牟 杰,印澤遠(yuǎn),王 麗,周凌蕓,張綺悅,李妙然,閆冬雷,姜 珊

(1.徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,江蘇徐州 221004;2.江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇徐州 221004)

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納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的連續(xù)發(fā)酵工藝優(yōu)化

牟 杰1,2,印澤遠(yuǎn)1,+,王 麗1,周凌蕓1,張綺悅1,李妙然1,閆冬雷1,姜 珊1

(1.徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,江蘇徐州 221004;2.江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇徐州 221004)

為優(yōu)化維生素K2的高密度連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)工藝,通過(guò)對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng),研究了培養(yǎng)基組成、轉(zhuǎn)速、pH、溶氧量、后處理技術(shù)等因素對(duì)維生素K2產(chǎn)量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以香菇菌渣復(fù)配蛋白胨為氮源(5%),甘油為碳源(5%),pH為7,通氣比大于1.5 vvm,轉(zhuǎn)速為600 r/min時(shí),采用高密度連續(xù)發(fā)酵技術(shù),5 L罐發(fā)酵產(chǎn)量最高達(dá)35.58 mg/L。發(fā)酵液萃取后,廢液再通過(guò)納濾膜截流,提高維生素K2回收率,并制成富含維生素K2的菌菇粉。維生素K2的結(jié)構(gòu)經(jīng)高效液相及質(zhì)譜確證。大鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)證明該菌菇粉產(chǎn)品安全無(wú)毒。

維生素K2,連續(xù)發(fā)酵工藝,納豆芽孢桿菌

維生素 K2(Vitamin K2,VK2)是甲萘醌類(lèi)脂溶性維生素,可以通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣離子沉積,促進(jìn)骨組織內(nèi)骨鈣素(BGP)的合成,預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥[1-3]。VK2的異構(gòu)體根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)上C-3位異戊二烯單位的個(gè)數(shù),以MK-n表示,其中MK-7生物活性最高。目前研究和開(kāi)發(fā)的VK2制備方法主要包括化學(xué)合成法[4]和微生物發(fā)酵法,但天然VK2(MK-7)僅能通過(guò)微生物發(fā)酵法獲得[5]。納豆芽孢桿菌因其生長(zhǎng)速度快、易于培養(yǎng)、VK2含量高等優(yōu)勢(shì)[6],成為發(fā)酵生產(chǎn)VK2最主要的微生物,是目前進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)VK2的理想物種之一。雖然眾多研究人員開(kāi)展了微生物發(fā)酵生產(chǎn)VK2的研究[7-10],但發(fā)酵技術(shù)仍不成熟。針對(duì)發(fā)酵過(guò)程中生物量低、生產(chǎn)速率低等問(wèn)題,本研究對(duì)納豆芽孢桿菌連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)VK2的培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,簡(jiǎn)化操作單元,達(dá)到提高最終菌體生物量和目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率的目的,以期為VK2的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

維生素K2標(biāo)準(zhǔn)品 昆明骨康保健品有限公司;香菇菌渣 徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所;其余試劑 市售,分析純;納豆芽孢桿菌R127(CCTCC M2014405)(Bacillussubtilisnatto) 由南京工業(yè)大學(xué)黃和課題組提供;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠,SPF級(jí),雌雄各半,雌者無(wú)孕,體質(zhì)量(200±20) g,由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;固體培養(yǎng)基 30 g葡萄糖,40 g蛋白胨,5 g NaCl,5 g牛肉膏,5 g酵母膏,20 g 瓊脂,1000 mL水。115 ℃滅菌30 min;液體培養(yǎng)基 50 g/L甘油,50 g/L大豆蛋白胨,0.6 g/L酵母粉,0.3 g/L K2HPO4,0.1 g/L CaCl2·H2O,0.3 g/L MgSO4·7H2O,溶劑為水。121 ℃滅菌30 min;香菇菌渣培養(yǎng)基 50 g/L甘油,50 g/L 香菇菌渣,0.6 g/L酵母粉,0.3 g/L K2HPO4,0.1 g/L CaCl2·H2O,0.3 g/L MgSO4·7H2O,1000 mL水。120 ℃滅菌30 min;香菇菌渣與蛋白胨復(fù)配培養(yǎng)基 50 g/L 甘油,15 g/L大豆蛋白胨,50 g/L香菇菌渣,0.6 g/L酵母粉,0.3 g/L K2HPO4,0.1 g/L CaCl2·2H2O,0.3 g/L MgSO4·7H2O,1000 mL水。120 ℃滅菌30 min。

