楊帥 李雪 高潔 蔡毅志 李榮慧 王明國

1.濰坊醫(yī)學院口腔醫(yī)學院，濰坊 261053；2.濰坊口腔醫(yī)院口腔科，濰坊 261000；3.中國人民解放軍第401醫(yī)院口腔科，青島 266071；4.山東大學口腔醫(yī)學院，濟南 250012；5.山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院口腔科，濟南 250013

·髁突軟骨專欄·

下頜持續(xù)前導對成年大鼠髁突軟骨骨形態(tài)發(fā)生蛋白表達及超微結構的影響

楊帥1李雪2高潔3蔡毅志4李榮慧4王明國5

1.濰坊醫(yī)學院口腔醫(yī)學院，濰坊 261053；2.濰坊口腔醫(yī)院口腔科，濰坊 261000；3.中國人民解放軍第401醫(yī)院口腔科，青島 266071；4.山東大學口腔醫(yī)學院，濟南 250012；5.山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院口腔科，濟南 250013

目的 觀察成年期大鼠在下頜持續(xù)前導作用下髁突軟骨的改建以及超微結構的變化。方法 將30只9周齡SD大鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組佩戴上頜斜面導板，對照組不做任何處理，分別在第3、7、14、21、30 天處死動物并取材，免疫組織化學染色檢測骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）在髁突中的表達及分布，透射電鏡觀察髁突軟骨細胞的超微結構，Micro CT分析髁突骨質的變化。結果 與對照組相比，實驗組髁突中部和后部軟骨增生明顯，軟骨細胞BMP-2陽性細胞率及灰度值在第7天開始增多，隨時間延長而增強，髁突軟骨細胞的超微結構出現(xiàn)細胞核固縮，核周微絲變少、脂滴變小、內(nèi)質網(wǎng)腔隙腫脹、細胞外基質增寬變多等。Micro-CT顯示實驗組的新生骨和骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量和分離度隨時間延長而增加。結論 在下頜持續(xù)前導下，成年期大鼠髁突軟骨出現(xiàn)增生性改建，并存在BMP-2的高表達。

髁； 軟骨； 超微結構； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白

1 材料和方法

1.1 實驗動物和材料

同源性9周齡成年SD大鼠30只，均為雄性，質量250～300 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2009-0017。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)自然光照，自然通風，溫度20～25 ℃。

格魯瑪齒科酸蝕劑（Heraeus Kulzer Dental）（賀利氏古莎齒科有限公司，德國），可樂麗菲露光固化復合樹脂（可樂麗公司，日本），BMPs單克隆抗體、SABC免疫組織化學試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），顯微鏡及顯微成像系統(tǒng)（BX51TPHD-J11型，奧林巴斯公司，日本），多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)（Image-Pro Plus型，Media Cybernetics公司，美國），透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）（JEM-100CX型，Delong公司，美國），Micro CT（SkyScan 1176 型，Bruker公司，比利時）。

1.2 實驗設計和方法

本實驗采用隨機對照動物實驗，于2014年3月—2015年8月在山東大學口腔醫(yī)院山東省口腔生物醫(yī)學重點實驗室完成。30只成年SD大鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組佩戴自制上頜斜面導板，對照組不做任何處理，在相同環(huán)境下飼養(yǎng)，在佩戴導板后的第3、7、14、21、30天分別處死6只動物，切取髁突，一側髁突切取切片進行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）和免疫組織化學染色，另一側進行Micro CT檢測和透射電鏡觀察。

1.2.1 上頜斜面導板動物模型的制備和取材 大鼠適應性喂養(yǎng)7 d，1 mL·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，牽拉大鼠下頜使口持續(xù)張開以保證良好的視角，清潔大鼠上前牙，酸蝕，樹脂粘接，在舌側面形成2 mm的導板，使下頜產(chǎn)生向前3.5 mm和向下3 mm的前伸位移，并且保證斜面導板與上頜咬合平面呈20°～25°。實驗過程中對SD大鼠的下頜前伸矯治器的配戴適應情況進行嚴密監(jiān)控，一旦發(fā)現(xiàn)有損壞和脫落，及時修理和安裝，使其不影響下頜持續(xù)性前伸的矯治效果。按相應時間點（3、7、14、21、30 d）處死大鼠，獲取標本。

1.2.2 免疫組織化學染色檢測BMP-2的表達 多聚甲醛固定后的髁突軟骨常規(guī)脫水石蠟包埋，髁突矢狀面低溫連續(xù)切片，BMP-2免疫組織化學染色（SABC法），在顯微鏡下應用多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)Image-Pro Plus對樣本的BMP-2染色結果進行圖像分析，每個樣本分別選取各組髁突軟骨前、中、后部3個區(qū)域進行分析，計算BMP-2陽性細胞率以及所有陽性細胞的灰度值之和。

