黃杰濤,張蓮姬

(延邊大學理學院,吉林延吉 133000)

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響應面法優(yōu)化金花葵多糖提取工藝

黃杰濤,張蓮姬*

(延邊大學理學院,吉林延吉 133000)

以金花葵的莖葉為原料,用水提法對其多糖成分進行提取,研究不同提取條件對金花葵多糖得率的影響。本研究以金花葵多糖的得率為考察指標,對提取溫度、提取時間、料液比進行單因素實驗的基礎上,再利用響應面法優(yōu)化金花葵多糖的提取條件。結果表明,金花葵多糖的最佳提取工藝條件為提取溫度72 ℃、提取時間3.25 h、料液比1∶32(g∶mL)。金花葵多糖得率的驗證值,與預測值的相對誤差為0.23%,說明采用響應面法對金花葵多糖提取條件進行優(yōu)化可行合理。

金花葵,多糖,響應面法,提取

金花葵(AureaHELIANTHUS)為錦葵科、秋葵屬1年生草本植物,是在200多種秋葵植物中最具食用、藥用、保健價值,目前野生金花葵是近瀕臨絕種。在太行山東部山麓地區(qū)及晉中、晉南地區(qū)、東北地區(qū)有很多金花葵人工種植基地,其資源很豐富[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)金花葵的花、莖、葉、種子中都含有豐富的生物活性物質,如黃酮、金絲桃苷、不飽和脂肪酸、葉黃素等,具有抑制腫瘤細胞、鎮(zhèn)痛、解熱抗炎、調(diào)節(jié)血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、保肝、抗氧化等多種生物活性[2-3]。

多糖具有多種生物活性,包括免疫調(diào)節(jié)[4]、抗腫瘤[5]、降血糖[6]、降血脂[7]、抗輻射[8]、抗菌抗病毒[9]等。目前已有很多關于植物多糖提取的文獻,然而關于金花葵多糖提取的探究尚未見報道。

多糖提取工藝有水提法、酶提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超高壓提取法、膜分離技術等,其中水提法操作簡單,為最傳統(tǒng)的提取法[10]。

響應面法(response surface methodology)可以通過二次擬合出多個因素與響應值的函數(shù)關系,使之得出一個回歸方程來探求最優(yōu)的提取條件,是一種優(yōu)化得出最合理條件的統(tǒng)計方法[11-14]。本課題通過響應面法,依據(jù)其中Box-Benhnken的中心組合的方法原理,并根據(jù)單因素的實驗結果,對金花葵熱水提取多糖工藝進行優(yōu)化,確定最優(yōu)提取工藝,對金花葵多糖的進一步深化研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金花葵 2015年8月采集于吉林省延吉市人工種植基地,曬干后用粉碎機粉碎過60目篩,得到金花葵粉末;石油醚、無水乙醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖 分析純。

T6新世紀紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋、80-2臺式離心機 金壇市科析儀器有限公司;RE-52旋轉蒸發(fā)儀 上海青埔滬西儀器廠;DGF-4A型立式電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯儀器有限公司;CP114電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金花葵多糖提取工藝 金花葵粉末→石油醚脫脂→無水乙醇去黃酮→熱水提取→離心→上清液→濃縮→醇沉→離心→沉淀去乙醇→60 ℃烘干→金花葵粗多糖

1.2.2 標準曲線的繪制 參見文獻[15-16]。

1.2.3 多糖提取率的測定 將得到的金花葵粗多糖用去離子水定容至100 mL,從中再取5 mL定容至50 mL容量瓶中,獲得樣品溶液。吸取樣品溶液1 mL,采用苯酚-硫酸法,在490 nm處測定吸光度值,利用標準曲線方程計算樣品中多糖的含量[17-20]。多糖得率:

式中:C為測得的樣品溶液中葡萄糖濃度;D為樣品溶液稀釋倍數(shù);f為換算因子1.093;W為金花葵干粉質量。

1.3 單因素實驗

依次進行金花葵多糖的提取溫度、提取時間與料液比的單因素實驗,每個單因素實驗做出的最優(yōu)值作為下一組單因素的固定條件值,見表1。

表1 單因素實驗設計表

Table 1 Single factor experiment design

固定因素單因素變量提取時間2h料液比1∶30(g∶mL)提取溫度(℃)50 60 70 80 90提取溫度70℃料液比1∶30(g∶mL)提取時間(h)10 15 20 25 30 35 40提取溫度70℃提取時間3h料液比(g∶mL)20 30 40 50 60

