劉夢云，申雨珂，靳羽曉，吳元鋒,2，龔金炎,2，樓堅,2，毛建衛(wèi),2,3，劉士旺,2,3

(1.浙江科技學(xué)院生化學(xué)院/輕工學(xué)院，浙江杭州310023；

2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310023；

3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州310023)

GABA產(chǎn)生菌的篩選以及檢測方法的比較研究

劉夢云1，申雨珂1，靳羽曉1，吳元鋒1,2，龔金炎1,2，樓堅1,2，毛建衛(wèi)1,2,3，劉士旺1,2,3

(1.浙江科技學(xué)院生化學(xué)院/輕工學(xué)院，浙江杭州310023；

2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310023；

3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州310023)

對發(fā)酵產(chǎn)GABA的乳酸菌進(jìn)行了篩選以及對GABA檢測方法進(jìn)行了比較。從市售酸奶中分離到一株產(chǎn)GABA的乳酸菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，初步確認(rèn)為德氏乳桿菌；探索了兩種不同GABA檢測方法的效果。比色法測定GABA含量的條件為體積分?jǐn)?shù)2%的飽和苯酚和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.08%的次氯酸鈉處理，紙層析-分光光度法測定GABA含量的最適條件為：展開劑V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）＝4∶1∶3，顯色溫度80℃，顯色時間30 min，檢測波長510 nm。

γ-氨基丁酸；德氏乳桿菌；GABA檢測

已有許多研究者對乳酸菌發(fā)酵進(jìn)行了研究，并取得了很好的研究結(jié)果，其中乳酸菌在生長過程中產(chǎn)生γ-氨基丁酸（GABA）越來越引起人們的關(guān)注[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，GABA具有提高動物的記憶、增強(qiáng)免疫力、降低血壓、保護(hù)腎臟、預(yù)防肥胖和抗焦慮等功效，特別是GABA可以提高葡萄糖磷酸酯酶的活性，使腦細(xì)胞活動旺盛，可促進(jìn)腦組織的新陳代謝和恢復(fù)腦細(xì)胞功能，改善神經(jīng)機(jī)能，對腦血管障礙引起的癥狀，如偏癱、記憶障礙、兒童智力發(fā)育遲緩及精神幼稚癥等有很好的療效，該領(lǐng)域已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)之一[5-8]。

筆者對分離得到的乳酸菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定，篩選能夠產(chǎn)生GABA的乳酸菌，對GABA的實(shí)驗(yàn)室檢測方法作了比較，為開發(fā)利益乳酸菌資源提供了技術(shù)指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 供試菌種

實(shí)驗(yàn)室分離乳桿菌（德氏乳桿菌）。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉2 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1 000 mL，加入15～20 g瓊脂制成MRS固體培養(yǎng)基，pH 6.2～6.4，121℃滅菌20 min。

乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏5 g，糙米酶解液（5 g糙米酶解）5 g，番茄汁100 mL，L-谷氨酸10 g，蒸餾水900 mL，pH 6.4，121℃滅菌20 min。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 乳酸菌分離與鑒定

2.1.1 乳酸菌分離

將市售新鮮雙峰酸奶稀釋到10-5，涂布在MRS固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3 d后挑取單菌落，劃線接種得到純化菌株。挑取純化菌株到MRS試管斜面上，用硅膠塞塞好試管口，保藏在4℃冰箱，每兩周轉(zhuǎn)接一次。

2.1.2 乳酸菌鑒定

1）乳酸菌形態(tài)學(xué)觀察

將保藏在4℃冰箱里的試管斜面取出，在試管斜面上劃線2～3次，使其充分活化。將活化好的菌在MRS液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h，再取發(fā)酵液稀釋到適當(dāng)濃度，涂布在MRS固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3 d觀察菌落形態(tài)、大小、顏色、是否褶皺等特征。挑取培養(yǎng)3 d的單菌落，革蘭氏染色，觀察細(xì)胞形態(tài)、染色情況、排列方式等，并拍照記錄。

2）接觸酶檢測

將培養(yǎng)24 h的斜面菌種用滅菌玻璃棒或滅菌牙簽挑取一小環(huán)，涂抹于滴有3%過氧化氫的玻片上，如有氣泡產(chǎn)生則為陽性，無氣泡為陰性。

3）糖發(fā)酵試驗(yàn)

蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，吐溫-80 0.5 mL，糖或醇10 g，蒸餾水1 000 mL，加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1.4～2 mL，調(diào)pH 6.8～7.2，分裝于試管，分裝好的培養(yǎng)基112℃滅菌30 min，接種后輕搖試管，37℃培養(yǎng)1～2 d。產(chǎn)酸時，溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，為陽性，不變色或變藍(lán)（紫）為陰性。滅菌時用棉塞，培養(yǎng)時用橡膠塞。