1.2.3 TEM觀察髁突軟骨細胞的超微結構 將取下來的標本于體積分數(shù)2.5%的戊二醛在4 ℃的環(huán)境中固定2 h，然后用緩沖液多次清洗，再用體積分數(shù)1%的鋨酸與4 ℃的環(huán)境中固定 2 h，切取1 mm切片行HE染色，為TEM行超微定位，然后制成超薄切片，JEM-100CXTEM觀察髁突軟骨細胞的超微結構。1.2.4 Micro CT分析髁突骨質的變化 將標本固定于SkyScan 1176 Micro-CT的特制的樣本床內(nèi)，設置掃描條件為50 kV、500 μA，空間分辨率設定為18 μm，像素1 336×2 000，曝光時間為225 ms，角度增益為0.7°，掃描后采用NRecon（Version:1.6.3.3）軟件重建CT圖。CTAn（Version:1.10.11.0）分析軟件對樣品校準霍氏值（Holzknecht’s unit，HU）和密度，檢測其骨痂總體積（total callus volume，TV）、礦化骨總體積（mineralized callus volume，BV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp），并重建ROI三維圖。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 15.0軟件進行分析。實驗組和對照組組間比較用t檢驗，組內(nèi)比較用單因素方差分析。

2 結果

30只實驗大鼠均健康存活，無死亡和感染情況發(fā)生。

2.1 成年大鼠髁突軟骨的組織形態(tài)學變化及軟骨厚度變化

實驗組動物的髁突軟骨解剖取出后，可見其表面粗糙不光滑，與對照組軟骨組織表面有明顯的差別。與同一時間點對照組相比較，實驗組的髁突中部和后部軟骨增生明顯（P<0.05），前部軟骨厚度無明顯差異（P>0.05）。實驗組髁突總體積隨改建時間呈增大趨勢。髁突軟骨的中后部組織中的纖維層未發(fā)現(xiàn)明顯差異；實驗組增殖層的細胞層數(shù)顯著增加且細胞核體積增大，鈣化軟骨層細胞的體積變大，肥大層細胞層數(shù)增加且細胞外基質也增加（圖1）。各時間點髁突軟骨厚度的比較見表1。

圖1 大鼠髁突軟骨組織的改變 HE × 10Fig 1 Variations of condylar cartilage of rats HE × 10

表1 大鼠髁突軟骨厚度的變化Tab 1 Variations of condylar cartilage thickness of rats μm

2.2 BMP在大鼠髁突軟骨中的表達

BMP在大鼠髁突軟骨中表達的陽性細胞率和灰度值結果見表2、表3。在鏡下，BMP陽性染色結果表現(xiàn)為深染的棕色顆粒。對照組中，髁突軟骨組織內(nèi)BMP陽性細胞主要分布于過渡層和肥大層，以肥大層表達最強，增殖層、鈣化軟骨層中的軟骨細胞和成骨樣細胞也偶可見BMP表達，纖維層為陰性表達。對照組各時間段髁突軟骨內(nèi)BMP的陽性細胞率和陽性細胞灰度值無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。實驗組中，第3天BMP染色較弱，肥大層、過渡層有BMP陽性細胞散在分布，與對照組相比，其陽性細胞率和灰度值無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；第7天時BMP染色強度逐漸增強，灰度值高于對照組（P<0.05），而陽性細胞率無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；第14天開始，BMP陽性細胞率和灰度值均高于對照組（P< 0.05），第14天后隨時間的延長，陽性細胞率和灰度值呈現(xiàn)增加的趨勢，大量深染的陽性細胞不僅存在于過渡層和肥大層內(nèi)，也出現(xiàn)在增殖層和鈣化軟骨層中，纖維層中偶可發(fā)現(xiàn)陽性細胞。21 d時陽性細胞率與灰度值比14 d時進一步增加（P<0.05），與對照組比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05），陽性細胞廣泛分布在過渡層與肥大層，對照組陽性細胞在肥大層散在分布。30 d時陽性細胞率和灰度值達到最高峰，高于對照組（P<0.05）。

表2 成年大鼠髁突軟骨細胞內(nèi)BMPs陽性細胞率Tab 2 The rate of BMPs positive cells in condylar cartilage %

表3 成年大鼠髁突軟骨內(nèi)BMPs灰度值Tab 3 Gray value of BMPs in condylar cartilage

2.3 髁突軟骨細胞超微結構的變化

圖2 髁突軟骨細胞超微結構的變化 TEM × 15 000 Fig 2 Ultrastructural changes of condylar cartilage cells TEM × 15 000

