王建華 ， 趙 丹 ， 張俊哲 ， 董志珍 ， 趙祥平 ， 王玉玲 ， 肖 妍 ， 王乃福 ， 陳小金 ， 陳本龍

(天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心 ， 天津保稅300456)

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一種基于CP204L基因的非洲豬瘟病毒TaqMan-MGB實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的建立

王建華 ， 趙 丹 ， 張俊哲 ， 董志珍 ， 趙祥平 ， 王玉玲 ， 肖 妍 ， 王乃福 ， 陳小金 ， 陳本龍

(天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心 ， 天津保稅300456)

基于非洲豬瘟病毒(ASFV)CP204L基因序列設(shè)計(jì)1對特異性引物和TaqMan-MGB探針，通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了一種檢測ASFV的TaqMan-MGB實(shí)時(shí)熒光PCR方法。結(jié)果顯示，該方法僅對ASFVDNA呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增，不與豬的其他常見病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。該方法對標(biāo)準(zhǔn)對照質(zhì)粒(PCR2.1-CP204L)的線性檢測范圍為4.2×101～4.2×109copies/μL，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.452 3X+39.014，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.998 8，檢測下線為4.2個(gè)拷貝。對5個(gè)不同濃度(4.2×103～4.2×107copies/μL)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行4次雙份樣品的重復(fù)檢測，Ct值變異系數(shù)均小于1.5%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。用該方法對總計(jì)164份的進(jìn)口豬臨床樣品和生豬肌肉樣品進(jìn)行ASFV檢測，結(jié)果均為陰性。該方法的建立為活豬臨床樣品和生豬肌肉樣品中ASFV檢測提供了一種快速、敏感和特異的技術(shù)手段。

非洲豬瘟病毒 ； CP204L序列 ；TaqMan-MGB探針 ； 實(shí)時(shí)熒光PCR

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起豬的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，臨床癥狀以高熱、病程短、高死亡率、內(nèi)臟器官廣泛性出血以及呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)功能改變?yōu)橹饕卣?。?009 年以來，本病經(jīng)格魯吉亞等國傳播到與我國接壤的俄羅斯部分地區(qū)并多次暴發(fā)[1]，目前已對我國養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)發(fā)展構(gòu)成巨大威脅。對疑似發(fā)病豬群中ASFV 快速而準(zhǔn)確的檢測，以及對可能攜帶ASFV 的野豬、軟蜱和來自疫區(qū)的生豬產(chǎn)品及其制品中ASFV 的監(jiān)測，是我國防控ASFV傳入的重要措施。為此，本試驗(yàn)基于ASF VCP204L基因的保守序列設(shè)計(jì)合成特異性引物與探針，建立了一種檢測ASFV的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸樣品和陽性對照質(zhì)粒 非洲豬瘟病毒DNA，由意大利撒丁島動(dòng)物疫病參考實(shí)驗(yàn)室饋贈，偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的DNA，豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的cDNA，以及用作陽性對照的標(biāo)準(zhǔn)對照質(zhì)粒(PCR2.1-CP204L)，均由天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心反芻動(dòng)物檢疫國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和儀器 組織基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；TaKaRaTaq聚合酶、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)，購自寶生物工程(大連)有限公司；Light Cycler?480熒光PCR儀(Rochi公司)。

1.3 引物與探針的設(shè)計(jì)與合成 選取GenBank數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載的ASFV CP204L基因序列保守區(qū)域，用BeaconDesigner7.0軟件設(shè)計(jì)1對特異引物和TaqMan-MGB探針，CP204L-F：5′-GCAGGGCAAGGGTATACTGA-3′，CP204L，-P：5′-CTGTCTCCTCTTCAAACAGCAC-3′，CP204L-P：FAM-5′-CCATTCTTCTTGAGCCTG-3′-MGB，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，5′端用FAM標(biāo)記，3′端用MGB標(biāo)記，引物和探針序列見表1，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為79 bp。

1.4 熒光PCR反應(yīng)的優(yōu)化 以PCR2.1-ASFV-CP204L(4.2×108copies/μL)為擴(kuò)增模板，采用Premix ExTaqTM(Probe qPCR)試劑及推薦的反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件，對不同濃度組合的引物(2～10 pmol/μL)和標(biāo)記探針(1.5～3.5 pmol/μL)以及對56 ℃～61 ℃范圍內(nèi)的退火延伸溫度，在熒光PCR儀上進(jìn)行方陣篩選試驗(yàn)，以確定引物和探針的最適使用濃度和最適擴(kuò)增條件。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立、敏感性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn) 將已知濃度的PCR2.1-ASFV-CP204L做10倍系列稀釋，按優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)，以Ct值為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)對照質(zhì)粒起始拷貝數(shù)濃度的對數(shù)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定該方法檢測標(biāo)準(zhǔn)對照質(zhì)粒最低拷貝數(shù)；選取5個(gè)濃度(4.2×103～4.2×107copies/μL)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，進(jìn)行2個(gè)平行樣品的4次重復(fù)試驗(yàn)，以確定該方法的可重復(fù)性；對ASFV、PRV、PPV和PCV-2的DNA以及CSFV、PRRSV、PEDV和SIV的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以確定該方法的特異性。

