劉金海，羅小麗，管 健，黃 輝，陳 恒

( 1.集美大學 水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021； 2.集美大學 水生生物技術研究所，福建 廈門 361021； 3.鰻魚現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術教育部工程研究中心，福建 廈門 361021 )

半滑舌鰨鰓黏液免疫相關酶活性對黃芪多糖的免疫應答

劉金海1,2,3，羅小麗1，管 健1，黃 輝1，陳 恒1

( 1.集美大學 水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021； 2.集美大學 水生生物技術研究所，福建 廈門 361021； 3.鰻魚現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術教育部工程研究中心，福建 廈門 361021 )

在水溫25 ℃下，給體質(zhì)量(5.8±1.5) g的半滑舌鰨投喂在基礎飼料中添加0、300、600、900、1200、1500 mg/kg 和 1800 mg/kg黃芪多糖的飼料后，每隔18 d檢測半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，以檢測半滑舌鰨鰓黏液對黃芪多糖的免疫應答及較佳劑量。90 d的免疫結果顯示，半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶、過氧化物酶和堿性磷酸酶活性先增強后降低；半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性對低劑量(300～600 mg/kg)和中高劑量(1200～1800 mg/kg)黃芪多糖的免疫應答，隨試驗時間延長，分別呈增強及先增強后減弱的變化趨勢。試驗結束時，中低劑量(600～900 mg/kg)黃芪多糖組半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性均極顯著高于對照組(P< 0.01)。從成本、高非特異免疫活性的角度看，半滑舌鰨配合餌料中黃芪多糖較佳添加劑量為600 mg/kg。

黃芪多糖；溶菌酶；過氧化物酶；堿性磷酸酶；酸性磷酸酶

半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)主要分布于我國的黃、渤海海域[1-2]，生長快、經(jīng)濟價值高，為名貴暖溫性底棲大型海水養(yǎng)殖魚類[3-4]。近年來，隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)?；图s化不斷提高，養(yǎng)殖病害日益嚴重，采用抗生素和其他化學藥物來控制時，濫用和誤用漁藥會污染和惡化環(huán)境，威脅了人類的健康和安全。尋求無公害漁藥和新型免疫增強劑已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究熱點。中草藥為“綠色漁藥”，具有來源廣泛、價廉效優(yōu)、無毒副作用等優(yōu)點。黃芪多糖是從來源豐富的黃芪根部分離出的多糖組分，具有廣泛的免疫增強和抗病毒作用，可作為一種新型的免疫增強劑，已在畜禽中廣泛應用[5]，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用還較少。本試驗在半滑舌鰨基礎餌料中分別添加6個不同水平的黃芪多糖，分析了其鰓黏液中溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，探討了黃芪多糖對半滑舌鰨鰓黏液免疫力的作用效果，為黃芪多糖在半滑舌鰨養(yǎng)殖中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

半滑舌鰨體質(zhì)量(5.8±1.5) g，來源于福建省東山縣水產(chǎn)養(yǎng)殖場。

1.2 方法

采用單因素6水平3重復的試驗方法。第1組為對照組，其他6組為試驗組，各試驗組設3個重復，每個重復15尾魚。養(yǎng)殖于循環(huán)水過濾系統(tǒng)控制的養(yǎng)殖桶中，每桶容積為1.14 m3，控制養(yǎng)殖水體約1 m3，養(yǎng)殖密度為15尾魚/m3，鹽度為28±1。使用加熱棒控制水體溫度為(25±1) ℃，溶解氧>5 mg/L。暫養(yǎng)期間投喂基礎餌料；免疫試驗期間，對照組投喂基礎餌料，試驗組投喂免疫餌料。每日于18:00和22:00投喂，1 h后吸掉殘餌。

基礎飼料配方見表1。先將魚粉、沙蠶粉、豆粉、淀粉、礦物鹽、酵母粉和預混料等粉狀成分按所需用量混合均勻，再將攪碎的牡蠣肉、魚油與粉狀料混勻，制粒備用。在基礎餌料中，添加不同劑量(300、600、900、1200、1500 mg/kg和1800 mg/kg)的黃芪多糖，配制成6種試驗飼料。免疫試驗后，每隔18 d檢測1次，半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性，試驗周期為90 d，共測5次。

