仇微紅 ， 彭 特 ， 胡秀美 ， 許利娜 ， 葉賀佳

(華南農(nóng)大生物藥品有限公司 ， 廣東廣州511300)

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新城疫病毒F基因的序列分析及攻毒保護(hù)對比試驗(yàn)

仇微紅 ， 彭 特 ， 胡秀美 ， 許利娜 ， 葉賀佳

(華南農(nóng)大生物藥品有限公司 ， 廣東廣州511300)

對近年來實(shí)驗(yàn)室分離的4株新城疫病毒，運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增出該病毒的F基因的ORF序列，并進(jìn)行序列測定及攻毒保護(hù)試驗(yàn)。經(jīng)序列對比、進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，NK01株、GD03株、HY04株屬于基因Ⅶd亞型，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)序列為112R-R-Q-K-Q-F117，具有強(qiáng)毒株分子特征。對4株分離毒株與標(biāo)準(zhǔn)毒株LaSota株進(jìn)行血清交叉反應(yīng)及攻毒保護(hù)對比試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NK01株、GD03株、HY04株對HY04株具有良好的保護(hù)效果，保護(hù)率分別為100%、90%、80%；CM02株、LaSota株對HY04株保護(hù)效果不理想，保護(hù)率僅為60%。

新城疫病毒 ； 基因Ⅶ型 ； 免疫效力

新城疫(NDV)是由新城疫病毒引起的一種禽急性、烈性傳染性疫病，主要侵害雞和火雞，發(fā)病率和死亡率均很高，是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的嚴(yán)重疾病。NDV為副黏病毒科、副黏病毒亞科、禽腮腺炎病毒屬成員。其基因組為單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA，長約15.2 kb，至少編碼6種蛋白，分別為NP、P、M、F、HN、和L蛋白。F蛋白(Fution protein，融合蛋白)和HN蛋白(Haemagglutinin-neuraminidase，血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白)是病毒的主要免疫原性蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。F蛋白介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的膜融合，其裂解位點(diǎn)序列與病毒毒力有關(guān)。

目前我國主要流行基因Ⅶ型NDV，尤以Ⅶd亞型為主。本研究主要對實(shí)驗(yàn)室分離的幾株新城疫病毒的F基因、血清交叉及攻毒保護(hù)試驗(yàn)進(jìn)行分析，為新的ND疫苗研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 NK01株、CM02株、GD03株、HY04株為新城疫分離毒，分別按現(xiàn)有生產(chǎn)工藝制備滅活疫苗，LaSota株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，5種疫苗均由廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司制備及提供。

1.1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中發(fā)表的NDVF基因核苷酸序列，通過比對后應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)了2對特異性引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度分別為534 bp和1 662 bp，包括F基因完整的開放閱讀框。引物序列均由廣州Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離 在山東、廣東、廣西等養(yǎng)殖場雞群，采集發(fā)病雞內(nèi)臟組織處理后，接種10日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚0.1 mL，37 ℃孵化，收集 24～120 h死胚及活胚的尿囊液，測定血凝價(jià)。對陽性的尿囊液進(jìn)行病毒鑒定，陰性尿囊液則進(jìn)行盲傳3代。

1.2.2 病毒的鑒定

1.2.2.1 血清學(xué)鑒定 將有血凝活性的雞胚尿囊液分別與新城疫病毒、減蛋綜合征病毒、H5亞型禽流感病毒的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行血凝抑制(HI)試驗(yàn)。

1.2.2.2 病毒的RT-PCR鑒定與F基因序列分析

取收獲后的8份雞胚尿囊液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對經(jīng)鑒定為NDV陽性的4個(gè)病毒的F基因ORF進(jìn)行擴(kuò)增、TA克隆。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送Invitrogen公司測序。利用DNAStar和MEGA6.0等軟件在F基因核苷酸水平上繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析。