高壓蒸汽滅菌鍋 北京盛達(dá)生物電子設(shè)備有限公司;Sorvall 離心機(jī) 美國(guó)科峻儀器公司;MAPADA UV-3100型紫外可見(jiàn)分光光度儀 上海美譜達(dá)儀器有限公司;5 L發(fā)酵罐Biostat B德國(guó)貝朗生物系統(tǒng)公司;LPG-25 噴霧干燥機(jī) 常州市利君干燥工程有限公司;UltiMate 3000 型高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;Finnigen-LCQ Advantage MAX液質(zhì)聯(lián)用儀 美國(guó)Finnigan公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng)與處理 菌種的活化:將保存在甘油管的納豆芽孢桿菌接入固體培養(yǎng)基中進(jìn)行接種活化(pH7.0～7.2,37 ℃,24 h)后進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)(pH7.0～7.2,37 ℃,120 r/min),液體培養(yǎng)至第二代即可進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。

發(fā)酵生產(chǎn):將二級(jí)種子接入裝有液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,接種量10%(v/v),加入消泡劑,維持pH在7.0左右,通氣量1.5 vvm,攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min,罐溫37 ℃,培養(yǎng)60 h,發(fā)酵生產(chǎn)VK2。

1.2.2 生物量檢測(cè)方法 生物量通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定,每隔24 h測(cè)定一次OD600值,以未發(fā)酵的培養(yǎng)基作為對(duì)照,OD值達(dá)60以上為高密度。

1.2.3 高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化 將活化的納豆芽孢桿菌接入裝有100 mL香菇菌渣與蛋白胨復(fù)配培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中,150 r/min,37 ℃進(jìn)行發(fā)酵。當(dāng)OD600值大于2時(shí)可以作為5 L發(fā)酵罐的菌種。按照10%接種量將活化后的芽孢桿菌接入裝有復(fù)配培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中,按低轉(zhuǎn)速200 r/min和高轉(zhuǎn)速600 r/min兩個(gè)條件分別發(fā)酵,通氣量均為1.5 vvm,溫度37 ℃,待甘油濃度降低至5 g/L左右時(shí),結(jié)束發(fā)酵,稱(chēng)量生物量,檢測(cè)VK2(MK-7)含量。

1.2.4 VK2(MK-7)的定性與定量檢測(cè) 將10 mL納豆芽孢桿菌發(fā)酵液移入250 mL帶擋板的錐形瓶中,向發(fā)酵液中加入異丙醇和正己烷的混合液(1∶2∶4,v∶v),在搖床上220 r/min震蕩30 min,靜置分層后,取上清旋蒸,記錄產(chǎn)物的質(zhì)量,將所得的產(chǎn)物用異丙醇洗出,定容到10 mL的棕色容量瓶中。用液相色譜或質(zhì)譜進(jìn)行定性和定量分析。

VK2的定性通過(guò)被檢測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)VK2樣品在液相色譜上洗脫位置的比較以及樣品在質(zhì)譜圖上的離子碎片的特征表現(xiàn)來(lái)確定。

VK2的定量通過(guò)VK2標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與液相色譜中對(duì)應(yīng)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算而得。

液相色譜工作條件為:色譜柱:Brava-BDS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱;流動(dòng)相:100%甲醇;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:30 μL;柱溫:50 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm。

質(zhì)譜測(cè)定時(shí)液相色譜的工作條件同上,質(zhì)譜采用ESI全掃描檢測(cè)。

1.2.5 富含VK2的菌菇粉制備 將發(fā)酵液通過(guò)微濾膜濃縮設(shè)備,回收菌體濃縮液,并收集濾出清液;將濾出的清液通過(guò)納濾膜濃縮設(shè)備,截留分子量300 u以上的物質(zhì),回收截留濃縮液,濾出清液經(jīng)處理后排放。合并菌體濃縮液和截留濃縮液,采用噴霧干燥機(jī)制粉。

1.2.6 大鼠急性毒性實(shí)驗(yàn) 取20只SPF級(jí)SD大鼠,隨機(jī)分成給藥組和空白對(duì)照組,每組10只,禁食不禁水12 h。給藥組按大鼠最大灌胃給藥體積100 mg/kg給予供試品(即富含VK2的菌菇粉),每天2次,空白對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。常規(guī)飼養(yǎng)14 d,記錄動(dòng)物體質(zhì)量變化、外觀、飲食、行為、排泄物及中毒反應(yīng)等情況。第14 d時(shí)稱(chēng)重處死,解剖小鼠,肉眼觀察其心、肝、肺、腎的外觀。