髁突軟骨細胞超微結構的變化見圖2。對照組大鼠的髁突軟骨肥大層細胞呈現(xiàn)典型透明軟骨細胞的特征，細胞形態(tài)為卵圓形，細胞膜表面有微絨毛突起，糖原顆粒含量較少，細胞質含有較多的粗面內(nèi)質網(wǎng)，細胞外基質含有大量的蛋白多糖顆粒及細小纖維，與細胞外基質纖維相連接。與對照組相比，3、7 d時細胞結構與對照組相比改變不明顯，14 d時實驗組大鼠的髁突軟骨細胞的超微結構發(fā)生了明顯改變，包括髁突軟骨細胞體積變大，細胞核固縮，21 d時內(nèi)質網(wǎng)腔隙腫脹，脂滴變小甚至消失，核周微絲顯著變少且不規(guī)則，30 d時細胞外基質增寬變多，并在細胞外間隙出現(xiàn)了大片空白區(qū)域。

2.4 下頜骨髁突骨質參數(shù)的變化

Micro-CT觀察成年大鼠髁突變化見圖3。

2.4.1 TV與3 d組相比較，對照組TV值隨時間延長無明顯變化（P＞0.05），實驗組TV值隨時間延長TV值增加（P<0.01）（表4）。

2.4.2 BV與3 d組相比較，對照組BV隨時間延長無明顯變化（P＞0.05），實驗組BV隨時間延長先降低然后升高（P<0.05）（表5）。

2.4.3 Tb.Th與3 d組相比較，對照組Tb.Th隨時間延長無明顯變化（P＞0.05），實驗組Tb.Th在14、30 d時變化明顯，其中30 d時顯著增加（P<0.01）（表6）。

2.4.4 Tb.N與3 d組相比較，對照組Tb.N隨時間延長無明顯變化（P＞0.05），實驗組隨時間延長先降低然后升高（P<0.05）（表7）。

2.4.5 Tb.Sp與3 d組相比較，對照組Tb.Sp隨時間延長無明顯變化（P＞0.05），實驗組Tb.Sp在7、14、21 d時升高（P<0.05）（表8）。

圖3 Micro-CT下成年大鼠髁突變化Fig 3 Condylar changes of Micro-CT in adult rats

表4 成年大鼠TV的變化Tab 4 Changes of TV in adult rats mm3

表5 成年大鼠BV的變化Tab 5 Changes of BV in adult rats mm3

表6 成年大鼠Tb.Th的變化Tab 6 Changes of Tb.Th in adult rats μm

表7 成年大鼠Tb.N的變化Tab 7 Changes of Tb.N in adult rats

表8 成年大鼠Tb.Sp的變化Tab 8 Changes of Tb.Sp in adult rats μm

3 討論

顳下頜關節(jié)是人體中最復雜的關節(jié)之一。人的一生中，下頜骨髁突的關節(jié)面是可以因為其功能變化而發(fā)生改建的[8]。顳下頜關節(jié)不同于其他關節(jié)，還體現(xiàn)在其具有較強的終身改建的能力，尤其是在青少年時期這種改建能力表現(xiàn)的更為突出[9]，因而青少年的下頜后縮患者可以通過功能性矯治器前導下頜得以治療，但對于錯過生長發(fā)育高峰的成年患者來說，顳下頜關節(jié)能否改建以及如何改建尚不明確，本實驗采用SD大鼠作為研究對象，大鼠屬嚙齒類動物，其顳下頜關節(jié)與人在組織結構上比較相似，在個體之間基因變異影響較少，同時較容易獲得樣本量，有利于統(tǒng)計學分析，是研究人顳下頜關節(jié)改建的理想動物模型。本實驗中使用的9周齡SD大鼠已經(jīng)處于大鼠成年期，大鼠髁突與關節(jié)窩以及翼外肌都處于穩(wěn)定的狀態(tài)，這與成年患者臨床Ⅱ類矯治的最佳時機相吻合。

