劉福和，倪文娟，王國(guó)康，徐權(quán)毅

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，浙江 寧波 315100； 2.華東寧波醫(yī)藥有限公司，浙江 寧波 315806）

當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)大鼠腎缺血－再灌注損傷后T L R4／N F－ B信號(hào)通路的影響

劉福和1，倪文娟2，王國(guó)康1，徐權(quán)毅1

（1.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院，浙江 寧波 315100； 2.華東寧波醫(yī)藥有限公司，浙江 寧波 315806）

目的 探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)大鼠腎缺血－再灌注損傷(RIRI)后TLR4／NF－ B信號(hào)通路的影響，為RIRI的作用機(jī)制及其干預(yù)提供參考。方法 將45只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血－再灌注模型對(duì)照組（IR組）、當(dāng)歸補(bǔ)血湯預(yù)處理組（IR＋DG組），每組15只。實(shí)驗(yàn)前5 d，Sham組和IR組以生理鹽水10 mL／(kg·d)每天灌胃1次，IR＋DG組以當(dāng)歸補(bǔ)血湯10 mL／(kg·d)每天灌胃1次。所有大鼠均切除右腎，Sham組僅游離左腎蒂，不夾閉左腎動(dòng)脈；IR組和IR＋DG組均行RIRI模型制備。比較各組血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平，行腎臟組織形態(tài)學(xué)檢查及腎小管評(píng)分，檢測(cè)腎組織TLR4，NF－ B p65 mRNA水平。結(jié)果 各組均按預(yù)定方案完成手術(shù)，IR組、IR＋DG組大鼠均順利完成RIRI模型制備；IR組、IR＋DG組血清Cr，BUN水平及腎組織中TLR4 mRNA和NF－ B p65 mRNA的表達(dá)水平均高于Sham組(t＝3.72～7.05，P＜0.05或 P＜0.01)，IR＋DG組血清Cr，BUN水平及腎組織中TLR4 mRNA和NF－ B p65 mRNA的表達(dá)水平均低于IR組(t＝4.16～5.37，P＜0.05)；Sham組腎臟呈正常的組織結(jié)構(gòu)，IR組、IR＋DG組均呈程度不一的炎性反應(yīng)，但 IR＋DG組炎性程度輕于 IR組；IR組、IR＋DG組腎小管評(píng)分均高于 Sham組水平(tIR＝9.02，tIR＋DG＝6.21，P＜0.01)，IR＋DG組腎小管評(píng)分低于IR組(tIR＝5.15，P＜0.05)。結(jié)論 大鼠RIRI后可能通過(guò)TLR4／NF－ B信號(hào)通路介導(dǎo)下游級(jí)聯(lián)炎癥免疫反應(yīng)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯預(yù)處理可能通過(guò)抑制TLR4／NF－ B信號(hào)通路而緩解RIRI損傷過(guò)程中的炎性反應(yīng)，對(duì)大鼠RIRI損傷具有積極的保護(hù)作用。

缺血－再灌注損傷；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；免疫炎性反應(yīng)；當(dāng)歸補(bǔ)血湯；干預(yù)；大鼠

腎臟是哺乳動(dòng)物的高灌注器官，對(duì)缺血及缺血－再灌注均比較敏感，腎缺血－再灌注損傷(RIRI)是臨床常見(jiàn)的病理現(xiàn)象[1]。免疫炎性反應(yīng)在RIRI的發(fā)病機(jī)制中可能有重要作用[2]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞表面信號(hào)傳導(dǎo)跨膜受體，即Toll樣受體(TLRs)是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，可通過(guò)激活核因子－κB（NF－κB)上調(diào)炎癥介質(zhì)表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)下游的級(jí)聯(lián)炎癥免疫反應(yīng)[2－3]。前期實(shí)驗(yàn)研究[4]及臨床實(shí)踐表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)腎臟具有較好的保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚未完全闡明?；诖?，筆者探討了當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)大鼠腎RIRI后 Toll樣受體4(TLR4)／NF－κB信號(hào)通路的影響，旨在為闡述當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)RIRI的可能的保護(hù)機(jī)制提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試藥及引物

動(dòng)物：健康雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量230～260 g，鼠齡8～12周，SPF級(jí)，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)前常規(guī)分籠飼養(yǎng)至少7 d。

試藥：當(dāng)歸（河南省宛西制藥股份有限公司，批號(hào)為080303）6 g，黃芪（河南省宛西制藥股份有限公司，批號(hào)為090203）30 g，加蒸餾水煎煮至100 mL(質(zhì)量濃度為0.36 g／mL)備用。

