許友卿，高 巍，劉富娟，丁兆坤

( 廣西大學 水產(chǎn)科學研究所，廣西高校水生生物健康養(yǎng)殖與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，廣西大學 動物科學科技學院，廣西 南寧 530004 )

殼寡糖添加量對青魚幼魚血清特定生化指標、肝和腸白介素IL-2、IL-8和IL-10 mRNA表達量的影響

許友卿，高 巍，劉富娟，丁兆坤

( 廣西大學 水產(chǎn)科學研究所，廣西高校水生生物健康養(yǎng)殖與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，廣西大學 動物科學科技學院，廣西 南寧 530004 )

將30日齡、體質(zhì)量約4.7 g的青魚放養(yǎng)在12個網(wǎng)箱中，每箱40尾，分別投喂添加0(對照組)、0.3%、0.6%和1.2%殼寡糖的飼料50 d，每種飼料3個重復，研究殼寡糖添加量對青魚血清特定生化指標、肝和腸白介素-2(IL-2)、白介素-8(IL-8)和白介素-10(IL-10 ) mRNA表達量的影響。試驗結(jié)果顯示，與對照組比較，0.3%殼寡糖組青魚血清乳酸脫氫酶的活性顯著降低(P<0.05)，0.6%殼寡糖組青魚血清甘油三酯、葡萄糖的含量和乳酸脫氫酶的活性顯著降低(P<0.05)，0.3%組的肝IL-2和IL-10的表達量顯著提高(P<0.05)，0.6%殼寡糖組的肝IL-2和IL-8的表達量顯著提高(P<0.05)。試驗結(jié)果表明，在飼料中添加殼寡糖能促進青魚幼魚肝和腸白介素的表達，增強免疫力，降低血糖血脂含量，其中以添加0.6%殼寡糖的效果最佳。

殼寡糖；白介素；表達；幼魚；青魚

白介素(全稱白細胞介素，Interleukin, IL)是指在白細胞或免疫細胞間相互作用的淋巴因子，由淋巴細胞、巨噬細胞等產(chǎn)生，能刺激T、B淋巴細胞及其他參與免疫反應(yīng)的細胞增殖、分化，提高其功能。白介素和血細胞生長因子同屬細胞因子。兩者相互協(xié)調(diào)，相互作用，共同完成造血和免疫調(diào)節(jié)功能。白介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細胞，介導T、B細胞活化、增殖與分化及炎癥反應(yīng)中起重要作用。至1994年已發(fā)現(xiàn)了15種白介素，其中IL-2、IL-8和IL-10是主要成員，發(fā)揮重要的生理作用[1-2]。研究表明，血清中的酶、糖、脂肪等水平與機體健康和功能密切相關(guān)。

殼寡糖可以促進動物生長、提高免疫力、降血脂、抗菌、抗炎和抗癌等[3-5]。在飼料中添加適量殼寡糖可以顯著提高吉富羅非魚(GIFT，Oreochromisniloticus)幼魚的生長速度和抗嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)感染的能力[6]。殼寡糖添加劑可以不同程度地提高三疣梭子蟹 (Portunustrituberculatus)血淋巴的過氧化物酶活性等[7]。用殼寡糖添加劑飼喂的肉雞血液中免疫球蛋白數(shù)量增加，提高了肉雞的免疫力[8]。殼寡糖還能降血糖，且無毒副作用，是一種無污染、無殘留的飼料添加劑[9]。但是，少見殼寡糖對青魚(Mylopharyngodonpiceus)幼魚作用的研究。

本試驗研究了在飼料中添加殼寡糖對青魚幼魚血清乳酸脫氫酶活性、甘油三酯和葡萄糖含量及肝和腸IL-2、IL-8和IL-10 mRNA表達的影響，以其為青魚健康養(yǎng)殖提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚是湖南農(nóng)業(yè)大學培育的23日齡青魚稚魚800尾，用基礎(chǔ)飼料馴化投喂1周后，挑選機體健康、規(guī)格一致的30 日齡、體質(zhì)量約4.7 g的魚560尾，隨機取其中80尾作0周樣品，其余隨機分為4組，每組3個重復，放入12個正方體1 m×1 m×1 m網(wǎng)箱，每箱40尾。

