閆海霞，蔣月喜，王曉國，何荊洲，黃昌艷，鄧杰玲，卜朝陽

(廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院花卉研究所，廣西 南寧 530007)

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蝶豆的組織培養(yǎng)與快繁技術研究

閆海霞，蔣月喜*，王曉國，何荊洲，黃昌艷，鄧杰玲，卜朝陽**

(廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院花卉研究所，廣西 南寧 530007)

通過蝶豆種子無菌萌發(fā)，篩選出各培養(yǎng)階段的適宜培養(yǎng)基，為建立蝶豆的組織培養(yǎng)與快繁技術提供參考。結果表明：采用75 %酒精表面滅菌30 s結合0.1 %的HgCl2表面滅菌10 min的方法，蝶豆的種子無菌萌發(fā)時污染率為0，發(fā)芽率為36.67 %；下胚軸、上胚軸、子葉的愈傷誘導率為100.00 %，愈傷分化率分別為82.11 %、20.00 %、0；愈傷分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.10 mg/L+NAA 0.02 mg/L；上胚軸和下胚軸不能直接誘導出不定芽，子葉可以直接誘導出不定芽；不定芽增殖的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.50 mg/L；生根適宜培養(yǎng)基為MS+IBA 0.30 mg/L或者1/2 MS+IBA 0.30 mg/L。

蝶豆；無菌萌發(fā)；愈傷組織；不定芽

蝶豆(ClitoriaternateaL.)屬蝶形花科(Papilionaceae)蝶豆屬(Clitoria)，別名為藍花豆，蝴蝶花豆，藍蝴蝶。其原產印度、印度尼西亞，現世界上熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛栽培。蝶豆的用途廣泛，花朵可以提取天然染料，嫩夾可以食用，根可以入藥；此外，蝶豆還可制成干草用作飼料。近年來蝶豆在園林植物造景配置中得到越來越多的應用，主要用于花壇、庭園圍籬蔓爬、盆栽、垂吊，特別是在廣東沿海一帶，常作為盆栽藤蔓觀賞花卉[1]和主要的垂直綠化植物[2]。國內有關蝶豆的相關研究較少，主要停留在一些特性描述[3]、種子萌發(fā)[4]、常規(guī)栽培技術[5]以及藥用價值[6-8]等方面，其中余玲[3]對蝶豆的形態(tài)以及農學性狀進行了描述，指出蝶豆的用途包括：調制干草、綠肥植物、植被復原、觀賞植物、高級油料、藥用和食品染料(花中含有比較穩(wěn)定的天然染料)；閆海霞等[4]研究結果表明：蝶豆種子萌發(fā)的需光性為不敏感的中性特征；溫度是決定蝶豆種子萌發(fā)的主要因素，適宜的萌發(fā)溫度為20～30 ℃；在40～60 ℃的溫湯中浸種可有效提高其發(fā)芽率。蝶豆種子發(fā)芽率普遍較低，盡管采用某些物理或化學處理方法可以提高其發(fā)芽率，例如貯藏6個月后再進行萌發(fā)，發(fā)芽率可達15.00 %～20.00 %[5]；萌發(fā)前采用熱水、硫酸和KOH進行預處理，萌發(fā)率可提高[9]；采用機械劃破來種皮可將發(fā)芽率從30.00 %增加到71.00 %[3]。但是常規(guī)的種子繁殖方法存在速度慢、繁殖系數低的問題，而組織培養(yǎng)及快繁技術則可解決此缺點。此外，通過組培快繁獲得的繁殖后代整齊一致，能保持原有品種的優(yōu)良性狀。目前尚未有蝶豆組織培養(yǎng)的相關研究報道。本研究以蝶豆當年采收的種子為材料，通過無菌播種，篩選出各培養(yǎng)階段所需要的適宜培養(yǎng)基，以期建立蝶豆組織培養(yǎng)與快繁體系，為其遺傳轉化提供理論和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蝶豆種子為當年采收，由廣西農業(yè)科學院花卉研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