試驗飼料配方見表2。將基礎飼料制成粉狀后，與黃芪多糖及面粉混勻，之后將血紅蟲、雞蛋和水用豆?jié){機打碎混勻，最后將上述粉料和液料混合均勻，至飼料用手揉起可成團狀且不撒為宜。用制粒機將調(diào)和好的試驗飼料制成2號顆粒，于烘箱中40 ℃烘干備用。

表1 試驗用基礎飼料配方(每100 g含量)

表2 試驗飼料的配方(每100 g含量)

注：對照組投喂基礎餌料，1～6組投喂試驗飼料.

1.3 鰓黏液的采集方法

將魚鰓取出，用清洗干凈并消毒后的干紗布將其上的水及血吸干，之后將其置入10 mL玻璃離心管中加入5 mL蒸餾水，超聲震蕩20 min，取出魚鰓，保留含有黏液的溶液備用。

1.4 鰓黏液免疫相關酶活性的測定

1.4.1 溶菌酶活性的測定

溶菌酶活性參照劉金海等[6]方法測定。把一支CGMCC編號為1.0634的溶壁微球菌凍干粉從冰箱中取出并消毒。用移液槍吸取0.3～0.5 mL適宜的液體培養(yǎng)基滴入安瓿管中，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解成懸濁液，吸取全部菌體懸濁液，接種于3支試管斜面培養(yǎng)基上，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。再以活化細菌為菌種，進行擴大培養(yǎng)，以后每3 d重新接種一次，確保菌種處于增長期狀態(tài)，試驗前24 h，再培養(yǎng)試用菌。

溶壁微球菌培養(yǎng)使用002營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基。

1.4.2 過氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的測定

3種酶活性參照南京建成生物技術研究所提供的試劑盒和方法進行測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性對黃芪多糖的免疫應答

隨試驗時間延長，半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性呈先增后減的變化趨勢(表3)。18～72 d，試驗組半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶的活性均極顯著高于對照組(P<0.01)。試驗結束時，添加黃芪多糖300～900 mg/kg試驗組半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性均極顯著高于對照組(P<0.01)，添加黃芪多糖1500～1800 mg/kg試驗組魚鰓黏液溶菌酶活性顯著低于對照組(P<0.05)，添加黃芪多糖1200 mg/kg試驗組與對照組無顯著差異(P>0.05)。半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性隨黃芪多糖添加劑量增高，較早達到較高水平，之后便逐漸下降。試驗結束時,600 mg/kg試驗組的作用效果最好。

2.2 半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性對黃芪多糖的免疫應答

隨著試驗時間延長，半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性呈先增后減的變化趨勢，18 d后，半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性均極顯著或顯著高于對照組(P<0.01或P<0.05)(表4)。試驗中半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性隨黃芪多糖添加劑量增高，較早達到較高水平，之后便逐漸下降。試驗結束時，各試驗組半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性均極顯著或顯著高于對照組(P<0.01或P<0.05)，尤以添加黃芪多糖600 mg/kg試驗組的作用效果最好。

表3 試驗不同時間各組半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性 IU

注：同列中2個小寫字母相同的平均值間差異不顯著，1個不同差異顯著，2個都不同差異極顯著。同行中2個大寫字母相同的平均值間差異不顯著，1個不同差異顯著，2個都不同差異極顯著.下同.