1.4 響應面法優(yōu)化實驗設計

通過響應面法,依據(jù)其中Box-Benhnken的中心組合的方法原理,聯(lián)系單因素的實驗結果,以多糖得率為響應值(Y),采用Design-Expert 8.0.6軟件來對數(shù)據(jù)進行處理與回歸分析,選擇出最佳提取工藝。響應面實驗因素水平表見表2。

表2 響應面實驗因素水平表

Table 2 Factors levels used in response surface analysis

水平因素A提取溫度(℃)B提取時間(h)C料液比(g∶mL)-160251∶30070301∶40180351∶50

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 提取溫度的影響 由圖1可知,當提取溫度在50～70 ℃時,多糖得率隨溫度的升高而增加,其后得率反而下降,當溫度為70 ℃時得率最大。

圖1 提取溫度對多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide

探究其原因可能是因為溫度較低時,多糖得不到充分的提取,而過高的溫度,導致多糖分解,其得率下降[21],從而確定提取溫度為70 ℃。

2.1.2 提取時間影響 由圖2可知,隨著提取時間的增加,金花葵多糖溶液的提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在3 h時最大,確定最優(yōu)的提取時間為3 h。

圖2 提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of polysaccharide

2.1.3 料液比的影響 由圖3可知,在一定范圍內(nèi),可能是因為隨著水量的增加,溶解在水里的多糖也隨之增加,因此金花葵多糖提取率也增加。但增加到1∶40后,多糖得率呈現(xiàn)了下降的趨勢,從而確定了最優(yōu)料液比為1∶40。

圖3 料液比對多糖得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polysaccharide

2.2 響應面法實驗結果及分析

2.2.1 響應面法設計及結果 以金花葵多糖得率為響應值 Y,以提取溫度A,提取時間B,料液比C為自變量,來進行響應面法分析實驗,實驗的方案和結果見表3。

2.2.2 多元二次響應面回歸模型的建立和方差分析 表3的結果利用響應面法進行多元回歸擬合分析,軟件得出一個回歸方程:Y=4.17+0.16A+0.091B-0.083C-0.063AB-0.20AC-0.10BC-1.33A2-0.46B2+0.00175C2。

表4 回歸方程方差分析結果

Table 4 Analysis of variance table

方差來源平方和自由度均方F值Pr>F顯著性模型026900299367<00001??A0020100206561<00001??B001210012382700315?C1770E-00311770E-00357500576AB4422E-00314422E-003143600051??AC4970E-00314970E-003161400618BC1296E-00311296E-00342100793A2019101961265<00001??B2001510015482600402?C21839E-00311839E-00359700745殘差2155E-00373097E-004失擬項1828E-00333094E-004746005973?純誤差3268E-00448170E-005所有項02616

注:**為高度顯著(p<0.01),*為顯著(p<0.05)。模型的“Pr>F”=0.0001<0.01,所以該模型是高度顯著的。失擬項“Pr>F”=0.5973>0.05,說明選取這個模型是合理的,可以通過此模型來預測金花葵多糖最優(yōu)提取條件,見表4?；貧w方程中A、AB、A2對金花葵多糖得率影響高度顯著,B、B2對多糖得率影響是顯著,說明溫度和時間對于金花葵多糖得率影響明顯,并且兩者因素之間有相互作用的關系,說明幾個因素條件之間對于響應值的影響并不是簡單的線性關系。研究方程的變量系數(shù)值可看出,各個影響因素對多糖得率影響大小的關系是提取溫度>提取時間>料液比。

表3 Box-Behnken實驗設計及結果

Table 3 Experimental design and result for response surface analysis

實驗號因素A提取溫度(℃)B提取時間(h)C料液比(g∶mL)多糖得率(%)1-1-1022721-102503-11024041102385-10-1254610-13487-101262810127690-1-13441001-1400110-11363120113791300041714000412150004201600041417000424

2.3 響應面法分析因素間的相互作用

通過繪制響應面的三維圖與等高線圖,可形象的觀察出各因素之間的相互作用對響應值的影響作用,以此來確定最優(yōu)的提取條件。

圖4顯示,提取時間比較長,而且溫度比較低的情況下,多糖得率并不高。在一定的范圍內(nèi),研究發(fā)現(xiàn)當提取溫度接近于70 ℃,時間接近于3 h時,多糖得率高。通過上述分析得出,提取溫度的影響對于多糖得率是比較明顯的,隨著溫度過高,多糖的水解會增多,因此多糖得率下降。