MS培養(yǎng)基和1/2 MS培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基大量元素用量減半)，蔗糖30 g/L，瓊脂3.5～4.0 g/L，pH 5.8～6.2。培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，每日光照12 h。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子的無菌萌發(fā) 選用飽滿種子，自來水沖洗30 min后，先用75 %的酒精進行表面滅菌，無菌水沖洗3遍，再用0.1 % HgCl2進行表面滅菌，無菌水沖洗3遍。酒精和HgCl2的具體滅菌時間如表1。滅菌后將種子放入40～60 ℃無菌水浸種10～15 min，置于室溫下24 h后接入MS培養(yǎng)基中。以后每天觀察種子污染以及發(fā)芽情況，15 d后統(tǒng)計污染率和發(fā)芽率。

表1 蝶豆種子的滅菌時間組合

表2 愈傷分化培養(yǎng)基的不同激素配比

Table 2 The different hormone combinations of callus differentiation medium

處理Treatment培養(yǎng)基Medium6?BA(mg/L)NAA(mg/L)F1MS0．100．02F2MS0．100．10F3MS0．500．02F4MS0．500．10F5MS1．000．02F6MS1．000．10

污染率( %)=污染數/接種數×100

發(fā)芽率( %)=萌發(fā)數/接種數×100

1.3.2 愈傷組織的誘導 將種子萌發(fā)后的小苗(子葉已展開)的上胚軸、下胚軸，帶子葉莖段切成長為10 mm的小段，接種在MS培養(yǎng)基上。每天觀察誘導情況，20 d后統(tǒng)計愈傷誘導率和愈傷分化率。

愈傷誘導率( %)=產生愈傷數/接種數×100

愈傷分化率( %)=發(fā)生愈傷分化數/接種數×100

1.3.3 愈傷組織的分化 將愈傷組織切割成5 mm×5 mm小塊，接種在表2的培養(yǎng)基上。觀察愈傷分化的情況，20 d后統(tǒng)計愈傷分化數。分化系數的計算公式為：分化系數=分化數/接種數。

1.3.4 不定芽的增殖 將種子萌發(fā)后得到的小苗切成10 mm的莖段，分別接種于表3的培養(yǎng)基上。觀察并統(tǒng)計不定芽的增殖的情況，連續(xù)觀察20 d，并計算增殖系數，增殖系數=新芽數/接種數。

1.3.5 生根培養(yǎng) 當小苗長至高約2.0～3.5 cm時，轉接于表4的培養(yǎng)基中。20 d后觀察并統(tǒng)計生根的情況，計算生根率，生根率( %)=生根數/接種數×100。

表3 不定芽增殖的不同培養(yǎng)基

表4 生根培養(yǎng)基

表5 不同消毒處理方式對蝶豆種子無菌萌發(fā)的影響

注：同列數據后不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)。下同。

Note： Different lowercase alphabets in the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same as below.

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS13.0軟件進行差異顯著性測驗(Duncan’s多重比較)。

2 結果與分析

2.1 種子的無菌萌發(fā)

由表5可以看出，隨著酒精表面滅菌時間的增加，污染數、污染率降低，直至為0，其中D1處理污染數、污染率均顯著高于D2和D3處理(P<0.05，下同)，D2和D3處理間差異不顯著(P>0.05，下同)，表明酒精的滅菌時間越長，不同處理間污染數和污染率的差異越不顯著。D2處理發(fā)芽數、發(fā)芽率均顯著高于D1和D3處理，D1和D3處理間差異不顯著，表明發(fā)芽率受酒精滅菌時間的影響表現為先升高后降低，綜上可知， D2處理是最適宜的蝶豆種子滅菌方法，即75 %酒精30 s結合0.1 % HgCl2滅菌10 min時效果最佳，污染率為0，發(fā)芽率為36.67 %。

2.2 愈傷組織的誘導

由表6可知，不同的外植體對愈傷誘導率的影響差異不顯著，即下胚軸、上胚軸、子葉接種在MS培養(yǎng)基的愈傷誘導率均為100.00 %。但是不同接種外植體類型間愈傷分化率均存在顯著差異，愈傷分化率從高到低的順序為：下胚軸>上胚軸>子葉，分別為82.11 %、20.00 %、0。此外，從生長情況記錄可知：上胚軸和下胚軸僅可誘導出愈傷組織，不能直接誘導出不定芽；而子葉可以直接誘導出不定芽，不定芽從子葉頂部出芽。