引物：TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄及定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒（美國(guó)Fermentas）。

目的基因及內(nèi)參所用引物為(5′－3′)β－actin：正向GAAGTACCCCATTGAACACG，反向CAGGTCCAGACGCAGGATGG；TLR4：正向AGACATCCAAAGGAATACAGCAA，反向GCCTTCATGTCTATAGGTGATGC；NF－κB p65：正向GAGAGCCCTTGCATCCTTTA，反向CTTCCCTTTGGTCTTTCTGT，由上海生物工程公司設(shè)計(jì)及合成。

1.2 方法

按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組，即假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注模型對(duì)照組(IR組)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯預(yù)處理組(IR＋DG組)，每組15只。試驗(yàn)前5 d，Sham組和IR組以生理鹽水10 mL／(kg·d)每天灌胃1次，IR＋DG組以當(dāng)歸補(bǔ)血湯10 mL／(kg·d)每天灌胃1次。大鼠試驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。予以3.5%水合氯醛10 mL／kg經(jīng)腹腔注射麻醉，沿正中線打開(kāi)腹腔。所有大鼠均切除右腎，其中Sham組僅游離左腎蒂，不夾閉左腎動(dòng)脈；IR組和IR＋DG組均使用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈45 min，松開(kāi)動(dòng)脈夾再灌注2 h，若腎臟經(jīng)紫黑色變?yōu)榧t色，則提示RIRI模型制作成功[4]，造模不成功的實(shí)驗(yàn)大鼠均予以剔除。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 腎功能生化指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)束后，抽取下腔靜脈血5 mL，采用日本Hitachi7170A型自動(dòng)化生化分析儀測(cè)定血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)。

1.3.2 腎臟組織形態(tài)學(xué)及腎小管評(píng)分

抽取靜脈血后，切除左腎，縱向剖開(kāi)，分成2段，一段置－70℃保存?zhèn)溆?；另一段置中性福爾馬林液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋制備病理切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腎小球、腎小管、腎間質(zhì)變化及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。采用Paller法[5]進(jìn)行腎小管評(píng)分以評(píng)估腎小管損傷程度，×400倍光鏡下在腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)交界部位隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野再隨機(jī)選取10條腎小管進(jìn)行評(píng)分，其中皮質(zhì)、髓質(zhì)各取1／2。統(tǒng)計(jì)100個(gè)腎小管計(jì)分，計(jì)算平均分值。分值越高腎小管損傷越嚴(yán)重。

1.3.3 腎組織TLR4，NF－κB p65 mRNA檢測(cè)

取保存的另一側(cè)腎組織 80 mg，組織勻漿后采用Trizol法提取腎臟總RNA；依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA為模板，按照QRT－PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，采用半定量RT－PCR法擴(kuò)增TLR4 mRNA，NF－κB mRNA。以目的基因與內(nèi)參β－actin表達(dá)量為參照進(jìn)行相對(duì)定量分析。RT－PCR反應(yīng)條件：94℃5 min，94℃30 s，TLR4 mRNA 60℃，NF－κB mRNA 55℃30 s，72℃1 min，72℃5 min，36個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析儀于紫外光下采集圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組間比較采用配對(duì)樣本的LSD－t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清Cr及BUN

各組均按預(yù)定方案完成手術(shù)，IR組、IR＋DG組大鼠均順利完成腎缺血－再灌注模型制備。IR組、IR＋DG組Cr和BUN水平均高于Sham組(t＝3.72～7.05，P＜0.05或 P＜0.01)，IR＋DG組血清Cr和BUN水平均低于IR組(tCr＝4.16，tBUN＝5.37，P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清Cr及BUN水平比較(s，例，n＝15)

表1 各組大鼠血清Cr及BUN水平比較(s，例，n＝15)

注：與 Sham組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與 IR組比較，cP＜0.05。表2同。

組別Sham組IR組IR＋DG組Cr( mol／L) 25.92±3.76 45.75±4.90b34.21±3.50acBUN(mmol／L) 6.67±0.45 14.95±0.76b10.27±0.53ac