4）淀粉水解試驗(yàn)

固體淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏5 g，可溶性淀粉2 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂15～20 g，121℃滅菌20 min。制成平板，劃線接種，37℃培養(yǎng)1 d，觀察菌生長情況，滴入少量盧戈氏碘液，使碘液充滿整個平板。如果菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉被水解，為陽性。

5）油脂水解試驗(yàn)

油脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，香油或花生油10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH為7.2，加1.6%中性紅水溶液1 mL，分裝時，需不斷攪拌，使油脂均勻分布于培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min。制成平板，劃線接種，37℃培養(yǎng)1 d，如果出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，說明脂肪水解，為陽性反應(yīng)。

6）明膠水解試驗(yàn)

明膠培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液100 mL，明膠12～18 g，在水浴鍋將上述成分融化，融化后調(diào)節(jié)pH 7.2～7.4，分裝到試管，121℃滅菌30 min。穿刺接種后20℃培養(yǎng)2～5 d，觀察明膠液化情況。

7）甲基紅試驗(yàn)

葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，磷酸氫二鉀2 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，雙層紗布過濾，分裝試管，每管10 mL，112℃滅菌30 min。接種后37℃培養(yǎng)48 h，加入甲基紅試劑2滴，培養(yǎng)基變紅者為陽性，變黃為陰性[3]。

8）V.P.試驗(yàn)

培養(yǎng)基同葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。接種后37℃培養(yǎng)48 h，加入5～10滴40%的NaOH，然后加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃溫箱中保溫15～30 min，培養(yǎng)物為紅色者為陽性反應(yīng)[3-4]。

2.1.3 產(chǎn)GABA乳酸菌的初步篩選

將得到的純化菌株接種于含10 g/L L-谷氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置發(fā)酵2 d后，取發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min后點(diǎn)樣，在V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3的展開劑中展開。放入80℃烘箱中干燥30 min，取出觀察結(jié)果。

2.1.4 紙層析—分光光度法測定GABA

分別選擇V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）為2∶1∶1，4∶1∶3，4∶1∶1試驗(yàn)不同配比展開劑對GABA層析效果的影響。將濾紙按照層析缸大小進(jìn)行裁剪，所用層析缸為20 cm×20 cm，故濾紙高度15～20 cm，寬度按要點(diǎn)的樣品個數(shù)選擇適當(dāng)長度。在展開劑中加茚三酮4 g/L，平衡約30 min，再用毛細(xì)管分別點(diǎn)上10 g/L L-谷氨酸，1 g/L GABA，發(fā)酵液（3 d，含10 g/L L-谷氨酸的MRS培養(yǎng)基）10 000 r/ min離心5 min后點(diǎn)樣，層析結(jié)束后，在90℃烘箱顯色15 min，取出觀察顯色斑點(diǎn)。點(diǎn)樣過程注意保持濾紙干燥潔凈，以免污染濾紙使結(jié)果有誤差；取出觀察顯色斑點(diǎn)時，要注意開烘箱的一瞬間，烘箱中正丁醇和醋酸揮發(fā)氣體對眼睛和呼吸道的影響。

2.1.5 洗脫液最佳吸收波長的測定

用微樣進(jìn)量器吸取GABA標(biāo)準(zhǔn)液1 μL點(diǎn)樣（GABA標(biāo)準(zhǔn)液為20 mg/mL，即點(diǎn)樣GABA為20 μg），展開劑配比為V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3，加入茚三酮4 g/L。90℃干燥15 min，剪下標(biāo)準(zhǔn)液斑點(diǎn)放入玻璃試管中，加入5 mL洗脫液（V（0.1%硫酸銅）∶V（75%乙醇）=2∶38）洗脫30 min后，分別在490，500，505，510，513，515，520，525，535 nm處測吸光度，空白液為洗脫液。

2.1.6 顯色溫度和時間的確定

用微樣進(jìn)量器吸取GABA標(biāo)準(zhǔn)液1 μL點(diǎn)樣（GABA標(biāo)準(zhǔn)液為20 mg/mL，即點(diǎn)樣GABA為20 μg），展開劑配比為V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3，加入茚三酮4 g/L。層析結(jié)束后，分別在70，80，90℃下顯色10，20，30，40 min，剪下顯色斑點(diǎn)洗脫比色測定OD510。

2.1.7 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用微樣進(jìn)量器分別吸取0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)液5 μL，點(diǎn)樣，在展開劑配比為V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3，茚三酮4 g/L的展開劑中層析分離。層析結(jié)束后，立即放入80℃烘箱干燥顯色30 min取出，在V（0.1%硫酸銅）∶V（75%乙醇）=2∶38的洗脫劑中洗脫30 min，測定洗脫液的OD510。

