王志才，鄒樹平，顧愷，鄭裕國

（浙江工業(yè)大學生物工程研究所，浙江杭州310014）

環(huán)氧化物水解酶的特性及其應用研究進展

王志才，鄒樹平，顧愷，鄭裕國

（浙江工業(yè)大學生物工程研究所，浙江杭州310014）

微生物環(huán)氧化物水解酶來源廣泛，立體選擇性高，在手性環(huán)氧化物和手性二醇的合成中具有巨大的應用潛力。綜述了環(huán)氧化物水解酶微生物來源、酶學性質(zhì)、酶的結(jié)構(gòu)與催化機理；著重介紹了近年來微生物來源環(huán)氧化物水解酶的分子改造及在手性化學品合成制備中的應用研究進展；指出了微生物來源環(huán)氧化物水解酶現(xiàn)階段存在的問題并對未來發(fā)展方向進行了展望。

環(huán)氧化物水解酶；生物轉(zhuǎn)化；蛋白質(zhì)工程；催化機制；手性環(huán)氧化物

環(huán)氧化物水解酶（Epoxide hydrolase,EH,EC 3.3.2.3），又稱環(huán)氧化物水合酶，能夠立體選擇性地催化外消旋環(huán)氧化物水解，生成相應的1,2-二醇和光學活性的環(huán)氧化物[1]。EH廣泛存在于自然界中，在細菌、酵母、霉菌、植物、昆蟲以及哺乳動物中均發(fā)現(xiàn)有EH的存在。微生物EH序列大多屬于α/β折疊水解酶家族，該類酶具有優(yōu)良的對映體選擇性，使其在手性藥物和精細化學品制備中具有重要的應用價值[2]。

筆者主要綜述了EH的研究現(xiàn)狀，著重于該酶的微生物來源、酶學特性、結(jié)構(gòu)及催化機制、蛋白質(zhì)工程以及在生物催化過程中的應用。

1 環(huán)氧化物水解酶的微生物來源

大多數(shù)微生物來源的EH均以特定的環(huán)氧化物作為唯一碳源，如環(huán)氧氯丙烷，1-反式-2,3-環(huán)氧琥珀酸，1,2-環(huán)氧己烷等。1970年，Niehaus等[3]發(fā)現(xiàn)EH參與催化反應過程中表現(xiàn)出了立體選擇性和區(qū)域選擇性。Wijngaard等[4]以環(huán)氧氯丙烷為碳源從淡水沉淀物中成功篩選分離出一株具備EH活性的放射性土壤農(nóng)桿菌（Agrobacterium radiobacterAD1）。隨后，利用順式環(huán)氧琥珀酸和多環(huán)芳烴作為唯一碳源，從土壤（油浸土）中分離出的六株紅球菌均表現(xiàn)出EH活性[5]。此后，來源于Pseudomonas putida，Pseudomonas sp.strain AD1，Corynebacterium sp.strain N-1074，Corynebacterium sp.C12，Rhodococcus sp.（NOVO SP 409），Rhodococcus sp.NCIMB 11216，Aspergillus niger（LCP 521），Aspergillus niger ZJB-09101，Beauveria sulfurescens（ATCC7159），Xanthophyllomyces dendrorhous，DiplodiagossipinaATCC16391，BacillusmegateriumECU1001，Trichosporonloubierii ECU1040，Agromyces sp.ZJB09106等微生物的EH先后被分離并表征[6]。

2 環(huán)氧化物水解酶的酶學性質(zhì)

一般表征目的酶的酶學性質(zhì)需要電泳純的酶液，該純度的酶液也是生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)精細化學品的理想催化劑，相比較于全細胞生物催化劑，電泳純酶液催化具有目的產(chǎn)物單一、副產(chǎn)物少等優(yōu)勢。已報道的EH純化方法涉及硫酸銨沉淀法、疏水層析、親和層析、離子交換層析和凝膠過濾法等。表1列出了已報道EH的酶學性質(zhì)，可以看出：EH的分子量均介于28～66 kDa之間，其中來源于黑曲霉的EH分子量均在40～45 kDa之間；pH對酶的活性和穩(wěn)定性影響顯著，絕大多數(shù)EH最適pH介于7.0～9.0之間，但來源于A.brasiliensis CCT1435和A.niger M200的EH分別在pH為6.0和6.8時表現(xiàn)出最大活力；除了來源于Klebsiella sp.BK-58的EH在50℃表現(xiàn)出最大活力外，EH的最適溫度均介于30℃到45℃之間；鹵代烷酸和羧酸可以抑制相當大一部分酶的活力，例如，間氯過氧苯甲酸、ω-溴-4-對硝基苯乙酮可以使來源于A.niger黑曲霉的EH完全失活，對氯汞苯甲酸可使來源于Corynebacterium sp.strainN-1074和Pseudomonas pufida的EH活力喪失[7-8]，環(huán)氧琥珀酸和乙二胺四乙酸（EDTA）可使來源于P.pufida和Bordetella sp.strain 1-3的EH喪失活性[8-9]；金屬離子Ag+, Hg2+,Fe2+,Cu2+和強氧化劑H2O2也嚴重影響EH活力。

