劉聲傳，鄢東海，周 雪，莫 雪，胡依然，魏 杰，周富裕，周玉鋒

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

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茶樹(shù)CsSMT基因的單核苷酸多態(tài)性及其表達(dá)

劉聲傳，鄢東海，周 雪，莫 雪，胡依然，魏 杰，周富裕，周玉鋒*

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

為了發(fā)掘利用茶樹(shù)茶樹(shù)富硒關(guān)鍵酶硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Selenocysteine methyltransferase, SMT)基因CsSMT，通過(guò)RACE克隆該基因的cDNA全長(zhǎng)，并通過(guò)水培試驗(yàn)，分析該基因在井43幼苗根葉的表達(dá)特征。結(jié)果表明：通過(guò)該基因cDNA的全長(zhǎng)克隆，獲得5個(gè)茶樹(shù)品種CsSMT的開(kāi)放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)；對(duì)茶樹(shù)5個(gè)品種的ORF核苷酸多態(tài)性鑒定共檢測(cè)到19個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，包括17個(gè)SNPs和2個(gè)InDels，平均每55 bp檢測(cè)到1個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，這些多態(tài)位點(diǎn)引起9個(gè)氨基酸位點(diǎn)變化；5個(gè)茶樹(shù)品種SMT的氨基酸序列一致性為99.15 %，出現(xiàn)一定的遺傳分化。Na2SeO3水培及熒光定量PCR表明，CsSMT基因在茶樹(shù)幼苗根與成熟葉中均有表達(dá)；Na2SeO3顯著誘導(dǎo)成熟葉中該基因表達(dá)，抑制須根CsSMT表達(dá)。

茶樹(shù)；硒；CsSMT；核苷酸多態(tài)性；表達(dá)模式

硒是人體必需的一種微量元素，對(duì)人體具有多種保健功能[1]。然而，我國(guó)缺硒地區(qū)較廣，約2/3的人口存在不同程度的硒攝入量不足[2]。茶為世界三大無(wú)酒精飲料之一，茶樹(shù)(Camelliasinensis)可將土壤中的硒富集于葉片，而為人體提供安全保健的天然有機(jī)硒[3-4]。茶樹(shù)種質(zhì)資源豐富、遺傳多樣性高，不同茶樹(shù)品種葉片對(duì)硒的富集能力存在差異，一些硒代謝酶基因在茶樹(shù)葉片硒的富集過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。

硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Selenocysteine methyltransferase, SMT)是茶樹(shù)等植物硒代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化硒代半胱氨酸進(jìn)行甲基化反應(yīng)生成甲基硒代半胱氨酸(Methylselenocysteine, MeSeCys)(一種氨基酸衍生物，具抗癌功能)，從而減少硒對(duì)蛋白質(zhì)的摻入，解除硒對(duì)茶樹(shù)的毒害，使茶葉安全富集硒源[5-7]。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)是基因組單個(gè)核苷酸由于轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失等引起的變異。插入-缺失(Insertion-deletion indel, InDel)是指核苷酸小片段的插入或缺失。廣義的SNP包括InDel，是最豐富的遺傳變異，廣泛而穩(wěn)定地存在于植物基因組中，SNP變異可能影響基因的功能。例如，茶樹(shù)查爾酮合成酶(Chalcone synthase, CHS)是類(lèi)黃酮合成途徑的關(guān)鍵酶，CsCHS1和CsCHS2中分別存在2個(gè)和4個(gè)與茶葉多酚含量相關(guān)的SNP位點(diǎn)[8]；魏艷麗[7]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)咖啡堿合成酶(Tea caffeine synthase, TCS)基因TCS1的一個(gè)點(diǎn)突變與咖啡堿含量顯著相關(guān)；大麥Wx的多態(tài)性與直鏈淀粉含量之間存在明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系[10]。雖然已從茶樹(shù)中克隆了CsSMT并進(jìn)行了初步驗(yàn)證，但鮮見(jiàn)茶樹(shù)品種間該基因的SNP及表達(dá)特性分析[11]。為此，本研究克隆了5個(gè)茶樹(shù)品種葉片中CsSMT的cDNA全長(zhǎng)，分析該基因單核苷酸多態(tài)性；通過(guò)水培試驗(yàn)，結(jié)合qRT-PCR技術(shù)分析CsSMT在茶樹(shù)幼苗須根與成熟葉中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究該基因如何調(diào)控茶樹(shù)硒代謝及篩選富硒茶樹(shù)品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試茶樹(shù)品種、菌株、載體及試劑

