 h組；PCL+SCS培養(yǎng)48 h組在25.9°、31°、33°位置出現(xiàn)了磷灰石特征峰，說明其結(jié)晶度優(yōu)于PCL+SCS培養(yǎng)12 h及24 h組。隨著礦化時(shí)間延長，PCL峰值依次降低，而磷灰石特征峰依次增高，提示PCL膜表面覆蓋有更多的磷灰石晶體，磷灰石層的增厚增強(qiáng)了對PCL特征峰的吸收，強(qiáng)度下降。XRD分析結(jié)果與SEM觀察結(jié)果完全一致。FTIR結(jié)果提示：磷灰石中含有碳酸根，表明該磷灰石為與天然骨相似的類骨磷灰石。

PCL電紡膜的SEM觀察表明，隨著時(shí)間延長，礦化結(jié)晶逐漸長大，密集分布，最終覆蓋有機(jī)基體表面，其外形趨于穩(wěn)定，成片狀規(guī)則結(jié)晶。LeGeros[20]在無蛋白溶液中合成磷酸鈣的研究表明，呈規(guī)則片狀晶體的水磷酸氫鈣是成骨和礦化過程的中間相，它在生理環(huán)境中能最終轉(zhuǎn)化為片狀類骨磷灰石。雖然SEM為磷灰石晶體形成提供了最直接的證據(jù)，但是根據(jù)晶體形貌判斷晶體結(jié)構(gòu)是初步的，因此本實(shí)驗(yàn)采用XRD、FTIR等其他方法進(jìn)行進(jìn)一步分析，證實(shí)其沉淀物為類骨磷灰石結(jié)構(gòu)。

PCL電紡膜礦化前，其酯基為疏水基，呈現(xiàn)較強(qiáng)的疏水性，這對細(xì)胞的黏附與生長不利。經(jīng)過礦化處理后形成的PCL/CAP復(fù)合膜，培養(yǎng)12 h組的樣品，由于磷灰石晶體的吸附沉積，材料表面接觸角明顯變小，說明其可濕性提高；培養(yǎng)48 h組的礦化樣品，液滴滴躺于其上很快直接鋪展浸潤，提示由于晶體增多，所以材料完全改性為親水表面，與其他研究[21]結(jié)果相符。改性后的親水表面不但利于蛋白質(zhì)吸附，提高成骨細(xì)胞黏附性，還能改善材料的綜合降解性能。因此，采用礦化48 h組材料作體外細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞在PCL/CAP材料表面展現(xiàn)黏附、鋪展的生長形貌，初步提示材料具有細(xì)胞相容性，可作為多層電紡GBR膜的骨缺損側(cè)內(nèi)表層，為骨組織再生提供良好條件。

有研究[22]表明，在仿生礦化的材料表面，細(xì)胞相對增殖率明顯提高，表示其具有良好的生物相容性。在本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本課題組將進(jìn)一步在細(xì)胞增殖分化、生物學(xué)功能的有效表達(dá)及載藥抗菌等方面展開后續(xù)研究，設(shè)計(jì)研制更適合口腔頜面部骨組織缺損修復(fù)的電紡PCL/CAP多層復(fù)合GBR屏障材料。

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（本文編輯 吳愛華）

Biomineralization of electrospun polycaprolactone-guided bone regeneration membrane

Deng Xia1, Bai Shi2. (1. Dept. of Stomatology, Nuclear of Industry 416 Hospital, Chengdu 610051, China; 2. Dept. of Implantology, College of Stomatology, Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400015, China)

Objective To evaluate the biomineralization of the tissue-engineering electrospun polycaprolactone (PCL) scaffold and its potential use for guided bone regeneration (GBR) membranes. Methods PCL ultrafinefiber scaffolds were fabricated by electrospinning and then immersed in supersaturated calcification solution (SCS) for biomineralization investigation. The electrospun PCL scaffolds and the calcium phosphate coating were identified by scanning electron microscopy (SEM), X-ray diffraction (XRD), and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Water-contact angles were also measured to evaluate the hydrophilicity of the modified surface. The biocompatibility of the composite was investigated by culturing osteoblasts on the scaffolds. Cell behavior was observed by SEM. Results The electrospun PCL scaffold was composed of ultrafine fibers and well-interconnected pores. The deposits on the fibers grew in number and size as the biomineralization time increased. Then, the covering of the whole PCL film was identified as dicalcium phosphate dehydrate and apatite. Good cell attachment and proliferation behavior were observed on the membranes. Conclusion The quick apatite formation on the surface of the PCL electrospun scaffold indicated that SCS biomineralization may be an effective approach for obtaining PCL/calcium phosphate composites. The cellular biocompatibility of the composite scaffold was preliminarily confirmed by the in vitro culture of osteoblasts on the scaffold. As such, the composite scaffold is a promising biomimetic extracellular matrix biomaterial for bone tissue engineering and GBR membranes.

guided bone regeneration; electrospun; polycaprolactone; biomineralization; calcium phosphate

R 783.1

A

10.7518/hxkq.2016.06.004

2016-04-10；

2016-10-08

鄧霞，副主任醫(yī)師，博士， E-mail：xiad520@sina.com

白石，主治醫(yī)師，碩士，E-mail：2296059@qq.com