2.2 腎臟組織形態(tài)學(xué)及腎小管評(píng)分

經(jīng)HE染色后，光鏡下可見(jiàn)：Sham組腎小球、腎小管呈正常的腎臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)，間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)充血水腫，亦沒(méi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1 A；IR組程度不一的腎小球與腎間質(zhì)呈充血像，腎小管上皮細(xì)胞不同程度的腫脹、壞死和脫落，管腔擴(kuò)張，腎間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，見(jiàn)圖1 B；IR＋DG組腎小球結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死及腎間質(zhì)的水腫輕于IR組，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1 C。Sham組、IR組、IR＋DG組腎小管評(píng)分分別為（85.27±16.50）分、（381.31± 52.32）分、（215.78±30.37）分，可見(jiàn)IR組、IR＋DG組腎小管評(píng)分均高于 Sham組(tIR＝9.02，tIR＋DG＝6.21，P＜0.01)，IR＋DG組腎小管評(píng)分低于IR組(tIR＝5.15，P＜0.05)。

圖1 HE染色（×400）

2.3 腎組織中TLR4和NF－ B p65 mRNA表達(dá)

以β－actin為內(nèi)參，檢測(cè)各組腎組織中TLR4 mRNA和NF－κB p65 mRNA的表達(dá)，IR組、IR＋DG組腎組織中TLR4 mRNA和NF－κB p65 mRNA的表達(dá)水平均高于 Sham組(t＝4.59～8.05，P＜0.05或 P＜0.01)，IR＋DG組腎組織中TLR4 mRNA和NF－κB p65 mRNA的表達(dá)水平均低于 IR組(tTLR4＝4.37，tNF－κBp65＝5.36，P＜0.05)。詳見(jiàn)表2。

3 討論

缺血－再灌注損傷是一種多因素、多途徑的復(fù)雜病理生理過(guò)程[6]，可能涉及復(fù)雜的發(fā)生進(jìn)展機(jī)制，但目前仍未完全闡明該發(fā)生機(jī)制，相關(guān)學(xué)者和學(xué)說(shuō)試圖闡釋該發(fā)生機(jī)制，有細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載、氧自由基增加、免疫炎癥因子作用、高能磷酸化合物缺乏、細(xì)胞凋亡及無(wú)復(fù)流現(xiàn)象等[1－2]，其中免疫炎性反應(yīng)介導(dǎo)的損傷作用被認(rèn)為是缺血－再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。

表2 各組大鼠腎組織中TLR4，NF－ B p65 mRNA表達(dá)水平比較(s，n＝15)

表2 各組大鼠腎組織中TLR4，NF－ B p65 mRNA表達(dá)水平比較(s，n＝15)

組別Sham組IR組IR＋DG組TLR4(×10－3) 0.51±0.09 2.60±0.17b1.43±0.21acNF－ B p65(×10－3) 0.61±0.13 2.81±0.36b1.12±0.23ac

TLR4／NF－κB信號(hào)通路在介導(dǎo)下游級(jí)聯(lián)炎癥免疫反應(yīng)中具有重要作用。有學(xué)者認(rèn)為缺血－再灌注損傷是以補(bǔ)體成分錯(cuò)誤攻擊自身抗原(Ag)為特征的先天性免疫應(yīng)答[7]。TLR4是目前研究較為成熟的一種TLRs，能特異性識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(PAMP)[8]，通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)將病原相關(guān)分子刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)NF－κB等轉(zhuǎn)錄因子活化激活NF－κB，激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起一系列的炎癥應(yīng)答，促成炎癥的發(fā)生和發(fā)展。阻斷TLR4／NF－κB信號(hào)傳導(dǎo)通路有望成為干預(yù)缺血－再灌注損傷的一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)[9]。

近年來(lái)，在缺血－再灌注損傷的干預(yù)研究中，缺血預(yù)處理備受關(guān)注并彰顯出諸多優(yōu)勢(shì)。缺血預(yù)處理[10]是指于可能缺血出現(xiàn)前即對(duì)組織器官進(jìn)行短暫、輕微的缺血－再灌注，從而提高細(xì)胞、組織和器官對(duì)缺血缺氧的耐受程度，一般認(rèn)為這是經(jīng)啟動(dòng)組織、細(xì)胞自身內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制而發(fā)揮效應(yīng)的[11]。目前，缺血預(yù)處理的保護(hù)作用已被不同的動(dòng)物及不同的器官模型所證實(shí)為可降低缺血－再灌注損傷的有效方法。本研究中，IR＋DG組于大鼠造模前經(jīng)腹腔注入當(dāng)歸補(bǔ)血湯即為缺血預(yù)處理，該方選自金元時(shí)期李東垣所著《內(nèi)外傷辨惑論》[12]，僅由當(dāng)歸、黃芪組方，其中重用黃芪以大補(bǔ)脾肺之氣，以資生血之源，與當(dāng)歸并用，養(yǎng)血和營(yíng)，則陽(yáng)生陰長(zhǎng)，氣血兩旺。兩藥配伍，共著補(bǔ)氣、生血、活血之功，臨床主要用于勞倦內(nèi)傷、氣弱血虛之證。