供試品種為福鼎大白茶、貴定鳥(niǎo)王茶、龍井43、寧州2號(hào)和祁門(mén)種，均采于貴州省茶葉研究所茶樹(shù)資源圃。PrimeScriptTMRT、TaKaRa LATaq酶、rTaq酶、PrimeSTAR@HS (Premix)、PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、pMD 18-T Vector Cloning Kit、dATP、E.coliDH5α Competent cells和SYBR Premix ExTaqTMII均購(gòu)自TaKaRa公司。AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。

1.2 目的基因cDNA的全長(zhǎng)克隆

基于課題組前期已克隆的寧州2號(hào)SMT基因cDNA的全長(zhǎng)序列[12]，設(shè)計(jì)CsSMT全長(zhǎng)擴(kuò)增引物：正向引物GGGTGTTATGTTCTTGGTG和反向引物TGTCAGTTAATCAGTGGGAT，進(jìn)行其他4個(gè)品種該基因的開(kāi)放閱讀框(Open reading frame, ORF)擴(kuò)增。采用Qiagen試劑盒(Qiagen, 德國(guó))提取茶葉總RNA，利用PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈，連接至T-Vector pMD18，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定、測(cè)序[12]。

1.3 目的基因開(kāi)放閱讀框單核苷酸及其編碼氨基酸多態(tài)性

利用DNAstar軟件包內(nèi)的EdiSeq程序查閱ORF并翻譯成氨基酸序列。利用DNAman軟件對(duì)來(lái)自不同材料的序列進(jìn)行單核苷酸和氨基酸多態(tài)性分析。利用Mega6軟件對(duì)目的基因的氨基酸與其它物種同源氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 茶樹(shù)水培及表達(dá)分析

選取生長(zhǎng)勢(shì)一致的一年生龍井43扦插幼苗，先用自來(lái)水洗凈茶樹(shù)根系上的土壤，再用去離子水沖洗2次。將茶樹(shù)定植于黑色塑料盆(高40 cm×內(nèi)徑30 cm)中，外套上不透光塑料平板，用營(yíng)養(yǎng)液(pH調(diào)為6.0)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)[13]。用通氧泵連續(xù)通氣，每7 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，預(yù)培養(yǎng)60 d左右，待茶樹(shù)根部長(zhǎng)出大量白色吸收根后, 將其分成4組：即0、5、10和20 mg/L的Na2SeO3。處理24 h后，取成熟葉片和須根，用去離子水洗凈，吸干表面水分，液氮速凍后于-80 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Qiagen試劑盒提取茶葉總RNA，樣品間等量的總RNA(0.50 μg)經(jīng)DNA酶處理后，采用PrimeScriptTMRT試劑盒合成cDNA，合成的cDNA經(jīng)NanoDrop ND-2000(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)檢測(cè)后，均稀釋為100 ng/μl。采用SYBR Premix ExTaqTMII試劑盒在ABI7500(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GADPH)基因?yàn)閮?nèi)參基因。樣本和內(nèi)參分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因表達(dá)水平[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因cDNA全長(zhǎng)克隆

以已經(jīng)克隆的寧州2號(hào)SMT的cDNA為模板設(shè)計(jì)引物，克隆到另4個(gè)茶樹(shù)品種該基因的cDNA全長(zhǎng)，進(jìn)一步BLASTx比對(duì)，最終得到5個(gè)茶樹(shù)品種的目的基因ORF全長(zhǎng)及其編碼的氨基酸序列全長(zhǎng)(圖1，表1)。

2.2 SMT編碼區(qū)核苷酸多態(tài)性

經(jīng)核苷酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)茶樹(shù)品種的ORF一致性為99.22 %，檢測(cè)到19個(gè)核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，平均約每55 bp檢測(cè)到1個(gè)SNP。在所檢測(cè)出的17個(gè)SNPs中，有10個(gè)轉(zhuǎn)換(T?C，A?G)和8個(gè)顛換(A?C，A?T，C?G，G?T)，轉(zhuǎn)換與顛換比為1.25∶1，說(shuō)明堿基突變的主要類(lèi)型是轉(zhuǎn)換(圖2)。檢測(cè)到2個(gè)InDels，一個(gè)位于35 bP，是大小為6 bp(TTCGTC和GTCGTC)或3 bp(GTC)的插入片段；1個(gè)位于FudingdabaichaSMT的第1050 bp，缺失3 bp(AAA)片段(圖2)。

圖1 目的基因cDNA的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of target gene cDNA

目的基因TargetgenesORF擴(kuò)增后全長(zhǎng)(bp)LengthaftercoloneofORFORF全長(zhǎng)(bp)ORFlength氨基酸長(zhǎng)Lengthaminoacid福鼎大白茶SMTFudingdabaichaSMT11281053350aa貴定鳥(niǎo)王茶SMTGuidingniaowangchaSMT11221050349aa龍井43SMTLongjinNo．43SMT11941053350aa寧州2號(hào)SMTNingzhouNo．2SMT12771050349aa祁門(mén)種SMTQimenzhongSMT12491056351aa

