劉 靜，袁玉清

( 1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109； 2．溫州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江 溫州 325035 )

菲律賓蛤仔血細(xì)胞透射電鏡樣品制備固定液的篩選

劉 靜1,2，袁玉清1

( 1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109； 2．溫州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江 溫州 325035 )

對(duì)樣品的固定是透射電鏡樣品制備的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過在透射電鏡下觀察和比較不同固定液固定菲律賓蛤仔血細(xì)胞后血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，初步篩選出適合菲律賓蛤仔血細(xì)胞透射電鏡制樣的固定液。試驗(yàn)結(jié)果表明，固定液可直接影響到透射電鏡制樣品質(zhì)的高低，2.5%、5%戊二醛低滲固定液引起了血細(xì)胞細(xì)胞器的腫脹，其中線粒體腫脹尤為嚴(yán)重，腫脹程度2.5%戊二醛組大于5%戊二醛組；等滲固定液固定的血細(xì)胞細(xì)胞器不腫脹，但等滲5%戊二醛與4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液對(duì)血細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)保存不佳，而2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液對(duì)血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)保存較好，表現(xiàn)為細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)豐富且分布均勻，細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞核等細(xì)胞器固定效果較好。試驗(yàn)得出，低滲固定液會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，線粒體對(duì)滲透壓的要求較其他細(xì)胞器更加敏感；提高固定液含量會(huì)減輕因低滲引起的細(xì)胞腫脹程度，但高含量固定液會(huì)損壞細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)，故適合的樣品固定液是細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)較好保存的基礎(chǔ)。

菲律賓蛤仔；血細(xì)胞；透射電鏡；制樣固定液

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)是我國(guó)南北沿海廣泛分布，且較為重要的海水經(jīng)濟(jì)貝類，其免疫系統(tǒng)屬非特異性免疫，主要有血細(xì)胞免疫和體液免疫兩部分組成，其中血細(xì)胞通過吞噬、凝集和包囊等作用清除異物和自身?yè)p傷、死亡的細(xì)胞，還能夠通過產(chǎn)生各種非特異性體液因子來參與宿主的免疫防御系統(tǒng)，在貝類的免疫防御過程中起著重要的作用[1-2]。目前關(guān)于菲律賓蛤仔血細(xì)胞形態(tài)、免疫功能的研究還較少[3-7]。利用透射電鏡可以揭示生物細(xì)胞中各種細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)，而且可以對(duì)生物大分子，特別是核酸、蛋白質(zhì)、酶、抗原等在超微結(jié)構(gòu)中準(zhǔn)確定位、定性，但是目前國(guó)內(nèi)外尚無菲律賓蛤仔血細(xì)胞透射電鏡樣品制備的研究。

超薄切片技術(shù)是最常用的透射電鏡樣品制備技術(shù)，樣品制備過程包括取材、樣品固定、脫水、滲透、包埋、超薄切片、染色等環(huán)節(jié)，其中樣品固定的好壞可直接影響到透射電鏡制樣的成敗和品質(zhì)的高低，甚至?xí)斐稍囼?yàn)假象，影響試驗(yàn)結(jié)果，因此對(duì)樣品固定液的選擇是獲得理想透射電鏡觀察結(jié)果的關(guān)鍵條件之一。本文選取5種不同樣品固定液對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞進(jìn)行固定，將制好的血細(xì)胞超薄切片在透射電鏡下進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察和比較，從而篩選出適合菲律賓蛤仔血細(xì)胞透射電鏡制樣的固定液，為今后利用透射電鏡研究菲律賓蛤仔及其他海產(chǎn)雙殼貝類的血細(xì)胞分類、免疫學(xué)功能、病理學(xué)等方面提供可靠的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菲律賓蛤仔購(gòu)自青島城陽水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，殼長(zhǎng)(3.52±1.97) cm，體質(zhì)量(8.23±0.197) g。試驗(yàn)用蛤仔暫養(yǎng)于塑料水箱中，水溫約16 ℃，每日早晚各換新鮮海水1次，暫養(yǎng)3 d后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同固定液配方