本研究結(jié)果表明，IR組、IR＋DG組血清Cr和BUN水平，腎小管評(píng)分，腎組織中TLR4 mRNA和NF－κB p65 mRNA的表達(dá)水平均高于Sham組，腎臟組織形態(tài)學(xué)也呈現(xiàn)出類似的變化，這提示IR組、IR＋DG組腎臟組織形態(tài)、功能出現(xiàn)損傷，TLR4及NF－κB轉(zhuǎn)錄增加，其原因在于造模所致的缺血－再灌注損傷。與IR組比較，IR＋DG組血清Cr和BUN水平、腎小管評(píng)分、腎組織中TLR4 mRNA和NF－κB p65 mRNA的表達(dá)均較低，提示IR＋DG組缺血－再灌注損傷較輕，分析其原因在于當(dāng)歸補(bǔ)血湯預(yù)處理減輕了缺血－再灌注損傷的程度，這與文獻(xiàn)[12]研究結(jié)果一致，某些中藥成分可以阻斷TLR4／NF－κB信號(hào)通路(包括降低其下游關(guān)鍵因子表達(dá))[13－14]，對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。

綜上所述，大鼠腎RIRI后可能通過(guò)TLR4／NF－κB信號(hào)通路介導(dǎo)下游級(jí)聯(lián)炎癥免疫反應(yīng)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯預(yù)處理可能通過(guò)抑制 TLR4／NF－κB信號(hào)通路而緩解缺血－再灌注損傷過(guò)程中的炎性反應(yīng)，對(duì)大鼠腎RIRI具有積極的保護(hù)作用。

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Influence of Danggui Buxue Decoction on TLR4／NF－κB Signal Pathway of Rats after Renal Ischemia Reperfusion Injury

Liu Fuhe1,Ni Wenjuan2,Wang Guokang1,Xu Quanyi1
(1.Pharmacy Faculty of Zhejiang Pharmaceutical College,Ningbo,Zhejiang,China 315100;
2.Huadong Ningbo Medicine Co.,Ltd.,Ningbo,Zhejiang,China 315806)

Objective To investigate the influence of Danggui Buxue Decoction on TLR4／NF－κB signal pathway of rats after renal ischemia reperfusion injury(RIRI),to provide reference for interpretation of its mechanism and intervention.M ethods 45 SD rats were randomly divided into the Sham group,IR group,and IR＋DG group,15 rats in each group.5 d before experiment,rats in Sham group and IR group were orally once a day with normal saline by 10 mL／(kg·d),and rats in IR＋DG group were orally once a day with Danggui Buxue Decoction by 10 mL／(kg·d).All rats were resected right kidney,rats in Sham group were dissociated left renal pedicle,without clamping left renal artery,and rats in IR group and IR＋DG group were all given RIRI model preparation.After experiment,serum creatinine(Cr)and urea nitrogen(BUN),renal histology and renal tubule score,TLR4 mRNA and NF－κB p65 mRNA in renal tissue were compared.Results All groups completed operation according to predetermined plan;IR group and IR＋DG group successfully completed RIRI model preparation.Serum Cr and BUN level,TLR4 mRNA and NF－κB p65 mRNA in renal tissue of IR group and IR＋DG group were both higher than that in sham group(t＝3.72－7.05,P＜0.05 orP＜0.01),and serum Cr and BUN level,TLR4 mRNA and NF－κB p65 mRNA in renal tissue of IR＋DG group were lower than that in IR group(t＝4.16－5.37, P＜0.05).Sham group′s kidney showed normal structure,and there were some inflammatory reactions in IR group and IR＋DG group, yet IR＋DG group′s inflammatory reaction were slighter than that in IR group.Renal tubules score in IR group and IR＋DG group were both higher than that in sham group(tIR＝9.02,tIR＋DG＝6.21,P＜0.01),yet IR＋DG group′s renal tubules score were lower than that in IR group(tIR＝5.15,P＜ 0.05).Conclusion It may mediate downstream cascade inflammatory immune response by TLR4／NF－κB signal pathway after RIRI in rats.Danggui Buxue Decoction pretreatment may relieve inflammatory response during RIRI process by inhibiting LR4／NF－κB signal pathway,thus has positive protection to RIRI.

ischemia reperfusion injury;signal transduction;inflammatory immune response;Danggui Buxue Decoction;intervention;rat

R285.5；R289.5

A

1006－4931(2016)21－0007－04

2016－07－13)

浙江省教育廳科研項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：Y201534611。