圖2 5個(gè)茶樹(shù)品種的CsSMT開(kāi)放閱讀框序列Fig.2 The open reading frame alignment of CsSMT gene in five tea cultivars

圖3 5個(gè)茶樹(shù)品種CsSMT編碼氨基酸序列的比對(duì)Fig.3 Protein sequence alignment of CsSMT gene in five tea cultivars

圖4 茶樹(shù)CsSMT與其他植物同源蛋白的進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic relationship of CsSMT in tea plant with the homologous proteins from other plants

2.3 SMT氨基酸多態(tài)性及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

5個(gè)茶樹(shù)品種SMT的氨基酸序列一致性為99.15 %，檢測(cè)到8個(gè)氨基酸單變異位點(diǎn)(I?M，I?L，F(xiàn)?L，Q?P，L?V，A?D，Q?R，Y?C)(圖3)。福鼎大白茶SMT有5個(gè)位點(diǎn)(I→M，L→I，V→L，R→Q，C→Y)不同于其余4個(gè)品種；變異位點(diǎn)(F→L)和(Q→P)分別僅存在于寧州2號(hào)和龍井43(圖3)。檢測(cè)到1個(gè)氨基酸插入位點(diǎn)，福鼎大白茶和祁門(mén)種SMT序列插入了2個(gè)絲氨酸(S)，龍井43的SMT序列插入了1個(gè)S(圖3)。

基于氨基酸序列同源性，采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖4)，5個(gè)茶樹(shù)品種的SMT聚為1大類(lèi)，包含3小類(lèi)，龍井43與福鼎大白茶SMT的親緣關(guān)系較近，貴定鳥(niǎo)王茶與寧州2號(hào)的親緣關(guān)系較近，祁門(mén)種單獨(dú)聚為1小類(lèi)。5個(gè)茶樹(shù)品種的SMT與毛果楊(Populustrichocarpa)、野生大豆(Glycinesoja)、黃芪(Astragalusbisulcatus)、花菜(Brassicaoleracea)的SMT及川桑(Morusnotabilis)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蒺藜苜蓿Medicagotruncatula)、毛果楊的HMTs(Homocysteine S-methyltransferase, HMT)親緣關(guān)系較近(圖4)。

2.4 不同硒濃度下茶樹(shù)SMT表達(dá)模式

如圖5所示，隨著硒濃度的增加，龍井43幼苗成熟葉的SMT表達(dá)水平顯著增加，而須根中的SMT表達(dá)水平顯著降低。當(dāng)硒濃度為5、10和20 mg/L時(shí)，成熟葉SMT的表達(dá)水平分別約為對(duì)照(0 mg/L)的1.3、1.4和1.5倍，而須根SMT的表達(dá)水平分別約為對(duì)照的0.9、0.7和0.6倍。

3 討 論

SMT作為一些植物的富硒關(guān)鍵調(diào)控酶基因，已在一些富硒植物如黃芪[15]、花菜[16]和茶樹(shù)[17]中克隆初步驗(yàn)證了該基因。還通過(guò)轉(zhuǎn)黃芪AbSMT至擬南芥[18]及煙草(Nicotianatabacum)[19]，使宿主硒累積量增加。然而，有關(guān)同一作物，不同栽培品種間該基因多態(tài)性、組織表達(dá)差異等研究不多。

圖5 不同硒濃度下龍井43的SMT表達(dá)模式Fig.5 Expression pattern of SMT genes in C.sinensis cv. Longjin43 under different selenium content

本研究發(fā)現(xiàn)，5個(gè)茶樹(shù)品種間的SMT存在17個(gè)SNPs和2個(gè)InDels，引起8個(gè)氨基酸單變異位點(diǎn)和1個(gè)氨基酸插入位點(diǎn)，這9個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變化有可能引起SMT的活性改變。前期已有研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)氨基酸插入位點(diǎn)為SMT的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(待發(fā)表)，該磷酸化位點(diǎn)的增多或減少有可能引起該酶活性變化。8個(gè)氨基酸單變異位點(diǎn)中包含1個(gè)酪氨酸(Tyr, Y)突變位點(diǎn)，也是1個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。其他突變位點(diǎn)也可能引起該酶親水性/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽等性質(zhì)改變，改變?cè)撁腹δ埽M(jìn)而影響茶樹(shù)對(duì)硒的富集能力。已研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)查爾酮合成酶CsCHS1、CsCHS2及茶樹(shù)咖啡堿合成酶基因TCS1的點(diǎn)突變可分別改變茶葉多酚、咖啡堿含量[7-8]。此外，系統(tǒng)發(fā)育分析也發(fā)現(xiàn)，5個(gè)茶樹(shù)品種間的SMT出現(xiàn)一定的遺傳分化，進(jìn)一步表明這些突變位點(diǎn)中存在與茶樹(shù)葉片富硒相關(guān)的潛在位點(diǎn)。