表1 EH酶學性質(zhì)概述

3 環(huán)氧化物水解酶結(jié)構(gòu)和催化機制

研究酶的3D結(jié)構(gòu)可以解釋結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，更好地解析酶的催化機理。首個EH的3D結(jié)構(gòu)是由Nardini等[10]在1999年解析出來（分辨率2.1?），該酶來源于A.radiobacter，序列和結(jié)構(gòu)分析表明該酶屬于α/β折疊水解酶家族，為雙二聚體相互作用組成的四聚體，每個亞基由7個α-螺旋和8個β-折疊組成（圖1）。活性位點殘基Asp107和His275位于核心區(qū)域和帽子區(qū)域之間主要疏水腔內(nèi)，中心結(jié)構(gòu)域是由殘基Gly37，Trp38，Pro39，Glu44，His106，Asp107，Phe108，Ile133，Phe137，Ile219，His275，Phe276和Val279以及帽子區(qū)域殘基Tyr152，Trp183和Tyr215組成。這一特點和來自A.radiobacter的鹵醇脫鹵酶（HheC,HHDH,EC 4.5.1.X）極其類似。Zou等[11]于2000年報道了A. niger EH的晶體結(jié)構(gòu)（1.8 ?分辨率），并將其與來源于A.radiobacter的EH晶體結(jié)構(gòu)比較，發(fā)現(xiàn)二者的三級和四級結(jié)構(gòu)類似，并具有類似的活性區(qū)域以及帽子區(qū)域。接著將來源于Mycobacterium tuberculosis的EH和來源于Bacillus megaterium的EH晶體結(jié)構(gòu)與來源于A.radiobacter的EH晶體結(jié)構(gòu)相比較，發(fā)現(xiàn)前兩者與后者結(jié)構(gòu)核心區(qū)域重合較好，而帽子區(qū)域差異較大[12]。

Rink等[13]通過定點突變確定來源于A.radiobacter的EH催化三聯(lián)體為Asp107，His275和Asp246，其催化機制與鹵醇脫鹵酶是類似的兩步催化。首先，Asp107攻擊環(huán)氧化物中伯碳原子形成共價脂中間體。然后，被His275和Asp246作用對活化的水分子水解脂鍵釋放相應的鄰二醇（圖2（a）），與Asp107緊鄰的Phe108在此過程中可能起到開環(huán)的作用，Tyr152/Tyr215在底物結(jié)合、過渡態(tài)的穩(wěn)定以及環(huán)氧化物質(zhì)子化中具有重要作用[14]。2014年Kong等[12]通過來源于B.megaterium的EH晶體結(jié)構(gòu)結(jié)合已報道的環(huán)氧化物水解酶結(jié)構(gòu)，確定了該EH的催化三聯(lián)體，即Asp97，Asp239和His267，其催化機理為：第一步環(huán)氧底物進入活性中心后，由Asp97的羧酸親和攻擊環(huán)氧β碳原子形成脂鍵連接的底物-酶中間體，同時由Tyr144或Tyr203對環(huán)氧氧原子進行質(zhì)子化；第二步為由Asp239和His267活化的水分子親和攻擊共價脂鍵中的羰基碳原子形成四面體結(jié)構(gòu)的過渡態(tài)，進而釋放產(chǎn)物鄰二醇；其中Tyr144和Tyr203參與底物結(jié)合與質(zhì)子化，氧洞殘基為Phe30和Trp98，此外Typ98與底物存在相互作用，穩(wěn)定了底物結(jié)合的構(gòu)象。對比發(fā)現(xiàn)，同為微生物來源的兩個EH各自的催化機理是極其相似的。

4 環(huán)氧化物水解酶的蛋白質(zhì)工程

理想的生物催化劑需要具備高效的催化活性、良好的穩(wěn)定性（溫度、pH）、高對映體選擇性以及易重復利用等特性，這些特性對于實現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)以及降低成本具有重要意義。然而，大多數(shù)來源于野生菌的酶并不具備我們所期望的這些特性，從而很難直接應用到工業(yè)化生產(chǎn)當中。近年來研究發(fā)現(xiàn)利用蛋白質(zhì)工程，以原始酶為“原料”可以量身定制各類具有工業(yè)化價值的生物催化劑。蛋白質(zhì)工程可分為理性設計和定向進化，已有報道指出通過蛋白質(zhì)工程可成功提高EH的立體選擇性、活性和穩(wěn)定性。