圖4 提取溫度與時間對多糖得率的響應面圖Fig.4 Response surface plot of extraction temperature and time on the yield of polysaccharide

圖5顯示,由三維圖分析得出,在一定范圍內(nèi),多糖得率隨著提取溫度和料液比的增加而得以增加。但是當液料比增加到一定的上限之后,多糖得率卻開始下降?？赡苁怯捎诹弦罕缺容^大,使得多糖濃度的差值增大,細胞中的多糖利于游離出來,伴隨著溫度的上升,分子的擴散效果得以加快,因此多糖的浸出率增加,但由于料液比比較大,不能夠提高多糖的含量。

圖5 提取溫度與料液比對多糖得率的響應面圖Fig.5 Response surface plot of extraction temperature and solid-liquid ratio on the yield of polysaccharide

圖6顯示,由三維曲線和等值線圖可以看出,提取時間與料液比對多糖得率的影響較小。相應的表現(xiàn)為曲線較為平緩,當其數(shù)值增加或減少時,響應值并沒有發(fā)生顯著性的變化。

圖6 提取時間與料液比對多糖得率的響應面圖Fig.6 Response surface plot of extraction time and solid-liquid ratio on the yield of polysaccharide

2.4 驗證實驗

根據(jù)響應面法軟件進行參數(shù)的最優(yōu)化分析,得出提取率的優(yōu)化條件為提取溫度72.21 ℃、提取時間3.25 h、料液比1∶32.44 (g∶mL)。在此工藝條件下,理論上金花葵多糖得率為4.29%。為了驗證該法的可靠性以及可行性,用最佳的條件進行實驗。

考慮到實際操作的可行性與簡便性,將金花葵多糖的提取條件修正為提取溫度72 ℃、提取時間3.25 h、料液比1∶32 (g∶mL),結果得出金花葵多糖得率的實際值為4.30%,與理論值相對誤差為0.23%,非常接近。在單因素實驗中我們得到的多糖提取最優(yōu)值是2.94%,通過響應面法設計實驗,多糖提取率比優(yōu)化工藝前提高近1.5倍。因此,利用響應面分析法得到的金花葵多糖提取條件真實可靠,具有實用價值。

3 結論

本實驗通過先在單因素實驗的基礎之上,采用響應面法對金花葵多糖的提取工藝進行優(yōu)化,實驗的結果顯示出金花葵多糖的最優(yōu)提取條件是提取溫度72 ℃、提取時間3.25 h、料液比1∶32 (g∶mL),理論最佳多糖得率為4.29%,實際多糖得率為4.30%,與理論值相對誤差0.23%。實驗結果說明通過響應面法優(yōu)化的金花葵多糖提取工藝可行性很高,并且具有實際使用的價值,為金花葵進一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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Response surface methodology for optimizing extraction of polysaccharides fromAureaHELIANTHUS

HUANG Jie-tao,ZHANG Lian-ji*

(College of Science,Yanbian University,Yanji 13300,china)

InAurea HELIANTHUSstemsandleavesasrawmaterial,itswaterextractedpolysaccharideformulationtostudytheeffectofdifferentextractionconditionsontheyieldofpolysaccharides.Inthisstudy,thepolysaccharideyieldwasinvestigatedindicators.UsingresponsesurfaceoptimizationofextractionconditionsofAurea HELIANTHUSwhichbasingontheextractiontemperature,extractiontime,solid-liquidratioofsinglefactorexperiments.ResultsindicatedthattheoptimumconditionsforpolysaccharidefromAurea HELIANTHUSextractionwere:watertemperatureof72 ℃,anextractiontimeof3.25handrawmaterialstoaratioofwaterof1∶32(g∶mL).Relativeerrorverificationandpredictedvaluesofpolysaccharideyieldwas0.23%.DescriptionResponsesurfacemethodologyforAurea HELIANTHUSextractionconditionswereoptimizedreasonablyfeasible.

Aurea HELIANTHUS;Polysaccharides;responsesurfacemethod;extract

2016-03-14

黃杰濤(1996-)，男，在讀本科，研究方向：天然產(chǎn)物的提取及活性，E-mail:18604333831@163.com。

*通訊作者:張蓮姬(1970-)，女，博士，研究方向：天然產(chǎn)物的提取及活性研究，E-mail:736313515@qq.com。

延邊大學2016年大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(ydbksky2016101)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)19-0217-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.034