2 結(jié)果與分析

2.1 VK2(MK-7)的定性和定量分析

取納豆芽孢桿菌發(fā)酵液適量,按1.2.4方法提取其中的VK2(MK-7),并對(duì)提取液用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析。液相色譜圖見(jiàn)圖1,圖中保留時(shí)間為40.777 min的吸收峰與VK2(MK-7)標(biāo)準(zhǔn)品(圖2)的保留時(shí)間一致。對(duì)液相色譜中的VK2特征峰進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出特征峰的分子量為649.3(M+1),與MK-7的分子量一致,說(shuō)明液相色譜中40.777 min處的特征峰為本研究的目標(biāo)產(chǎn)物VK2(MK-7)。

圖1 發(fā)酵樣品的液相色譜圖Fig.1 HPLC of VK2(MK-7)in the fermentation sample

圖2 100 mg/L VK2(MK-7)標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Fig.2 HPLC of VK2(MK-7)standard sample

圖3 發(fā)酵樣品VK2(MK-7)質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of VK2(MK-7)

按照VK2的色譜檢測(cè)條件,配制不同濃度梯度的VK2(MK-7)標(biāo)準(zhǔn)溶液,以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖4中可以看出,MK-7標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為Y=0.7101X-0.3223,R2=0.9986,檢出限為1 μg。在此色譜條件下,可以檢測(cè)不同發(fā)酵周期的發(fā)酵液中VK2的質(zhì)量濃度。

圖4 VK2(MK-7)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard calibration curve of VK2(MK-7)

2.2 氮源的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)以甘油為碳源,對(duì)氮源進(jìn)行了優(yōu)化。從文獻(xiàn)中可以知道,大豆蛋白胨是合成MK-7 的最佳氮源[11],但價(jià)格較高。為了降低生產(chǎn)成本,最好能選擇更便宜的氮源。本實(shí)驗(yàn)按1.2.1的方法,通過(guò)檢測(cè)VK2的產(chǎn)量來(lái)考察以香菇菌渣作為替代氮源的可行性,同時(shí)將香菇菌渣和蛋白胨復(fù)配,考察了部分替代的可行性(表1)。

從表1可以看出,大豆蛋白胨合成VK2含量最高,確實(shí)是最佳氮源。雖然香菇菌渣的含氮量與大豆蛋白胨相近,但發(fā)酵效果遠(yuǎn)不如蛋白胨;而以香菇菌渣與蛋白胨復(fù)配物為氮源時(shí),VK2產(chǎn)量雖明顯高于單獨(dú)以香菇菌渣為氮源的情況,但仍低于蛋白胨。為提高VK2產(chǎn)量,本實(shí)驗(yàn)以香菇菌渣為主要氮源,蛋白胨作補(bǔ)充氮源,通過(guò)優(yōu)化高密度發(fā)酵工藝參數(shù)來(lái)提高VK2產(chǎn)量。

表1 不同氮源對(duì)VK2產(chǎn)量的影響

Table 1 The effects of different nitrogen source on the yield of vitamin K2

培養(yǎng)基種類(lèi)大豆蛋白胨干重(g/L)菌菇粉干重(g/L)MK-7(mg/L)液體培養(yǎng)基520701705香菇菌渣培養(yǎng)基05325295香菇菌渣與蛋白胨復(fù)配培養(yǎng)基15365067649

2.3 高密度連續(xù)發(fā)酵工藝的優(yōu)化

采用香菇菌渣與大豆蛋白胨復(fù)配發(fā)酵培養(yǎng)基,按1.2.3的方法,在5 L發(fā)酵罐上開(kāi)展納豆芽孢桿菌高密度連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)VK2的工藝優(yōu)化研究。在5 L發(fā)酵罐中,當(dāng)OD600保持在80左右,說(shuō)明發(fā)酵罐中的菌種生物量較大,可視為高密度發(fā)酵。當(dāng)培養(yǎng)基中甘油濃度降低至5 g/L左右時(shí),結(jié)束發(fā)酵。然后按1.2.4的方法,用液相色譜檢測(cè)VK2(MK-7)的產(chǎn)量。