Baratti等[15]對來源于A.niger的EH進行了重組表達，借助易錯PCR的方法進行定向進化，將該酶對4-（對硝基苯氧基）-1,2-環(huán)氧丁烷的催化效率提高3.3倍。2011年Reetz等[16]利用定向進化策略對來源于A.niger的EH的表達效率進行改造，利用LacZα作為報告蛋白來篩選目的菌落，從突變庫中篩選到最優(yōu)突變體的表達效率比原始酶提高了近50倍。

來源于A.radiobacter的EH和A.niger的EH3D結(jié)構(gòu)和催化機制相繼被解析報道為理性設計提供了諸多可能。Reetz等[17]在通過迭代飽和突變（ISM）對來源于A.niger LCP 521的EH進行改造時引入了一種高效的組合試驗方法，即組合活性位點飽和試驗法（CAST），該法使用2個或3個活性位點殘基的全部密碼子組或一個子集進行飽和誘變，其重點是創(chuàng)建相對較小的突變庫，有利于篩選出對底物的對映體選擇性有明顯提高的突變體，經(jīng)過五輪突變，篩選得到的最優(yōu)突變對底物苯基縮水甘油醚的對映體選擇性由4.6提高到115（42倍）。該突變菌相比較于突變前對R構(gòu)型底物側(cè)鏈空間位阻增加，從而對R構(gòu)型底物水解速度顯著降低，而水解S構(gòu)型底物速度保持不變，故大大提高了其對映體選擇性。2013年，Arand等[18]對宏基因組來源的Kau2-EH進行迭代飽和突變，經(jīng)過8輪反復突變，得到突變體F:13-B11（Trp110Leu/Phe113Val/Phe161Tyr/Pro193Gly/Val 290Trp），使其對底物對氯氧化苯乙烯e.e.值由84%提高至93%，突變體wt-sd（Val290Tyr）對底物對氯氧化苯乙烯對映體選擇性提高5倍。Rui等[19]利用半理性設計對來源于A.radiobacter的EH在Phe108，Ile219，Ile111和Cys248四個特定的位點進行3輪ISM突變以期積累有益突變。突變體Phe108Leu/Ile219Leu/Cys248Ile對底物順式-二氯乙烯活力提高10倍，對環(huán)氧己烷活力提高2倍，對環(huán)氧氯丙烷活力提高6倍。本課題組利用定點（飽和）突變對來源于A.radiobacter的重組大腸桿菌EH實施分子改造，得到的最優(yōu)突變菌株IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys較原始酶活力提高4.4倍，對映體選擇性提高2.1倍。Kong等[20]解析了來源于B.megaterium ECU1001的EH的晶體結(jié)構(gòu)，并對其進行了分子改造，突變體Met145Ala，Phe128Ala和Phe128Ser對底物α-萘基縮水甘油活力分別提高25，42和434倍。2015年，本課題組借助同源建模和熱點分析，對來源于Agromyces mediolanus ZJB120203的EH進行定點飽和突變，利用96孔板顯色反應從2000株突變菌中得到最優(yōu)菌Trp182Phe/Ser207Val/ Asn240Asp，其對底物環(huán)氧氯丙烷活力提高7倍，對映體選擇性提高1.7倍[21]。

5 環(huán)氧化物水解酶的生物催化應用

5.1 動力學拆分

利用微生物來源的EH拆分外消旋環(huán)氧化物合成手性化合物和相應的鄰二醇已成為近年來的研究熱點。Pedragosa-Moreau等[22]首次利用來源A.niger（LCP 521）的EH拆分外消旋香葉醇氨基甲酸酯類，得到e.e.值為94%的S構(gòu)型產(chǎn)物，收率可達42%（理論最高為50%），此外，該EH同時表現(xiàn)出對外消旋氧化苯乙烯的活力，拆分2 h后S-環(huán)氧苯乙烯e.e.值可達99%（收率為28%），對應產(chǎn)物R-鄰二醇e.e.值可達60%～70%。來源于細菌的EH用于生物轉(zhuǎn)化過程中具備兩個誘人的特點：不會產(chǎn)生致密的菌絲體和易實現(xiàn)克隆增殖。在利用來源于A.radiobacter AD1的EH突變株Tyr215Phe克級制備手性2-吡啶基乙烷過程中，在底物濃度為127 mmol/L下，拆分得到S-2-吡啶基乙烷e.e.值達到98%，收率為36%，相應的產(chǎn)物R-鄰二醇e.e.達到81%，收率為40%[23]。Zou等[24]借助來源于A.radiobacter AD1的重組EH篩選出最適該酶催化的水-異辛烷兩相反應體系對映體水解ECH制備R-ECH，相較于單水相底物濃度提高了55%，達到574 mmol/L，R-ECH收率達到37.5%，e.e.值為99.3%，時空產(chǎn)率為0.286 mol/（L· h）。2015年，本課題組利用重組來源于A.mediolanus的EH大腸桿菌突變體VDF拆分外消旋環(huán)氧氯丙烷，在高底物濃度下（450 mmol/L），得到手性純（e.e.>99%）的S-環(huán)氧氯丙烷收率達到40.5%[21]。