2.1.8 乳酸菌產(chǎn)GABA的定性測定

將得到的純化菌株接種于含10 g/L的L-谷氨酸的MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置發(fā)酵2 d后，取發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min后點(diǎn)樣，在V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3的展開劑中展開。放入80℃烘箱中干燥30 min，取出觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 乳酸菌形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示：通過顯微鏡觀察和形態(tài)學(xué)觀察，乳酸菌菌落長的較小，乳白色，較濕潤，直徑1.5 mm左右，中間隆起，不透明，邊緣不平整。革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)此乳酸菌為G+、桿狀菌。

3.2 乳酸菌生理生化結(jié)果

乳酸菌的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，查閱孟祥晨[3]等編著的《乳酸菌與乳品發(fā)酵劑》，得知此菌為德氏乳桿菌。

表1 乳酸菌生理生化結(jié)果1）

3.3 產(chǎn)GABA乳酸菌篩選

對4種菌株培養(yǎng)基發(fā)酵液分別做紙層析，編號分別為3，4，5，6，點(diǎn)1為GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品，點(diǎn)2為L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

3號培養(yǎng)基乳酸菌數(shù)多，但5號培養(yǎng)基里GABA跑出的點(diǎn)顏色比其余3點(diǎn)深，GABA產(chǎn)量也最高，故選擇3號菌株為發(fā)酵菌株。乳酸菌經(jīng)加有10 g/L L-谷氨酸的MRS液體培養(yǎng)基發(fā)酵后，能產(chǎn)GABA。

3.4 GABA檢測方法比較

3.4.1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

由圖3得知：線性回歸方程為y=0.167 6x+ 0.003 1，R2=0.994 8，具有較好的精確度。

3.4.2 比色法測定GABA

比色法是利用苯酚、次氯酸鈉與游離氨反應(yīng)呈藍(lán)色來測定不同體系中的微量氨及其鹽類的含量，即Berthelot反應(yīng)。氨基酸存在氨基，對Berthelot反應(yīng)存在一定的響應(yīng)。氨基酸中氨基的位置不同，對Berthelot反應(yīng)的響應(yīng)程度也不同。其中ω-氨基酸反應(yīng)靈敏度最高，而α-氨基酸響應(yīng)低，因此可用來測定ω-氨基酸的含量。

通常GABA濃度越高，反應(yīng)后溶液呈現(xiàn)的藍(lán)色越深。由于Berthelot反應(yīng)中苯酚和次氯酸鈉對比色結(jié)果有影響，因此首先對其濃度進(jìn)行確定。

從圖4中可以得知：隨著苯酚體積分?jǐn)?shù)的升高，OD值也升高，在苯酚體積分?jǐn)?shù)為2%時OD值最高，苯酚體積分?jǐn)?shù)再升高時，OD值反而下降，所以比色法測定GABA的最適苯酚體積分?jǐn)?shù)為2%。

從圖5中可以得知：隨著次氯酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，OD值也升高，次氯酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.08%時OD達(dá)到最高值，次氯酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)再往上升高，則OD值下降較快，所以比色法測定GABA的最適次氯酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.08%。

由圖6可知：該曲線具有較好的線性關(guān)系，但在測定糙米及發(fā)酵液GABA含量時，發(fā)現(xiàn)離心后的溶液仍帶點(diǎn)混濁，對測量造成很大誤差，測量后發(fā)現(xiàn)每100 g糙米GABA含量為文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[27]的10～20倍，準(zhǔn)確性差。

該方法適用于大量樣品檢測，但容易受到溶液中游離氨的影響。比色法適用于米胚芽和谷氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)化體系中的GABA質(zhì)量濃度檢測，但要考慮L-谷氨酸對檢測的影響。在檢測時，苯酚和次氯酸鈉用量對結(jié)果有關(guān)鍵影響，起初吸光度都隨苯酚和次氯酸鈉用量增加而增加，達(dá)到一定量后，吸光度反而下降，而且高濃度用量對低濃度GABA檢測極為不利，所以選擇正確苯酚和次氯酸鈉用量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大影響。

3.4.3 紙層析-分光光度法測定GABA

紙層析是在一張?zhí)刂频臑V紙如新華1號層析紙上，在距濾紙底部1～2 cm處畫上一條直線，在直線上相距2 cm左右用鉛筆各點(diǎn)上一個點(diǎn)，用毛細(xì)吸管或微樣進(jìn)量器在點(diǎn)上滴上要測定的樣品液，然后用特定展開劑（加茚三酮）展開，使樣品中各個物質(zhì)分開。當(dāng)展開劑前沿到達(dá)距濾紙頂端1～2 cm時，立即將濾紙放入一定溫度的烘箱，濾紙平鋪在干燥潔凈的平板上，干燥一定時間后顯色，將顯色斑點(diǎn)剪下，吸取一定量洗脫劑洗脫，測定洗脫液吸光度，從而計算樣品GABA質(zhì)量濃度。