表4 試驗不同時間各組半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性 IU

2.3 半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性對黃芪多糖的免疫應答

除300 mg/kg試驗組外，各試驗組半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性，隨時間延長均呈先增后減的變化趨勢；隨黃芪多糖添加劑量增高，半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性較早達到較高水平，之后便逐漸下降。試驗結束時，300～1500 mg/kg試驗組半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性均顯著高于對照組(P<0.05)，其中，尤以600 mg/kg試驗組作用效果較好，1800 mg/kg試驗組半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性與對照組無顯著差異(P>0.05)。

2.4 半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性對黃芪多糖的免疫應答

300～600 mg/kg試驗組半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性，隨時間延長逐漸增強，36 d后極顯著高于對照組(P<0.01)；其余各組半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性，隨時間延長呈先增后減趨勢(表6)。試驗中半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性隨黃芪多糖添加劑量增高，較早達到較高水平，隨后逐漸降低。試驗結束時，各試驗組半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性均極顯著高于對照組(P<0.01)；尤以900 mg/kg試驗組作用效果較好。

表5 不同試驗時間各組半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性 IU

表6 不同試驗時間各組半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性 IU

3 討 論

3.1 黃芪多糖對半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性的影響

溶菌酶是吞噬細胞殺菌的物質(zhì)基礎，是動物機體許多組織重要的非特異性免疫因子和衡量非特異性免疫力的重要指標。李義等[7]在基礎飼料中添加黃芪、黨參、大黃等中草藥制成的藥餌，顯著提了羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)血細胞吞噬活性、血清溶菌酶活力及酚氧化酶活力。袁呂江等[8]發(fā)現(xiàn)，魚腥草素同系物能夠提高小鼠血清溶菌酶活力，且隨濃度增加增幅加大；體外試驗發(fā)現(xiàn)，低濃度的魚腥草素同系物可以明顯提高溶菌酶的活性，隨添加劑量的增加而抑制溶菌酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)，600 mg/kg試驗組和900 mg/kg試驗組半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性均在54 d時達最大值，極顯著高于對照組(P<0.01)，之后雖降低，但仍極顯著高于對照組(P<0.01)；試驗結束時，黃芪多糖對半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性的影響表現(xiàn)為300～900 mg/kg試驗組極顯著高于對照組(P<0.01)，1200 mg/kg試驗組與對照組無顯著差異(P>0.05)，1500～1800 mg/kg試驗組則顯著低于對照組(P<0.05)。這與李義等[7-8]的試驗結果基本一致。

3.2 黃芪多糖對半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶普遍存在于真核生物的各類細胞中，與生物的非特異免疫功能水平有一定程度的關聯(lián)。趙娜等[9]發(fā)現(xiàn)，牙鲆(Paralichthysolivaceus)經(jīng)海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)3種免疫原免疫42 d后，血清中過氧化物酶活力先升高，第28 d起開始下降。顧華杰等[10]研究表明，灰樹花多糖使吉富羅非魚(GIFT,Oreochromisniloticus)血清和肝臟中過氧化物酶活性顯著提高，且表現(xiàn)出明顯的劑量效應，其促進作用隨時間延長逐漸減弱。本研究與趙娜等[9-10]的研究結果相一致，即半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性先升高后逐漸降低，但各試驗組過氧化物酶活性均顯著或極顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01)。

3.3 黃芪多糖對半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性的影響

堿性磷酸酶廣泛分布于人體及動物體的肝臟、骨骼、腸、腎等組織，經(jīng)肝臟向膽外排出。這種酶與人及動物的免疫有關。王維新[11]對仿刺參(Apostichopusjaponicus)內(nèi)臟組織的免疫酶活性進行了24 d的研究表明，仿刺參內(nèi)臟組織堿性磷酸酶活性在第14 d時達到最高，隨后逐漸降低。松浦鏡鯉(Cyprinusspecularis)幼魚血清堿性磷酸酶活性隨飼料中維生素D3添加量的增加而先升后降，飼料中維生素D3達800 IU/kg時，堿性磷酸酶活性最高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性隨試驗時間延長呈現(xiàn)先增后降的變化趨勢，試驗結束時，除1800 mg/kg組外，各試驗組半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性均顯著高于對照組(P<0.05)。但黃芪多糖添加劑量越高，半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性達到最大值的時間越短，隨著試驗時間的延長，堿性磷酸酶活性變化與黃芪多糖添加劑量無明顯相關。