5.2 對映歸一性水解

對于傳統(tǒng)的動力學拆分而言，其內(nèi)在的缺陷在于手性純產(chǎn)物收率理論最大值僅為50%。以下三種方法可以克服動力學拆分存在的收率偏低的問題：前手性底物的不對稱合成、動態(tài)動力學拆分外消旋化合物以及借助互補酶或化學-酶法耦合對映歸一性水解反應。Pedragosa-Moreau等[22]使用不同微生物來源、對映體偏好性互補的雙酶策略對映歸一性水解氧化苯乙烯以期得到手性純的相應鄰二醇，其產(chǎn)物e.e.值達98%，收率為85%。另外，對映歸一性水解反應也可借助同時表現(xiàn)對不同構(gòu)型底物具有不同對映體選擇偏好的單酶來實現(xiàn)，例如來源于Nocardia的EH I就具備該特點，其能對映歸一性水解（±）-順式-2,3-環(huán)氧庚烷得到手性純的相應鄰二醇，e.e.值達91%，收率為79%[25]。

另一種實現(xiàn)對映歸一性水解的途徑為通過化學-酶耦合法來實現(xiàn)。第一種類型：首先EH將外消旋底物的一種構(gòu)型水解為對應鄰二醇，而后利用化學法使得另外一種對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化為相同構(gòu)型的鄰二醇，基于這一反應類型，成功制備出（1S, 2S）-1-甲基環(huán)己烷-1,2-二醇（e.e.值為95%，收率為80%）和（R）-對硝基苯乙烯二醇（e.e.值為80%，收率為94%）[26-27]；第二種反應類型：一種構(gòu)型的底物被EH水解為相應的鄰二醇，而后利用化學催化方法將該鄰二醇環(huán)化為另一構(gòu)型底物。Monfort等[28]利用該對映歸一性水解類型成功制備出（S）-鄰氯（2,4-二氟苯基）-2,3-環(huán)氧丙烷，其e.e.值為98%。

6 結(jié)論

EH作為生物催化劑可通過對映體拆分或?qū)τ硽w一性水解反應用于制備手性環(huán)氧化物以及對應的鄰二醇。EH潛在的應用價值引起學者們的極大興趣，加之近年來手性環(huán)氧化物需求急劇增加，探索新型EH顯得尤為重要。隨著諸如宏基因組技術(shù)的新型酶篩選方法的引入，一些具有應用前景的新型EH有望被相繼發(fā)現(xiàn)，例如耐高底物濃度以及對產(chǎn)物耐受性增強的新型EH是今后探索的一個方向。針對現(xiàn)有EH，可結(jié)合定點突變以及定向進化等分子修飾方法提高其活性、穩(wěn)定性、對映體選擇性以及拓寬其底物譜，使其更適合工業(yè)應用和高附加值的化學品和藥品生產(chǎn)。另外，進一步提升對EH序列-結(jié)構(gòu)-活性-對映體選擇性之間的關(guān)系，更深入了解EH的反應機制同樣具有重要意義。

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（責任編輯：朱小惠）

Properties and applications of microbial epoxide hydrolase

WANG Zhicai,ZOU Shuping,GU Kai，ZHENG Yuguo
（Institute of Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China）

Due to the extensive sources and high stereoselectivity,microbial epoxide hydrolasehas a great potentials in the synthesis of chiral epoxides and corresponding diols.The microbial sources,enzymatic properties,crystal structure and catalytic mechanism of epoxide hydrolase were reviewed in this paper.The research progress on the protein engineering of epoxide hydrolase and its applicationin the preparation of chiral chemicals were introduced in detail.The existing problems of microbial epoxide hydrolase were pointed out and future development direction is prospected.

epoxide hydrolase;biotransformation;protein engineering;catalytic mechanism;chiral epoxide

Q814.9

A

1674-2214（2016）04-0204-06

2016-03-30

國家自然科學青年基金資助項目（21406205）

王志才（1991—），男，安徽太和人，碩士，研究方向為手性生物催化與酶工程，E-mail：wangzhangzctt@163.com.通信作者：鄭裕國教授，E-mail:zhengyg@zjut.edu.cn.