中貝類血細(xì)胞透射電鏡制樣固定液，并有所改進(jìn)，從制樣固定液的組成、含量和滲透壓方面考慮，選取了5種制樣固定液，其配方見表1。

表1 5種不同貝類血細(xì)胞透射電鏡制樣用的固定液配方

1.2.2 血淋巴的抽取與制備

選取健康有活力的菲律賓蛤仔，無菌海水沖洗后，用1 mL的無菌注射器預(yù)先吸入一定量預(yù)冷固定液, 再?gòu)姆坡少e蛤仔閉殼肌處1∶1抽取血淋巴，每個(gè)試驗(yàn)組抽取3枚菲律賓蛤仔的血淋巴，迅速混勻，冰上保存。抽取的血淋巴4 ℃，3000 r/min 離心10 min，去掉上清液，血細(xì)胞沉淀立即加入4 ℃新鮮固定液固定。每種固定液重復(fù)制樣3次。

1.2.3 透射電鏡樣品制備

血細(xì)胞在各自固定液中4 ℃固定過夜，3000 r/min離心10 min，血細(xì)胞沉淀用2.5%的瓊脂預(yù)包埋后，0.1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液清洗血細(xì)胞，再用1%鋨酸后固定血細(xì)胞2 h，0.1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液清洗血細(xì)胞后，進(jìn)行丙酮梯度脫水，Spi-pon812環(huán)氧樹脂樹脂浸透包埋以及聚合，Leica UC7超薄切片機(jī)切片，切片厚度70 nm，超薄切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染液雙染色，日立HT7700型透射電鏡觀察并拍照，加速電壓80 kV。

1.2.4 試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)方法和標(biāo)準(zhǔn)

透射電鏡下觀察和比較不同制樣固定液固定菲律賓蛤仔血細(xì)胞后其超微結(jié)構(gòu)的變化時(shí)，主要觀察細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、細(xì)胞核等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)保存是否良好。其固定良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征參照表2。

表2 固定良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征

2 結(jié) 果

2.1 低滲2.5%戊二醛固定液對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

經(jīng)2.5%戊二醛固定液處理的細(xì)胞整體完整，但細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)分布不均勻，部分區(qū)域呈現(xiàn)空白(圖1a)；線粒體腫脹，基質(zhì)淺，線粒體嵴變少；腫脹嚴(yán)重的線粒體基質(zhì)顆粒消失，基質(zhì)中出現(xiàn)多個(gè)亮區(qū)，線粒體嵴亦消失，部分線粒體外膜出現(xiàn)破裂(圖1b)；大部分高爾基體保存完好，少數(shù)高爾基體囊膜膨脹模糊不清(圖1c)；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體顆粒散落，顯示不清，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜不完整(圖1d)，細(xì)胞內(nèi)部分顆粒腫脹，膜破裂(圖1e)；細(xì)胞核異染色質(zhì)保存較好，部分常染色質(zhì)部位出現(xiàn)空白區(qū)域(圖1d)；細(xì)胞核核周隙寬度不均勻，外膜呈波浪狀，局部腫脹呈山丘狀(圖1f)。

圖1 2.5%戊二醛固定液對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響N：細(xì)胞核；Mi：線粒體；G：高爾基體；RE：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；GR：顆粒.

2.2 低滲與等滲5%戊二醛固定液對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

兩種固定液固定的血細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、線粒體基質(zhì)和核基質(zhì)豐富。低滲5%戊二醛固定液組中細(xì)胞大部分線粒體嵴顯示不清，部分線粒體腫脹、外膜發(fā)生破裂(圖2a)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上核糖體部分散落，部分核膜膨脹(圖2b)，腫脹程度低于2.5%戊二醛固定液；等滲5%戊二醛固定液固定后細(xì)胞無腫脹現(xiàn)象，但細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的膜性精細(xì)結(jié)構(gòu)保存不佳，表現(xiàn)為大部分高爾基體膜、核膜顯示不清(圖2c)，線粒體外膜、線粒體嵴、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜不清晰，但粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上負(fù)載的核糖體豐富，清晰可見(圖2d)。

圖2 低滲與等滲5%戊二醛固定液對(duì)血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響N：細(xì)胞核；Mi：線粒體；RE：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；★：細(xì)胞核膨脹部位.