1.6 實(shí)際樣本的檢測 對2012-2014年保存的164頭份進(jìn)口豬的血清樣品和32份進(jìn)口豬肉樣品，用組織基因組DNA提取試劑盒按操作說明書提取DNA，采用本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行ASFV核酸檢測，以評價(jià)該方法的適用性。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR反應(yīng)的優(yōu)化結(jié)果 通過試驗(yàn)篩選確定的最適熒光定量PCR擴(kuò)增條件為：在25μL反應(yīng)體系中，2×Premix ExTaqTM(Probe qPCR)12.5 μL，CP204L-F(7.5 pmmol/μL)、CP204L-R(7.5 pmmol/μL)和CP204L-P(2.5 pmmol/μL)各μL，樣品DNA適量，補(bǔ)足純水至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為95 ℃ 2 min，然后95 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)，在每一次循環(huán)的60℃延伸擴(kuò)增結(jié)束前采集FAM通道熒光信號。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品曲線建立和敏感性試驗(yàn)結(jié)果 對10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)對照質(zhì)粒進(jìn)行的熒光PCR擴(kuò)增曲線及建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別見圖1A和圖1B，由圖1A可知該方法最低可檢出4.2拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)對照質(zhì)粒DNA分子。該方法檢測標(biāo)準(zhǔn)對照質(zhì)粒的線性檢測范圍為4.2×101～4.2×109 copies/μL，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.452 3X+39.014，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.998 8。

圖1 對照質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(4.2×100～4.2×109 copies /μL)熒光PCR動(dòng)力學(xué)曲線(A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線曲線(B)

a，b，c，d，e，f，g，h，i分別為4.2×109copies、4.2×108copies、4.2×107copies、4.2×106copies、4.2×105copies、4.2×104copies、4.2×103copies、4.2×102copies、4.2×101copies、4.2×100copies對照質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線

2.3 特異性、重復(fù)性和實(shí)際樣本檢測結(jié)果 用該方法檢測ASFV及相關(guān)病毒基因組核酸，僅ASFV的DNA出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，而PRV、PPV和PCV-2的DNA以及CSFV、PRRSV、PEDV和SIV的cDNA>均無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，表明該方法檢測ASFV核酸有良好的特異性。對5個(gè)不同濃度(4.2×103～4.2×107copies/μL)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行4次雙份樣品的重復(fù)檢測，結(jié)果見表1，由表1可知Ct值變異系數(shù)均小于1.5%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。對2012-2014年保存的162頭份進(jìn)口豬血清樣品和32份進(jìn)口豬肉樣品進(jìn)行ASFV核酸檢測，結(jié)果均為陰性。

表1 非洲豬瘟病毒P30基因熒光PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

熒光PCR方法不僅適用于急性感染早期家豬組織樣本中ASFV檢測，而且更適用于持續(xù)性感染的野豬和軟蜱的組織樣本中ASFV檢測。已知ASFV基因組由單分子線狀雙股DNA組成，長度為170～190 kb，含有大量的毒力相關(guān)基因和宿主范圍相關(guān)基因[2]。國外King等(2003)最早基于VP72基因建立了檢測ASFV核酸的熒光PCR方法[3]國內(nèi)董志珍(2009)等和郭少平(2010)等分別基于，p54基因和K205R基因建立了檢測ASFV核酸的TaqMan探針熒光PCR方法[4-5]均顯示出很高的敏感性。由于CP204L是ASFV在，感染細(xì)胞早期高豐度表達(dá)的一種編碼P30蛋白的基因，該蛋白是目前已知的激發(fā)感染動(dòng)物產(chǎn)生抗體和用于ASFV特異抗體檢測的主要蛋白抗原之一[6]。為此，本試驗(yàn)基于CP204L基因建立了一種TaqMan-MGB探針熒光PCR方法，試驗(yàn)表明，該方法檢測ASFV核酸不僅特異性強(qiáng)，而且最低可檢測4.2個(gè)拷貝的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照質(zhì)粒，為我國預(yù)防ASFV的傳入和傳播提供了一種快速而準(zhǔn)確的監(jiān)測手段。

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Development of aTaqMan-MGB probe real-time PCR assay for detection of african swine fever virus based on CP204L gene

WANG Jian-hua ， ZHAO Dan ， ZHANG Jun-zhe ， DONG Zhi-zhen ， ZHAO Xiang-ping ，ANG Yu-ling ， XIAO Yan ， WANG Nai-fu ， CHEN Xiao-jin ， CHEN Ben-long

(The Animals and Plants and Food Inspection Center of Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine，Tianjin 300456，China)

By optimization of reacting conditions，aTaqMan-MGB probe real-time PCR was developed with a pair of specific primers and probe designed according to the conserved regions of the CP204L gene sequences of African swine fever virus(ASFV).The method had high specificity for the ASFV DNA and no cross-reactivity was observed among DNAs and cDNAs of other common swine viruses.The assay showed good linearity between Ct values and copies of the standarde plasmid from 4.2×101to 4.2×109copies/reaction(standard equation Y=-3.4523X+39.014，correlation coefficient R2=0.9988)，and the detection limit of the assay was as low as 42 copies of the standarde plasmid.Coefficiency of variation(CV)of Ct values of the standard plasmid tested in duplicate four times ranging from 4.2×103to 4.2×107copies/μL by the assay were less than 1.5%.The164 samples from the imported pigs and porks were detected to be negative by the assay.In conclusion，the method provides a useful tool for the detection of ASFV in the samples from the pigs and porks.

African swine fever virus；CP204L gene ；TaqMan-MGB probe ； real-time quantitative PCR

2015-07-31

天津市科技支撐項(xiàng)目(13ZCZDNCO1300)；天津市濱海新區(qū)惠民項(xiàng)目(2013-BK15H013)

王建華(1965-)，男，高級獸醫(yī)師，博士，從事動(dòng)物疫病檢測與診斷試劑研制工作，E-mail：wjhwqy1965@163.com

S852.65+1

A

0529-6005(2016)10-0023-03