不加殼寡糖，僅為基礎(chǔ)飼料的為對照飼料；試驗飼料是基礎(chǔ)飼料分別添加0.3%、0.6%和1.2%殼寡糖(表1)。殼寡糖購自大連中科格萊克生物科技有限公司，平均分子量小于1000，聚合度2～7，顆粒度≥100目，水分少于10%，灰分少于1%，pH 5.5～7.0。

粉碎和混勻的原料經(jīng)60目過篩后，用小型商用制粒機制成粒徑1.5 mm、長約2 cm的柱狀顆粒，60 °C烘干密封備用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(以干飼料計算)

注：預混料(mg/kg)：氯化鉀，200 mg；碘化鉀(1%)，60 mg；六水氯化鈷(1%)，50 mg；五水硫酸銅，30 mg；一水硫酸亞鐵，400 mg；一水硫酸鋅，400 mg；一水硫酸錳，150 mg；五水亞硒酸納(1%)，65 mg；一水硫酸鎂，2000 mg；沸石粉，3645.85 mg；維生素B1，12 mg；核黃素，12 mg；維生素B6(鹽酸吡哆醇)，8 mg；維生素B12，0.05 mg；維生素K3，8 mg；肌醇，100 mg；泛酸鈣(維生素B3)，40 mg；煙酸，50 mg；葉酸，5 mg；生物素，0.8 mg；維生素A，25 mg；維生素D3，5 mg；乙氧基喹啉，150 mg；小麥粉，2584.15 mg.

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗用水庫水，pH 7.2～7.5，溶氧量>5 mg/L。每日9:00、15:00各投喂一次，日投喂量為魚體總質(zhì)量的3%，飼養(yǎng)50 d。

1.3 測定項目與方法

試驗結(jié)束時，每個網(wǎng)箱隨機取8尾魚，用1∶13 000的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉，分別從尾靜脈采血，血液于室溫靜止4 h后，用3800 g低溫離心12 min，分別取血清裝于PC樣品瓶中，標記牢固，用液氮速凍后，移存于-80 °C中作測定用。將取血后的青魚腸、肝臟取出，用0.65%的生理鹽水清洗干凈，用錫箔紙包好，標記牢固，用液氮速凍，移存于-80 °C待測定。

血清甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、葡萄糖、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶等生化指標，用南京建成生物工程研究所制備的試劑盒和全自動生化分析儀(深圳邁瑞B(yǎng)S-190全自動生化分析儀)測定。

肝臟和腸免疫因子IL-2、IL-8和IL-10 mRNA的表達量用下述方法測定：先用Trizol試劑(Invitrogen, CA, USA)提取樣品中的總RNA，用TAKARA試劑盒反轉(zhuǎn)錄，用SYBR-Green Ⅰ染料法，用Thermo試劑盒進行實時熒光定量(RTQ-PCR)，所使用的TRQ-PCR儀為ABI熒光定量PCR儀(9700系統(tǒng))。

引物設(shè)計：用Primer Premier 5.0(Premier Biosoft International, Palo Alto, CA)設(shè)計引物，由上海生工生物公司合成。目的基因及內(nèi)參基因見表2。

表2 免疫相關(guān)基因的引物設(shè)計

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0單因素Duncan法分析，以平均值±標準差表示，差異顯著表示為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 殼寡糖的添加量對青魚幼魚血清生化特定指標的影響

添加0.6%殼寡糖組魚血清甘油三酯含量[(1.76±0.05) mmol/L]顯著低于對照組[(1.97±0.10) mmol/L](P<0.05)，添加0.3%、1.2%殼寡糖組魚血清甘油三酯含量[(1.87±0.01 ) mmol/L和(1.84±0.04) mmol/L]與對照組差異不顯著(P>0.05)；添加0.6%殼寡糖組魚血清葡萄糖含量[(6.08±0.22) mmol/L]顯著低于對照組[(7.67 ± 0.33 ) mmol/L](P<0.05)，添加0.3%、1.2%殼寡糖組魚血清葡萄糖含量[分別為(6.98 ± 0.44) mmol/L和(6.78±0.13 ) mmol/L]與對照組差異不顯著(P>0.05)；添加0.3%和0.6%殼寡糖組魚血清乳酸脫氫酶[分別為(536.80±13.84) U/L和(412.10±21.79 ) U/L]顯著低于對照組[(715.23±80.88) U/L](P<0.05)，但1.2%殼寡糖組魚血清乳酸脫氫酶[(689.17±10.98 ) U/L]與對照組差異不顯著(P>0.05)；添加不同劑量的殼寡糖，對青魚幼魚總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的影響均不顯著(P>0.05)(表3)。