3.4 黃芪多糖對半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性的影響

酸性磷酸酶主要存在于動物的巨噬細胞，定位于溶酶體內(nèi)，是一種在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無機磷酸的水解酶。水產(chǎn)動物酸性磷酸酶的理化性質(zhì)、結構、功能及催化機理已作了大量的研究[13]。如草魚(Ctenopharyngodonidellus)血清酸性磷酸酶活性隨飼料中牛膝多糖添加劑量的增加而增加，至0.20%后，則呈緩慢下降[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低劑量黃芪多糖(300～600 mg/kg)作用下，半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性隨時間延長而逐步增強；在中高劑量黃芪多糖(900～1200 mg/kg、1500～1800 mg/kg)作用下，則呈先增后減的變化趨勢；試驗結束時，各試驗組半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性均極顯著高于對照組(P<0.01)。這與王紅權等[14]研究高劑量的牛膝多糖使草魚血清酸性磷酸酶活性下降但不抑制其活性的結果相一致。

4 小 結

(1)低劑量的黃芪多糖使半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性逐漸增強，對溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶活性具有先增強后抑制的作用；中高劑量的黃芪多糖對溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性均具有先增強后抑制的作用。

(2)半滑舌鰨鰓黏液中溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶活性對黃芪多糖的應答時序有所不同，第18 d時，1500 mg/kg試驗組半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶的活性升至最高，之后降低；36 d時，900 mg/kg試驗組半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶和過氧化物酶活性達到最強，隨后降低；至72 d時，900 mg/kg試驗組半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性最強，隨后降低；

(3)從成本及提高半滑舌鰨鰓黏液免疫活性的角度出發(fā)，建議在飼料中添加 600 mg/kg 黃芪多糖較佳。

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ImmuneResponseofActivityofEnzymesRelatedtoImmunitytoAstragalusPolysaccharidesinGillMucusofSemi-smoothSoleCynoglossussemilaevis

LIU Jinhai1,2,3,LUO Xiaoli1, GUAN Jian1, HUANG Hui1,CHEN Heng1

( 1.Fisheries College，Jimei University, Xiamen 361021, China；2. Aquatic Biotechnology Research Institute，Jimei University, Xiamen 361021, China；3. Engineering Research Center of the Modern Industry Technology for Eel, Ministry of Education, Xiamen 361021, China )

Juvenile semi-smooth sole (Cynoglossussemilaevis) with body weight of (5.8±1.5) g was fed basic diet supplemented with astragalus polysaccharides (APS) at a dose of 0, 300, 600, 900, 1200, 1500 and 1800 mg/kg diet with triplication at water temperature of 25 ℃ for 90 d, and the activities of lysozyme (LSZ), peroxidase (POD), alkaline phosphatase (AKP) and acid phosphatase (ACP) in the gill mucus were detected in the sole fed the diets containing various doses of APS in a 18 day interval to investigate the immune response of activities of LSZ, POD, AKP and ACP in the gill mucus to APS and further explore the optimal dietary dose of APS. The activities of LSZ, POD and AKP were found to be first increased and then decreased in the gill mucus. The activity of ACP was shown to be elevated with elapse of APS immunity in the low dose of APS groups (300—600 mg/kg), and to be increased first and then decreased in the middle and high levels of APS groups (1200—1800 mg/kg). At the end of the experiment, there were very significantly higher activities of LSZ, POD, AKP and ACP in the gill mucus in the low and middle dose APS groups (600—900 mg/kg) than those in the control group (P<0.01). It is recommended that the optimal dietary dose of APS be 600 mg/kg diet for semi-smooth sole juveniles based on feed cost and immune efficiency.

astragalus polysaccharide; lysozyme; peroxidase; alkaline phosphatase; acid phosphatase

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.02.003

S942.1

A

1003-1111(2016)02-0111-06

2015-03-25；

2015-10-15.

福建省自然科學基金資助項目(2012J01138).

劉金海(1965-)，男，副教授；研究方向：魚類營養(yǎng)和免疫.E-mail：hnd530@126.com.