1.2.3 血清交叉試驗(yàn) 將50只21日齡SPF雞隨機(jī)分成A、B、C、D、E共5組，10只/組，各組分別經(jīng)頸部皮下注射雞新城疫滅活疫苗(NK01株)、雞新城疫滅活疫苗(CM02株)、雞新城疫滅活疫苗(GD03株)、雞新城疫滅活疫苗(HY04株)、雞新城疫滅活疫苗(LaSota株)0.25mL/只。另設(shè)5只同日齡SPF雞不免疫作空白，對照。免疫后21日各組分別采血分離血清，使用相對應(yīng)血凝抑制抗原測定血清的HI抗體效價(jià)。

1.2.4 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 免疫后21日，將試驗(yàn)雞逐一編號連同對照雞5只，分別使用新城疫基因Ⅶ病毒HY04株進(jìn)行攻毒，腿部肌肉注射0.5 mL/只(含100LD50)，攻毒后每日觀察試驗(yàn)雞的發(fā)病或死亡情況，并及時(shí)記錄，持續(xù)14 d，并于攻毒后5 d采集試驗(yàn)雞的泄殖腔及喉拭子進(jìn)行病毒分離。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離與鑒定結(jié)果 8份病料接種SPF雞胚后，分到4株病毒，分別命名為NK01株、CM02株、GD03株、HY04株。按照微量法進(jìn)行HA和HI試驗(yàn)，結(jié)果顯示，所收獲的尿囊液具有血凝活性，且能夠被NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清完全抑制，而不能被H5、H7、H9、EDS等陽性血清抑制。

用NDV特異性引物對8份病料接種的SPF雞胚尿囊液進(jìn)行RT-PCR檢測，其中4份擴(kuò)增得到與目的大小相符的片段(534bp)，表明分離得到4株NDV(圖1)。

圖1 F基因特異性引物RT-PCR檢測電泳圖

M：DL-2 000 DNA Marker；1：NDV陽性對照；2：NDV陰性對照；3～10：分別為病料傳代后收獲尿囊液，其中3～6分別為分離毒NK01株、CM02株、GD03株、HY04株，7～10為分離毒陰性

2.2 F基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 由圖2新城疫F基因繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，CM02株屬于基因Ⅱ型，NK01株、GD03株、HY04株均屬于基因Ⅶd型。

2.3 血清交叉試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果表明，A組使用NK01抗原檢測抗體相對較高，達(dá)到9.0 log2，與其他4種抗原檢測相差1～2 log2，差異較顯著；B、C、E組血清抗體效價(jià)均為7log2左右，各種抗原間差異不顯著；D組抗體水平則在6 log2左右，各種抗原間差異不顯著。結(jié)果見表1。

2.4 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 由表3結(jié)果可知，A組試驗(yàn)雞使用HY04株進(jìn)行攻毒，攻毒后免疫雞均全部存活，采集試驗(yàn)雞的泄殖腔拭子進(jìn)行病毒分離，均為陰性，NKO1株疫苗對該毒株的攻毒保護(hù)率為

圖2 NDV F基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

注：NK01株、CM02株、GD03株、HY04株為分離毒，LaSota株為基因Ⅱ型標(biāo)準(zhǔn)毒

表1 疫苗免疫后21 d血清交叉情況 (單位：log2)

*：差異顯著

100%(10/10)；B組試驗(yàn)雞使用HY04株進(jìn)行攻毒，試驗(yàn)雞40%(4/10)病毒分離陽性，CM02株疫苗對該毒株的攻毒保護(hù)率為60%(6/10)；C組試驗(yàn)雞使用HY04株進(jìn)行攻毒，試驗(yàn)雞10%(1/10)病毒分離陽性，GD03株疫苗對該毒株的攻毒保護(hù)率為90%(9/10)；D組試驗(yàn)雞使用HY04株進(jìn)行攻毒，試驗(yàn)雞20%(2/10)病毒分離陽性，HY04株疫苗對該毒株的攻毒保護(hù)率為80%(8/10)；E組試驗(yàn)雞使用HY04株進(jìn)行攻毒，試驗(yàn)雞40%(4/10)病毒分離陽性，LaSota株疫苗對該毒株的攻毒保護(hù)率為60%(6/10)；對照雞使用HY04株進(jìn)行攻毒，均于4d內(nèi)100%(5/5)全部死亡。