表3 殼寡糖添加量對青魚幼魚血清特定生化指標的影響

注：上述所有數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標準差(n = 3×3). 同行數(shù)據(jù)上標不同字母者表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P< 0.05).

2.2 殼寡糖的添加量對青魚幼魚腸和肝IL-2、IL-8和IL-10 mRNA表達量的影響

添加0.6%殼寡糖組魚肝IL-2 mRNA的表達量顯著高于對照組和添加0.3%、1.2%殼寡糖組(P<0.05)，添加0.3%和0.6%殼寡糖組魚肝IL-2 mRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.05)，但添加1.2%殼寡糖組魚肝IL-2 mRNA的表達量與對照組差異不顯著(P>0.05)；添加0.6%殼寡糖組魚腸IL-2 mRNA的表達量顯著高于1.2%殼寡糖組(P<0.05)，但與0.3%組差異不顯著(P>0.05)，添加0.6%殼寡糖組魚腸IL-2 mRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.05)，但添加0.3%、1.2%殼寡糖組魚腸IL-2 mRNA的表達量與對照組差異不顯著(P>0.05)(圖1)。

添加0.6%殼寡糖組魚肝IL-8 mRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.05)，添加0.3%、1.2%殼寡糖組魚肝IL-8 mRNA的表達量與對照組差異不顯著(P>0.05)，且添加0.6%殼寡糖組魚肝IL-8 mRNA的表達量顯著高于0.3%殼寡糖組(P<0.05)；各組魚腸IL-8 mRNA的表達量彼此差異不顯著(P>0.05)(圖1)。

添加0.3%殼寡糖組魚肝IL-10 mRNA的表達量顯著高于添加0.6%、1.2%殼寡糖組(P<0.05)，添加0.3%殼寡糖組魚肝IL-10 mRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.05)，但添加0.6%、1.2%殼寡糖魚肝IL-10 mRNA的表達量與對照組差異不顯著(P>0.05)；添加0.6%殼寡糖組魚腸IL-10 mRNA的表達量顯著高于對照組、添加0.3%和1.2%組(P<0.05)(圖1)。

對照組 0.3%殼寡糖組 0.6%殼寡糖組 1.2%殼寡糖組

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，0.6%殼寡糖添加劑能顯著促進青魚幼魚肝和腸IL-2、IL-8和IL-10 m RNA的表達。筆者認為，促炎癥因子IL-2、IL-8和抗炎癥因子IL-10的表達同時提高，可有效提升機體的抗炎水平，并不會對機體產(chǎn)生不利因素，其理由是：IL-2是T細胞生長因子，可促進T細胞免疫反應(yīng)，能活化T細胞和巨噬細胞的表達[10]，促進多種細胞反應(yīng)，促進淋巴因子激活的殺傷細胞分化和分泌免疫球蛋白(Ig)[11]。IL-8是典型的促炎癥因子，也是一種重要的趨化因子，還有很強的促血管生成作用。IL-8調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，對感染組織有一定的恢復作用[12]。IL-10具有抗炎、抗腫瘤作用[13-14]，參與炎癥反應(yīng)并能緩解炎癥，對機體具有保護作用，在硬骨魚中具有免疫調(diào)節(jié)作用[15]。IL-10 mRNA的表達增加可抑制炎癥反應(yīng)，緩解炎癥疾病，有助于治療炎癥[15-16]。

本研究表明，添加0.3%和0.6%的殼寡糖顯著降低了青魚幼魚血清中乳酸脫氫酶的活性。該酶活性的降低有利于保護青魚機體組織，維持乳酸脫氫酶平衡。用中藥降低球蟲感染雛雞血清乳酸脫氫酶活性，具有保護腸道黏膜，降低其受損程度的作用[17]。