顳下頜關節(jié)不同于其他關節(jié)，具有很強的改建能力，其原因可能是生物組織以改建的形式對所承受的負荷作出生物學反應，最終可導致解剖結構發(fā)生變化。在機械應力的作用下，髁突軟骨內(nèi)產(chǎn)生的機械化學信號調控著軟骨的合成和分解代謝，用適當?shù)墓δ艹C治器可引起繼發(fā)性軟骨的生長量和方向的改變[10]。髁突是下頜骨生長發(fā)育的中心之一，具有較強的生長改建能力。髁突軟骨是覆蓋于髁突關節(jié)面表面的一層結締組織，髁突軟骨包括軟骨細胞及細胞外基質，從表層到深層可分為5層：纖維層、增殖層、過渡層、肥大層、鈣化軟骨層[11]。軟骨的分層結構不僅反映了髁突軟骨細胞從幼稚到成熟的分化過程，更反映了髁突軟骨生長改建的發(fā)展過程，即關節(jié)軟骨內(nèi)各細胞層的變化是反映整個髁突適應性改建的重要指標[12]。本研究中切取大鼠的髁突進行研究并沿髁突縱切面進行分析，可以有效地觀測髁突軟骨各層的改建情況。

3.1 下頜前導后髁突軟骨的改建

下頜前伸可增加髁突軟骨后部新骨形成[13]。本研究的結果發(fā)現(xiàn)，下頜前導后，成年大鼠的髁突軟骨也發(fā)生改建，與對照組相比，髁突軟骨有明顯的增生。這與下頜前導在青年大鼠所獲得的研究結果相一致。這表明在下頜前導的負荷下，成年大鼠髁突也有明顯的改建過程。髁突軟骨屬于繼發(fā)性軟骨，繼發(fā)性軟骨生長以及軟骨形成很大程度上取決于外部環(huán)境的改變[14]。髁突軟骨具有特殊的生長及改建的多向分化能力，其可以通過調節(jié)軟骨形成和后來的軟骨內(nèi)骨化過程來適應外部環(huán)境的改變。

3.2 BMP-2與髁突軟骨適應性改建的關系

髁突軟骨的改建成骨是由多種細胞因子調控的，其中 BMP-2是一種多功能生長因子，對骨骼胚胎發(fā)育和出生后的成骨有重要作用[15]。其能引起多種細胞的增殖、分化和凋亡，參與組織的再生和修復，尤其是骨和軟骨的修復，與骨組織的形成和改建有著密切的關系。在本實驗中，成年期大鼠下頜前導后BMPs在髁突軟骨的表達增強，特別是在增殖層，提示BMP-2能夠促進未分化的細胞分化為前軟骨細胞。在下頜前導后可見大量的未分化細胞分化成前軟骨細胞，從而為軟骨成熟提供足夠的細胞來源[16]。BMP-2在過渡層和肥大層表達的增強說明下頜前導加快了成年期大鼠髁突軟骨細胞的成熟，促進了軟骨的增生。本實驗結果顯示，下頜前導后，實驗7 d時髁突軟骨細胞BMP的表達高于對照組，說明下頜前導后關節(jié)內(nèi)的生物力學環(huán)境發(fā)生改變，髁突軟骨細胞開始發(fā)生適應性改建；隨后BMP-2的表達逐漸增強，實驗組21、30 d時髁突軟骨細胞BMP-2的表達較對照組顯著增強，說明前導成年大鼠下頜后刺激了軟骨細胞，加快了軟骨細胞的分化成熟，促進了髁突軟骨細胞的適應性生長改建，最終髁突軟骨建立新的結構平衡來維持關節(jié)的功能。

3.3 超微結構下觀察髁突軟骨改建的變化

軟骨細胞的基因表達過程可以分成兩個明顯的階段，即成熟和礦化[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，下頜前導后成年期大鼠的髁突組織的超微結構也發(fā)生了顯著改變。在電鏡下，14 d時實驗組成年期大鼠髁突軟骨覆蓋的成纖維組織細胞內(nèi)質網(wǎng)腫大破裂，胞漿外流，發(fā)生玻璃樣變，14～21 d時細胞體積隨著時間的延長而逐漸增大，胞質豐富，細胞核增大，說明軟骨細胞發(fā)育成熟并繼續(xù)分化成為肥大層軟骨細胞，而后發(fā)生核固縮，細胞電子密度增高，30 d時有大量的粗面內(nèi)質網(wǎng)腔隙腫脹，細胞外基質增多變寬。軟骨肥大層不連續(xù)，局部組織纖維化；增殖層未成熟細胞比例增加。說明從細胞微觀層面證實肥大軟骨細胞死亡降解形成新骨，鈣化軟骨層厚度增加。從超微結構觀察證實了經(jīng)過一定時間下頜前導后，髁突和下頜骨會出現(xiàn)明顯的生長改建[18]。