3 討論

3.1 新城疫病毒強(qiáng)弱毒株的判定標(biāo)準(zhǔn)一般依據(jù)ICPI和F蛋白裂解位點(diǎn)序列進(jìn)行判定[3]。NDV中強(qiáng)毒株和強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)附近氨基酸序列多為112R/K-R-Q/K-K/R-R-F117，而弱毒株則多為112G/EK/R-Q-G/E-R-L117[4]。本次分離的NK01株、GD03株、HY04株基因Ⅶd亞型毒株F蛋白裂解位點(diǎn)序列為112R-R-Q-K-Q-F117，符合強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)的特征。CM02株基因Ⅱ型毒株F蛋白裂解位點(diǎn)序列為112G-R-Q-G-R-L117，符合弱毒株裂解位點(diǎn)的特征。

表2 攻毒保護(hù)情況

3.2 據(jù)報(bào)道，1948-2009年間，在488株NDV毒株中，依據(jù)其F基因分型的方法，其中：基因Ⅰ型為13株，Ⅱ型為72株，Ⅸ型為27株(有人稱Ⅲ型)，Ⅵ型為41株，Ⅶ型為335株，占我國流行毒株的大多數(shù)，占68.6%。值得關(guān)注的是：基因Ⅶ型又根據(jù)其進(jìn)化差異分為不同的亞型：為a～e亞型，我國廣泛流行基因Ⅶd[5]，結(jié)合本次試驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)了這一點(diǎn)。

3.3 血清交叉試驗(yàn)結(jié)果表明，不同基因型的抗原檢測相同的血清存在一定的差異，與其他研究結(jié)果相符。盡管多年來認(rèn)為NDV只有一個(gè)血清型，但不同毒株間存在抗原差異的事實(shí)也已為許多學(xué)者證實(shí)。結(jié)合本次攻毒保護(hù)試驗(yàn)及血清交叉結(jié)果，由于抗原性存在一定的差異，針對新城疫基因Ⅶ強(qiáng)毒株的攻擊，基因Ⅶ型NK01株的疫苗具有良好的保護(hù)效果，保護(hù)率為100%，基因Ⅱ型CM02株、LaSota株的疫苗攻毒保護(hù)效果不理想。

3.4 梁榮等在CEF細(xì)胞上進(jìn)行的中和試驗(yàn)同樣證明分離自西北地區(qū)的NDV毒株與現(xiàn)行的LaSota株系疫苗株和我國攻毒標(biāo)準(zhǔn)株F48E9之間存在較大的抗原性差別，這種差別很可能是造成La-Sota株系疫苗免疫失敗的原因之一[6]。由于基因Ⅶ型的出現(xiàn)使得我國ND的流行情況更加復(fù)雜，而強(qiáng)毒株不能用于疫苗候選毒株，因此，利用反向遺傳技術(shù)拯救病毒，并培育新城疫基因Ⅶ型弱毒疫苗株對新城疫的綜合防控具有重要的意義。

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2016-03-11

仇微紅(1982-)女，獸醫(yī)師，碩士，主要從事生物制品的研究及病毒生物學(xué)特性研究，E-mail：qiuweihong@gzscbm.com

彭特(1987-)，女，碩士，主要從事生物制品及病毒生物學(xué)特性研究，E-mail：pengte@gzscbm.com

葉賀佳，E-mail：yehejia@gzscbm.com

S858.31

A

0529-6005(2016)10-0009-03

注：彭特與仇微紅對本文具有同等貢獻(xiàn)