研究表明，飼料中添加0.6%的殼寡糖能顯著降低青魚幼魚血清中甘油三酯的含量。血清甘油三酯降低使血脂減少，有益于心血管健康和發(fā)揮生理功能。試驗結(jié)果與孫立威等[6，18]研究結(jié)果一致，孫立威等[6]在日糧中添加適量的殼寡糖可以顯著降低吉富羅非魚幼魚血清中總膽固醇和低密度脂蛋白水平。劉含亮等[18]在飼料中添加殼寡糖顯著降低了虹鱒(Oncorhynchusmykiss)血清甘油三酯和膽固醇等含量(P> 0.05)。

[1] Rose-John S, Scheller J, Schaper F. “Family reunion”-a structured view on the composition of the receptor complexes of interleukin-6-type and interleukin-12-type cytokines[J]. Cytokine and Growth Factor Reviews, 2015, 26(5):471-474.

[2] Conlon K C, Lugli E, Welles H C, et al. Redistribution, hyperproliferation, activation of natural killer cells and CD8 T cells, and cytokine production during first-in-human clinical trial of recombinant human interleukin-15 in patients with cancer[J]. Journal of Clinical Oncology, 2015，33(1):74-82.

[3] Liu X, Xia W, Jiang Q, et al. Effect of kojic acid-grafted-chitosan oligosaccharides as a novel antibacterial agent on cell membrane of gram-positive and gram- negative bacteria [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2015, 120(3):335-339.

[4] Azuma K, Osaki T, Minami S, et al. Anticancer and anti-inflammatory properties of chitin and chitosan oligosaccharides [J]. Journal of Functional Biomaterials, 2015, 6(1):33-49.

[5] Tang Z R, Yin Y L,Nyachoti C M, et al. Effect of dietary supplementation of chitosan and galacto-mannan-oligosaccharide on serum parameters and the insulin-like growth factor-I mRNA expression in early-weaned piglets[J]. Domestic Animal Endocrinology, 2005, 28(4):430-441.

[6] 孫立威，文華，蔣明，等. 殼寡糖對吉富羅非魚幼魚生長性能、非特異性免疫及血液學指標的影響[J]. 廣東海洋大學學報，2011, 31(3):43-49.

[7] 李振達，陳小娥，廖智，等. 殼寡糖對三疣梭子蟹免疫力的影響[J]. 浙江海洋學院學報:自然科學版，2011, 30(1): 27-32.

[8] Huang R L, Deng Z Y, Yang C B, et al. Dietary oligochitosan supplementation enhances immune status of broilers[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2007, 87(1):153-159.

[9] Katiyar D, Singh B, Lall A M, et al. Efficacy of chitooligosaccharides for the management of diabetes in alloxan induced mice: a correlative study with antihyperlipidemic and antioxidative activity[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2011, 44(4): 534-543.

[10] Dooms H, Abbas A K. Revisiting the role of IL-2 in autoimmunity [J]. European Journal of Immunology, 2010, 40(6):1538-1540.

[11] Wang D, Li X, Xu L, et al. Immunologic synergism with IL-2 and effects of cCHMIs on mRNA expression of IL-2 and IFN-γ in chicken peripheral T lymphocyte[J]. Vaccine, 2006, 24(49):7109-7114.

[12] Rahimkhani M, Mordadi A, Varmazyar S, et al. Evaluation of urinary interleukin-8 levels in patients with spinal cord injury[J]. Recent Patents on Anti-infective Drug Discovery, 2014，9(2)：144-149.

[13] Shen K F, Zhu H Q, Wei X H, et al. Interleukin-10 down-regulates voltage gated sodium channels in rat dorsal root ganglion neurons[J]. Experimental Neurology, 2013，247(3):466-475.

[14] Zhang J, Zhou Z, Wang C, et al. Reduced tumorigenesis of EG7 after interleukin-10 gene transfer and enhanced efficacy in combination with intratumorally injection of adenovirus-mediated lymphotactin and the underlying mechanism[J]. Cancer Immunology, Immunotherapy, 2011, 60(4):559-573.