王昌全[20]通過(guò)水培研究認(rèn)為，硒濃度< 8 mg/L為中低硒濃度，促進(jìn)蒙山9號(hào)(2年生)生長(zhǎng)和發(fā)育，硒濃度> 8 mg/L則抑制生長(zhǎng)。黃進(jìn)[21]對(duì)多個(gè)茶樹(shù)品種水培研究發(fā)現(xiàn)，在一定硒濃度范圍內(nèi)，隨著硒濃度增加，硒敏感型茶樹(shù)品種龍井43和烏牛早葉片硒累積量增加了20 %。也有研究表明，硒敏感型茶樹(shù)品種根和葉SMT的表達(dá)水平高于非敏感型茶樹(shù)品種[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著硒濃度增加，茶樹(shù)須根中SMT表達(dá)下降，而葉片中SMT表達(dá)上升，可能是硒濃度的增加抑制了須根生長(zhǎng)，茶樹(shù)為了解除硒毒害，把硒富集到葉片，轉(zhuǎn)換成非蛋白質(zhì)氨基酸，進(jìn)而揮發(fā)至空氣中。

本次僅初步研究了5個(gè)茶樹(shù)品種該基因的多態(tài)性及其表達(dá)特性，研究的茶樹(shù)品種有限，也未研究該基因在嫩葉中的表達(dá)，以及該基因的多態(tài)性與硒富集量的相關(guān)性，如何確定適宜茶園生產(chǎn)的硒濃度范圍(即可促進(jìn)茶樹(shù)生長(zhǎng)、提高品質(zhì)，又達(dá)到富集硒的功能)，以及快速篩選富硒茶樹(shù)品種等還有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯 聶克艷)

Single Nucleotide Polymorphism and Expression Analysis ofCsSMTGene in Tea Plant

LIU Sheng-chuan, YAN Dong-hai, ZHOU Xue, MO Xue, HU Yi-ran, WEI Jie, ZHOU Fu-yu, ZHOU Yu-feng*

(Tea Research Institute, Guizhou Academy of Agricultrural Sciences, Guizhou Guiyang 550006, China)

The present study was conducted to explore the selenocysteine methyltransferase (SMT) geneCsSMT, which played an essential role in tea plant leaves enriching selenium. The whole cDNA was obtained by RACE cloning. Based on solution culture experiments, expression patterns ofCsSMTin Longjin 43 were analyzed. Results: Through cloning the wholeCsSMTcDNA in five tea cultivars, their open reading frame (ORF) was obtained. By polymorphism identification ofSMTgene ORF for the five tea cultivars, 19 polymorphism sites were identified, including 17 single nucleotide polymorphisms (SNPs) and two InDels (insertion and deletion) with the polymorphism frequency of 1/55 bp. These polymorphism sites caused nine amino acid positions change. Amino acid sequence identification of SMT was 99.15 % in five tea cultivars, with a certain genetic distribution. Solution culture and the real-time PCR analysis showed thatCsSMTtranscripts in mature leaves were significantly increased upon the treatment of Na2SeO3, while the opposite trend was observed in fibrous roots.

Tea plant; Selenium;CsSMT; Nucleotide polymorphism; Expression pattern

1001-4829(2016)08-1793-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.007

2015-12-21

貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目“茶樹(shù)富硒作用關(guān)鍵酶基因CsSMT的克隆與超表達(dá)研究”[黔農(nóng)科合(創(chuàng)新基金)2011006]；貴州省體改項(xiàng)目“現(xiàn)代高效農(nóng)業(yè)園區(qū)茶葉栽培與加工技術(shù)集成示范”[黔科合Z字(2013)4008]；貴州省科研機(jī)構(gòu)服務(wù)行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目“黔茶系列茶樹(shù)品種推廣應(yīng)用園區(qū)能力建設(shè)” [黔科合服企(2014)4008]，貴州省農(nóng)業(yè)動(dòng)植物育種專(zhuān)項(xiàng)“黔茶1號(hào)區(qū)域適應(yīng)性高效栽培研究與示范”[黔農(nóng)育專(zhuān)字(2012)022]，“貴定鳥(niǎo)王種擴(kuò)繁和栽培技術(shù)集成與示范” [黔農(nóng)育專(zhuān)字(2015)003]

劉聲傳(1981-)，男，副研究員，博士，從事茶樹(shù)資源與分子生物學(xué)研究，E-mail: gtscliu@sohu.com，*為通訊作者。

S571.1

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