2.3 愈傷組織的分化

由表7可知：F1處理的分化數和分化系數除與F2處理差異均不顯著外，均顯著高于其他處理；F6處理的分化數和分化系數顯著低于其他處理，其余處理間分化數和分化系數差異均不顯著。由此可見，較低濃度的6-BA對分化數、分化系數無顯著差異，當6-BA濃度達到一定水平時，其對分化數、分化系數的影響有顯著差異，濃度越高，分化數、分化系數越低。在NAA濃度一定的條件下，隨著6-BA濃度的增加，分化數、分化系數的差異不顯著。F1和F6處理間存在顯著差異，F1處理的分化系數遠高于F6處理的分化系數，這結果符合快繁的要求。

表6 蝶豆的愈傷誘導情況

表7 不同激素配比對蝶豆愈傷組織分化的影響

表8 不同培養(yǎng)基對蝶豆不定芽增殖的影響

由此可知：影響愈傷分化的最佳培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.10 mg/L+NAA 0.02 mg/L，分化系數達4.0，愈傷組織上的芽點多，小苗長勢好，健壯。

2.4 不定芽的增殖

從表8可以看出，H2處理的增殖系數顯著高于H1處理，H2與H3的增殖系數無顯著差異，H4、H5、H6的增殖系數無顯著差異，H7、H8、H9的增殖系數無顯著差異。由此表明，蝶豆的不定芽增殖受激素種類和濃度的影響。在相同濃度的IBA條件下，隨著6-BA濃度的升高新芽數、增殖系數在下降，6-BA濃度與不定芽增殖呈負相關；在相同濃度的6-BA條件下，隨著IBA濃度不同增殖系數略有差異，當6-BA濃度為1.50 mg/L或者2.00 mg/L時，IBA的濃度對新芽數、增殖系數的影響不顯著，當6-BA濃度為1.00 mg/L時，IBA濃度為0.50 mg/L時對新芽數、增殖系數的影響最大，小苗的長勢好，植株健壯。綜合增殖系數、幼苗生長狀況可知，蝶豆不定芽增殖的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.50 mg/L，增殖系數為3.75，小苗長勢好，植株健壯。

2.5 生根培養(yǎng)

從表9可以看出，S3與S6處理生根率最高，均為100.00 %，兩者顯著高于其他處理；S1處理生根率最低，為92.20 %，與S4處理差異不顯著，但顯著低于S2、S3、S5、S6處理。S1和S4、S2和S5、S3和S6處理間的生根率差異不顯著。由此表明，蝶豆的生根受基本培養(yǎng)基的影響不顯著，MS、1/2 MS對蝶豆的生根不具有選擇性，而受激素的影響顯著，IBA對蝶豆的生根有重要的調節(jié)作用。進一步分析得出，在同一基本培養(yǎng)上，隨著IBA濃度增加，生根率隨之提高，表現出IBA對蝶豆的生根呈正相關顯著。當IBA濃度為0.30 mg/L時，生根數最多，生根率達最高，為100.00 %。由此可知，蝶豆的最適生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.30 mg/L或者1/2 MS+IBA 0.30 mg/L，生根率100.00 %，小苗長勢好。

3 結論與討論

在本試驗中，蝶豆種子通過無菌萌發(fā)的發(fā)芽率普遍較低，僅有36.67 %，這與本研究團隊之前在常規(guī)條件下的研究結果相一致[4]。雖然無菌播種能夠提供一個適宜的環(huán)境條件，但是種子的萌發(fā)受多種因素的影響，其中自身的特性是主要因素。豆科植物種皮具有不透水的特性，蝶豆作為豆科植物中的一種，也具備這種特性。其萌發(fā)率低，原因可能是種子硬實，有較堅硬的外殼，種子難以吸收水分和氧氣，從而影響了萌發(fā)[4]。盡管種子的萌發(fā)率低，但通過繼代增殖培養(yǎng)，仍然可以達到快速繁殖的目的。