[15] Wei H, Yang M, Zhao T, et al. Functional expression and characterization of grass carp IL-10: an essential mediator of TGF-β1 immune regulation in peripheral blood lymphocytes[J]. Molecular Immunology, 2013, 53(4):313-320.

[16] da Silva L M, Quintans-Júnior L J, de Santana W A, et al. Anti-inflammatory effects of carvacrol: evidence for a key role of interleukin-10[J]. European Journal of Pharmacology, 2013, 699(1):112-117.

[17] 李佩國，賈清輝，李蘊玉，等. 中藥對球蟲感染雛雞血清乳酸脫氫酶和堿性磷酸酶活性的影響[J]. 河北科技師范學院學報，2007, 21(1):1-3.

[18] 劉含亮，孫敏，王紅衛(wèi)，等. 殼寡糖對虹鱒生長性能、血清生化指標及非特異性免疫功能的影響[J]. 動物營養(yǎng)學報，2012，24 (3):479-483.

EffectofChito-oligosaccharideonSerumBiochemicalIndicesandExpressionofIL-2,IL-8andIL-10mRNAinJuvenileBlackCarpMylopharyngodonpiceus

XU Youqing, GAO Wei, LIU Fujuan, DING Zhaokun

( Key Laboratory for Aquaculture and Nutritional Control of Living Organism in Guangxi High Education, Institute for Fishery Sciences, Faculty of Animal Sciences and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China )

A total of 560 30 day old black carp (Mylopharyngodonpiceus) juveniles with body weight of about 4.7 g acclimatized for 1 week were reared in 12 net cages each of 1 m×1 m×1 m at a rate of 40 fish per cage and fed 4 diets containing 0 (control group), 0.3%, 0.6% and 1.2% of chito-oligosaccharide twice a day at a rate of 3% of total fish body weight with triplication for 50 days to study the effects of chito-oligosaccharide on specific biochemical indices in the serum and the expression of IL-2, IL-8 and IL-10 mRNA in hepatopancreas and intestine of the juvenile. The lactate dehydrogenase activity was found to be decreased significantly in the fish fed 0.3% chito-oligosaccharide(P<0.05). The levels of triglycerides and glucose and activity of lactate dehydrogenase were found to be significantly reduced in the fish fed 0.6% chito-oligosaccharide (P<0.05). The expression of IL-2 and IL-10 mRNA was found to be increased significantly in the hepatopancreas of the fish fed 0.3% chito-oligosaccaride(P<0.05). The expression of IL-2 and IL-8 mRNA was found to be increased significantly in the hepatopancreas of the fish fed 0.6% chito-oligosaccharide(P<0.05). The expression of IL-2 and IL-10 mRNA was found to be increased significantly in the intestine of the fish fed 0.6% chito-oligosaccharide(P< 0.05). It is concluded that chito-oligosaccharide supplementation significantly decreases blood glucose and lipid levels, and significantly promotes the expression of interleukin in the hepatopancreas and intestine of juvenile black carp. It is suggested that the optimal dietary supplementation of chito-oligosaccharide be 0.6%.

chito-oligosaccharide; interleukin; expression; juvenile;Mylopharyngodonpiceus

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.02.011

S963.73

A

1003-1111(2016)02-0157-05

2015-08-28；

2015-10-26.

國家自然科學基金資助項目(31360639); 廣西壯族自治區(qū)生物學博士點建設(shè)項目(P11900116, P11900117); 廣西自然科學基金資助項目(2012GXNSFAA053182, 2013GXNSFAA019274, 2014GXNSFAA118286, 2014GXNSFAA118292); 廣西科技項目(1298007-3).

許友卿(1958-)，女, 教授, 博士生導師；研究方向：環(huán)境生物學、水生動物營養(yǎng)、生理、生化和分子生物學. E-mail: youqing.xu@hotmail.com. 通訊作者: 丁兆坤(1956-)，男，教授, 博士生導師；研究方向：環(huán)境生物學、水生動物營養(yǎng)、生理、生化和分子生物學. E-mail: zhaokun.ding@hotmail.com.