1）展開劑不同配比對GABA層析效果的影響

從左到右的點(diǎn)分別是1 g/L GABA，10 g/L L-谷氨酸，含10 g/L L-谷氨酸的MRS培養(yǎng)基，展開劑A的配比為V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=2∶1∶1（圖7（a））；展開劑B的配比為V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶1（圖7（b））；展開劑C的配比為V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3（（圖7（c））。圖7（c）的第四個點(diǎn)是含10 g/L L-谷氨酸的MRS培養(yǎng)基的點(diǎn)。由圖7（c）得知展開劑體積比為4∶1∶3展開時，發(fā)酵液GABA和L-谷氨酸分離較好，故選擇展開劑配比為4∶1∶3。

2）洗脫液最佳吸收波長的測定

由圖8得知：隨著吸收波長的增加，OD值也在增加，OD值在510 nm處達(dá)到最大值，繼續(xù)增大吸收波長，OD值反而下降。在510 nm處，GABA洗脫液的OD值最大，對GABA濃度測定誤差最小，故測量GABA濃度選擇波長為510 nm。

3）顯色溫度和時間的確定

由表2得知：隨著溫度的升高和顯色時間的延長，GABA洗脫液OD值下降；顯色溫度太高，會造成GABA與茚三酮的反應(yīng)物與層析紙結(jié)合牢固，不能被洗脫下來在洗脫液中形成銅的絡(luò)合物[17]；顯色時間過長，雖然OD值上升，但時間久，絡(luò)合物可能分解造成OD值下降。綜合上述分析選擇顯色溫度和時間分別為80℃、30 min。

表2 顯色溫度和時間對吸光度影響

4 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)乳酸菌菌種是從酸奶中分離出的一類有益微生物，該菌在自然界中廣泛存在并且得到了有效利用，不同研究者對乳酸菌的形態(tài)、生理、代謝等進(jìn)行了研究，力求最大限度利用和開發(fā)乳酸菌資源，使乳酸菌造福于人類[9-12]。高產(chǎn)GABA乳酸菌的分離，為人們利用乳酸菌創(chuàng)造了新的途徑，筆者建立的GABA檢測方法，可以有效幫助分離GABA乳酸菌和篩選高含量GABA菌株，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，苯酚體積分?jǐn)?shù)2%、氯酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.08%有利于比色法測定GABA，展開劑體積比4∶1∶3，顯色溫度80℃，顯色時間30 min的紙層析-分光光度法能夠較好測定GABA。下一步還可以從干燥溫度、干燥時間、洗脫波長、洗脫液量、展開劑配比等方面進(jìn)行條件優(yōu)化，尤其是展開劑配比應(yīng)針對發(fā)酵液而設(shè)計，還可以嘗試硅膠板代替濾紙做層析，獲得更加有效的GABA檢測方法。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Isolation of high-GABA production strains and comparison of GABA assay methods

LIU Mengyun1,SHEN Yuke1,JIN Yuxiao1,WU Yuanfeng1,2,GONG Jinyan1,2,LOU Jian1,2, MAO Jianwei1,2,3,LIU Shiwang1,2,3
(1.School of Biological and Chemical Engineering/School of Light Industry,Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310023,China;2.Zhejiang Provincial Key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm Product,Hangzhou 310023,China;3.Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Resources Biochemical Manufacturing,Hangzhou 310023,China)

The GABA producing Lactobacillus was isolated and the GABA assay methods were compared in this paper.A GABA producing strain was isolated from yoghurt,which was identified as Lactobacillus delbruckii by morphological,physiological and biochemical characterization.The optimum concentrations of phenol and sodium hypochlorite for colorimetric assay of GABA were determined as 2%and 2.08%,respectively.The optimum conditions for paper chromatographyspectrophotometry assay were as follows:the ratio of developing solvent n-butanol,glacial acetic acid,and water was 4∶1∶3(V∶V∶V),the temperature and time for color development were set at 80℃and 30 min,respectively,and the detection wavelength was set at 510 nm.

γ-aminobutyrate;Lactobacillus delbruckii;GABA detection

TQ92

A

1674-2214（2016）04-0226-06

2016-10-11

浙江省重點(diǎn)研發(fā)計劃資助項(xiàng)目（2015C02053）

劉夢云（1990—），女，河南周口人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘?，E-mail：738257827@qq.com.通信作者:劉士旺教授，E-mail：shiwangliu@163.com.