表9 不同培養(yǎng)基對蝶豆生根誘導的影響

植物由外植體誘導體細胞胚胎的發(fā)生分為愈傷途徑和不定芽途徑。愈傷途徑指外植體先脫分化為愈傷組織，再由愈傷組織分化形成叢生芽，然后生根形成完整植株。不定芽途徑指不經愈傷組織階段而直接脫分化產生器官。本研究結果得出，蝶豆的上胚軸和下胚軸僅可誘導出愈傷組織，不能直接誘導出不定芽，此結果和郭剛等[10]、龔真才等[11]對豆科植物苦馬豆的研究相一致。本研究子葉愈傷誘導率為100.00 %，但愈傷分化率分別為0，子葉可以直接誘導出不定芽，不定芽從子葉頂部出芽，意即以子葉為外植體進行組培快繁，僅可通過不定芽途徑，這有可能是植物本身的基因型決定的。利用上胚軸和下胚軸進行不定芽誘導沒有獲得成功，原因可能是：一方面是激素濃度配比不適宜，沒有達到一個較適合的濃度配比。在植物組織培養(yǎng)中，內源激素與外源激素起著重要的調控作用，植物生長調節(jié)劑的種類、水平以及組合的選擇對組織的產生與分化十分重要[12]。因此，利用上胚軸和下胚軸通過不定芽途徑能否建立起組培快繁技術還有待于進一步地研究。另一方面子葉(莖尖)作為生長最快的部位，細胞分裂生長快，生長點較多，內源激素也充足，上胚軸和下胚軸的作為較成熟的部位，其細胞分裂生長較子葉慢，內源激素比子葉的少，因而只能產生愈傷組織，不能直接誘導出不定芽。這也說明了不同外植體在誘導不定芽能力上是存在差別，可能是這種差別影響了愈傷組織的分化能力[13]。由上可知，蝶豆通過愈傷途徑和不定芽途徑均可獲得組培植株。

綜上所述，蝶豆的種子無菌萌發(fā)以75 %酒精表面滅菌30 s結合0.1 %的HgCl2表面滅菌10 min，污染率為0，發(fā)芽率為36.67 %。通過愈傷組織途徑以及不定芽途徑均可建立蝶豆的組培快繁體系。通過愈傷組織途徑，下胚軸、上胚軸、子葉的愈傷誘導率為100.00 %，愈傷分化率分別為：82.11 %、20.00 %、0。愈傷分化的最佳培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.10 mg/L+NAA 0.02 mg/L，分化系數達4.0。通過不定芽途徑，僅子葉可以直接誘導出不定芽，而上胚軸和下胚軸不能直接誘導出不定芽，不定芽增殖的最適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.50 mg/L，增殖系數為3.75。蝶豆組培苗的最佳生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.30 mg/L或者1/2 MS+IBA 0.30 mg/L，生根率達100.00 %。

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(責任編輯 思利華)

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation ofClitoriaternateaL.

YAN Hai-xia,JIANG Yue-xi*,WANG Xiao-guo, HE Jing-zhou, HUANG Chang-yan,DENG Jie-ling, BU Zhao-yang**

(Flower Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007,China)

The suitable medium for varied stages was screened out by axenic germination ofClitoriaternateaL. to provide references for tissue culture and rapid regeneration ofClitoriaternateaL. The results showed that: by the method of 75 % ethanol for 30 s+0.1 % HgCl2for 10 min, the contamination rate was 0 and the germination rate was 36.67 % when the seeds were aseptic budding. The callus induction rate of hypocotyls, epicotyls, and cotyledon was 100.00 % and the rate of callus differentiation was 82.11 %, 20.00 % and 0, respectively. The optimizing medium for callus differentiation was MS+6-BA 0.10 mg/L+NAA 0.02 mg/L. Adventitious buds cannot be induced directly from epicotyl and hypocotyl, but can be induced directly from cotyledon. The optimizing medium for adventitious bud multiplication is MS+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.50 mg/L. The most suitable medium for adventitious root is MS+IBA0.30 mg/L or 1/2MS+IBA0.30 mg/L.

ClitoriaternateaL.; Axenic germination; Callus; Adventitious bud

1001-4829(2016)08-1977-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.041

2016-04-15

廣西科學研究與技術開發(fā)項目(桂科能1598022-1-5，桂科攻1598006-5-8)；廣西農業(yè)科學院科研團隊項目(2015YT89)

閆海霞(1981-)，女，廣西貴港人，碩士，助理研究員，主要從事花卉新品種選育與示范推廣工作；E-mail：yangnv@126.com，*為并列第一作者，蔣月喜(1963-)，男，廣西灌陽人，主要從事花卉新品種選育及示范推廣工作,**為通訊作者。

S682.39

A