本實(shí)驗(yàn)首先考察了轉(zhuǎn)速(低轉(zhuǎn)速200 r/min和高轉(zhuǎn)速600 r/min)對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)VK2的影響,不同轉(zhuǎn)速下對(duì)甘油消耗的影響結(jié)果見(jiàn)圖5,發(fā)酵時(shí)間對(duì)VK2產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖6。

從圖5可以看出:轉(zhuǎn)速對(duì)VK2產(chǎn)量影響很大。低轉(zhuǎn)速(200 r/min)下,甘油消耗速度慢,發(fā)酵被抑制;高轉(zhuǎn)速(600 r/min)下,甘油消耗速度較快,發(fā)酵60 h后,甘油被消耗完全,繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間,甘油消耗量變化不大。

圖5 5 L發(fā)酵罐不同轉(zhuǎn)速對(duì)甘油消耗的影響Fig.5 Effects of different rotate rate on the consumption of glycerol in 5 L fermentation tank

從圖6可以看出:VK2的產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而增加,發(fā)酵60 h后達(dá)峰值,隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而VK2產(chǎn)率反而降低;高轉(zhuǎn)速(600 r/min)下發(fā)酵60 h后,VK2產(chǎn)量最高可達(dá)35.58 mg/L。

圖6 5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵時(shí)間對(duì)VK2產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of fermentation time on yield of VK2 in 5 L fermentation tank

然后考察了不同轉(zhuǎn)速下溶氧(DO)對(duì)兩種培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)間的影響(圖7)。從圖7可以看出:發(fā)酵20 h后,DO值大于20%,對(duì)復(fù)配氮源的高轉(zhuǎn)速發(fā)酵更為有利。

圖7 5 L發(fā)酵罐中溶氧對(duì)VK2產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of DO value on yield of VK2 in 5 L fermentation tank

圖8為酸堿度對(duì)不同轉(zhuǎn)速下兩種培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)間的影響,從圖中可以看出:高轉(zhuǎn)速下復(fù)配氮源的發(fā)酵pH在發(fā)酵20～80 h之間較為穩(wěn)定,保持在7左右,pH突然降低說(shuō)明需要補(bǔ)料。

圖8 5 L發(fā)酵罐中酸堿度對(duì)VK2產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of pH value on yield of VK2 in 5 L fermentation tank

結(jié)合培養(yǎng)基的優(yōu)化及高密度連續(xù)發(fā)酵工藝的優(yōu)化,得出最佳工藝條件為:以甘油為碳源,香菇渣與蛋白胨復(fù)配物為氮源,控制DO大于20%,通氣量為1.5 vvm,600 r/min,溫度37 ℃,pH7.0時(shí),VK2發(fā)酵產(chǎn)量最高,可達(dá)35.58 mg/L。

2.4 富含VK2的菌菇粉制備方法

將發(fā)酵液經(jīng)管式分離膜過(guò)濾,獲得固形物含量20%以上的濃縮液,然后用卷式納濾膜截留剩余發(fā)酵液中的VK2,可提高收率。將濃縮液和截留物與香菇菌渣、灰樹(shù)花渣等菌菇渣經(jīng)噴霧干燥器進(jìn)行噴干制成干粉,可獲得每克富含200 μg維生素K2的菌菇粉。

2.5 大鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

在連續(xù)14 d的觀察中,大鼠外觀、飲食、行為、排泄均未出現(xiàn)異常癥狀,也無(wú)死亡;處死后進(jìn)行解剖,各器官未見(jiàn)異常。富含K2菌菇粉對(duì)雌、雄性大鼠經(jīng)口LD50均大于2000 mg/kg體重,屬無(wú)毒級(jí)。

組別給藥前體質(zhì)量(g)給藥14d后體質(zhì)量(g)體質(zhì)量增長(zhǎng)的百分率(%)空白對(duì)照組200±20260±182636富含VK2的菌菇粉組202±20264±162612

3 結(jié)論與討論

在納豆芽孢桿菌的發(fā)酵過(guò)程中,合適的氮、碳源以及氮碳比對(duì)維生素K2發(fā)酵具有重要作用。Yoshiki等發(fā)現(xiàn)以甘油為碳源、以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中MK-7的產(chǎn)量和細(xì)胞增長(zhǎng)速度都為最高[11]。由于蛋白胨的價(jià)格較高,造成生產(chǎn)成本過(guò)高,因此有必要尋找一種新的廉價(jià)的氮源。采用含氮量相近、成本低的香菇菌渣替代蛋白胨,可以“變廢為寶”,提高資源利用率。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用香菇菌渣作氮源,生物量低,VK2收率低;但向香菇菌渣中加入過(guò)多的蛋白胨作復(fù)配氮源時(shí),發(fā)酵體系中會(huì)產(chǎn)生大量泡沫,對(duì)底物消耗也會(huì)產(chǎn)生一定的抑制作用[12]。因此本實(shí)驗(yàn)采用50 g/L香菇菌渣和15 g/L的大豆蛋白胨的復(fù)配物作氮源。