3.4 Micro-CT觀察髁突軟骨的改建

Micro-CT能夠以很高的分辨率測定骨骼各種結構，近年來已經(jīng)取代了原始的計量學方法。Micro-CT可以從3D的整體結構出發(fā)對下頜骨髁突的結構和力學特性的變化情況進行研究。在本實驗中成年期大鼠實驗組TV隨時間延長顯著升高，30 d時最高。同樣，BV、Tb.N、Tb.Th在30 d時也顯著增加（P＜0.05）。說明在外力作用下，成年期大鼠髁突也會有新骨形成發(fā)生，發(fā)生最顯著變化的時間會延長至觀察期的30 d，說明在外力作用下，成年期大鼠髁突也會有新骨形成發(fā)生適應性改建[19]。

本次實驗通過組織學與影像學相結合的研究方法，從不同角度證實了成年大鼠在下頜持續(xù)前導作用下，髁突發(fā)生了改建：Micro-CT測得髁突后部在下頜前導后新骨生成；免疫組織化學實驗中BMP-2作為軟骨成骨與軟骨修復重要細胞因子出現(xiàn)了高表達，提示在髁突改建過程中存在改建中的新骨生成與改建后的軟骨修復現(xiàn)象，BMP-2促進軟骨修復使髁突軟骨建立新的平衡來維持改建后關節(jié)的功能；通過透射電鏡觀察軟骨細胞細胞器等超微結構，證實了軟骨細胞在改建中存在增生分化現(xiàn)象，且出現(xiàn)時間與BMP-2出現(xiàn)高表達時間一致，提示BMP-2可能通過細胞內(nèi)信號通路參與了軟骨細胞增生分化。已有研究[20]證實，不同作用方式和作用時間下可以差異性調節(jié)髁突軟骨細胞的改建。在下頜前導外力作用下，成年期大鼠的髁突軟骨也會發(fā)生明顯的形態(tài)組織學改建，使顳頜關節(jié)的位置發(fā)生改變，促進口頜系統(tǒng)傾向于穩(wěn)定狀態(tài)。這為成人正畸治療錯畸形提供了實驗依據(jù)。由于本研究中觀察對象的研究時間較短，只能提示前導下頜的負荷可促進髁突軟骨的改建，但最終改建的效果以及達到口頜系統(tǒng)穩(wěn)定的時間本研究尚不能提供結論。

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（本文編輯 李彩）

Changes in ultrastructure and bone morphogenetic protein expression in reconstructed mandibular condylar cartilage under continuous mandibular advancement in adult rats

Yang Shuai1, Li Xue2, Gao Jie3, Cai Yizhi4, Li Ronghui4, Wang Mingguo5. (1. School of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261053, China; 2. Dept. of Stomatology, Weifang Oral Hospital, Weifang 261000, China; 3. Dept. of Stomatology, The 401st Hospital of PLA, Qingdao 266071, China; 4. School of Stomatology, Shandong University, Jinan 250012, China; 5. Dept. of Stomatology, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China)

Supported by: The Science and Technology Development Program of Shandong Province (2014GSF11804). Correspondence: Wang Mingguo, E-mail: wmgsh@163.com.

Objective This study investigated the reconstructed mandibular condylar cartilage and the ultrastructural variations in mandibular condylar cartilage in adult rats as a result of mandibular advancement. Methods Thirty 9-week-old male Sprague-Dawley rats were randomly divided into experimental and control groups. Rats in the experimental group were subjected to mandibular advancement. Rats were sacrificed on days 3, 7, 14, 21, 30. Sections were cut from condyles, and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) expression in condylar cartilage was examined through immunohistochemical analysis. Condylar cartilage samples were harvested, and ultrastructural changes in these samples were observed under Micro-CT and transmission electron microscope. Results Compared with the control group, the experimental group obviously displayed cartilage hyperplasia in the middle and rear of the condyle. Moreover, the number of BMP-2-positive cells in condylar cartilage and the gray value gradually increased in the experimental group on day 7 of the intervention. Ultrastructural changes, such as karyopyknosis, reduced microfilaments around the nucleus, reduction in size or even disappearance of lipid droplets, swelling of endoplasmic reticulum compartments, broadened and increased extracellular matrix, were observed in the condylar hypertrophic chondrocytes. Micro-CT revealed that the trabecula and the newly formed bone gradually thickened.Conclusion Hypertrophic remodeling of the condylar cartilage and high BMP-2 expression are observed in adult rats as a result of continuous mandibular advancement.

condyle; cartilage; ultrastructure; bone morphogenetic protein

R 783.5

A

10.7518/hxkq.2016.06.016

2016-01-15；

2016-07-10

山東省科技發(fā)展項目（2014GSF11804）

楊帥，碩士，E-mail：907445117@qq.com

王明國，副主任醫(yī)師，博士，E-mail：wmgsh@163.com