納豆芽孢桿菌是好氧菌,在小體系比大體系生產(chǎn)VK2能力更強(qiáng),這可能是在大發(fā)酵體系中供氧不足,導(dǎo)致細(xì)胞代謝速率減緩,VK2生產(chǎn)力下降。通過(guò)在5 L發(fā)酵罐中對(duì)高密度發(fā)酵工藝參數(shù)的考察,我們發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)速(600 r/min)、高溶液溶氧量(DO>20%)時(shí),發(fā)酵60 h,VK2收率最高達(dá)35.58 mg/L。反應(yīng)體系的pH控制在7左右,有利于高轉(zhuǎn)速下復(fù)配氮源的發(fā)酵的平穩(wěn)進(jìn)行。同時(shí),隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)酵體系pH會(huì)突然降低,VK2產(chǎn)量隨之下降,因此檢測(cè)發(fā)酵體系的pH可以作為補(bǔ)料的依據(jù)。

發(fā)酵產(chǎn)生的VK2位于細(xì)胞膜上,在發(fā)酵過(guò)程中部分產(chǎn)品滲漏進(jìn)入發(fā)酵液中,因此采用納濾膜過(guò)濾發(fā)酵液,可以截留分子量100～1000的物質(zhì),提高VK2的收率。將VK2與香菇渣、灰樹(shù)花渣等菌菇渣經(jīng)噴霧干燥器進(jìn)行噴干作成干粉,可以獲得每克富含200 μg維生素K2的菌菇粉。該菌菇粉在急性毒性實(shí)驗(yàn)中,未見(jiàn)任何急性毒性反應(yīng),對(duì)大鼠LD50均大于2000 mg/kg體重,屬無(wú)毒級(jí)。

本文報(bào)道的納豆芽孢桿菌高密度連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)維生素K2的工藝在氮源、工藝參數(shù)、產(chǎn)物劑型上均進(jìn)行了改進(jìn),為VK2的工業(yè)化大生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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Optimization on the continuous fermentation process of Vitamin K2 fromBacillussubtilisnatto

MOU Jie1,2,YIN Ze-yuan1,+,WANG Li1,ZHOU Ling-yun1, ZHANG Qi-yue1,LI Miao-ran1,YAN Dong-lei1,JIANG Shan1

(1.School of Pharmacy,Xuzhou Medical College,Xuzhou 221004,China; 2.Jiangsu Key Laboratory of New drug and Clinical Pharmacy,Xuzhou Medical College,Xuzhou 221004,China)

TooptimizethehighdensitycontinuousfermentationprocessofVitaminK2,theeffectsofrawmaterialsconcentration,rotationrate,pH,dissolvedoxygen(DO)andpost-processingtechniqueswereinvestigatedbythefermentationofBacillus subtilis natto.ItwasfoundthattheoptimalconditionwasofGlycerol5%,soybeanprotein2%,mushroomcompost3%,pH7andDOof20%at600r/min.Thehighestyieldreached35.58mg/Lin5Lfermentationtank.Mushroomcompost,asasupplementarynitrogensource,canpromotethebiosynthesisofVK2,anditseffectiveconcentrationwas3%.Thefermentationbrothwasextractedbyextractliquorandfilteredbynanofiltrationmembrane.Asaresult,VitaminK2canbewellisolatedandtheVK2mixedmushroompowderwasobtainedthroughspraydrying.ThestructureofVitaminK2wascharacterizedbyHPLCandMS.Thequalityofproductwassafeandqualified.

VitaminK2;continuousfermentationprocess;Bacillus subtilis natto

2016-04-05 +為并列第一作者

牟杰(1974-),女,博士,副教授,研究方向:藥物合成,E-mail:mou.jie@126.com。 印澤遠(yuǎn)(1998-),男,本科生,研究方向:抗腫瘤藥物研發(fā),E-mail:2504464354@qq.com。

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510313028);江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(201510313028Z);江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金(ZR-XY201403);徐州醫(yī)學(xué)院“振興計(jì)劃”。

TS201.3

A

1002-0306(2016)19-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.022