2.3 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液固定血細(xì)胞后，細(xì)胞基質(zhì)均勻豐富，各細(xì)胞器精細(xì)結(jié)構(gòu)保存較好，無腫脹現(xiàn)象(圖3a)。細(xì)胞質(zhì)膜三層結(jié)構(gòu)顯示清晰，線粒體基質(zhì)豐富，線粒體嵴清晰可見(圖3b)；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保存較完整，負(fù)載的核糖體清晰(圖3c)；高爾基體保存較好(圖3d)；細(xì)胞中花瓣?duì)畹念w粒外膜和基質(zhì)緊密貼合(圖3e)；核膜清晰，核基質(zhì)豐富(圖3f)。

圖3 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響N：細(xì)胞核；Mi：線粒體；RE：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；G：高爾基體；GR：顆粒.

2.4 4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液固定的血細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)不均勻，胞質(zhì)中部分基質(zhì)明顯變淺，但線粒體基質(zhì)和核基質(zhì)保存較好(圖4a)。細(xì)胞外膜及胞質(zhì)內(nèi)膜精細(xì)結(jié)構(gòu)保存不佳，表現(xiàn)為大部分線粒體外膜和線粒體嵴顯示不清(圖4b)，高爾基體大部分保存不完整，核膜雙層膜結(jié)構(gòu)顯示不清(圖4c)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜顯示不清晰，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上核糖體顯示清晰(圖4d)。

圖4 4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響N：細(xì)胞核；Mi：線粒體；G：高爾基體；RE：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng).

3 討 論

利用透射電鏡可觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，探明細(xì)胞的功能以及生理調(diào)節(jié)機(jī)制，隨著透射電鏡分辨率的不斷提高，其清晰度已不完全取決于顯微鏡的分辨率，而是很大程度上取決于樣品制備的好壞。在貝類血細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)研究中，多數(shù)學(xué)者應(yīng)用了超薄切片技術(shù)，但制樣細(xì)節(jié)不盡相同，主要表現(xiàn)為固定方式、樣品固定液種類、固定時(shí)間、固定溫度、緩沖液種類及包埋樹脂等方面存在差異[10-11,13-20]。本試驗(yàn)在其他條件一致的前提下，主要研究了固定液種類對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。

透射電鏡制樣過程中，對(duì)樣品固定的目的是盡可能使細(xì)胞中的各種細(xì)胞器以及大分子結(jié)構(gòu)保持生活狀態(tài)，并且牢固地固定在其原來所在的位置上，避免在以后的清洗和脫水時(shí)溶解和流失，使結(jié)構(gòu)更加清晰。樣品固定是一種復(fù)雜的化學(xué)過程，固定液的組成、含量、滲透壓、pH等都會(huì)對(duì)樣品的固定效果產(chǎn)生影響。

在超薄切片制樣中，固定方式一般采用雙固定，即醛類固定液前固定，鋨酸后固定，醛類固定液一般選用戊二醛和多聚甲醛，兩者混合使用效果更佳[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液效果最佳，證實(shí)了這一觀點(diǎn)，但同時(shí)本文研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)兩者混合使用時(shí)，必須要求多聚甲醛和戊二醛的含量配比合適才能得到較好的固定效果。相同的固定時(shí)間，較低含量的固定液對(duì)樣品固定可能不徹底，而較高含量的固定液容易毀壞酶的活性和細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)[21]，比較本試驗(yàn)中2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液與4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液的組成，除了多聚甲醛含量不同，其余條件均一致，但是2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液的效果遠(yuǎn)好于4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液，筆者認(rèn)為可能由于4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液中多聚甲醛含量高引起的；試驗(yàn)結(jié)果亦顯示5%戊二醛含量的固定液試驗(yàn)組血細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)保存亦不佳。由此筆者推測(cè)4%多聚甲醛-2.5%戊二醛、5%戊二醛固定液對(duì)于菲律賓蛤仔血細(xì)胞而言固定劑的含量太高，破壞了血細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)。

一般來說，低滲固定液容易引起組織腫脹，而高滲固定液容易造成組織收縮，但也有學(xué)者提出調(diào)解滲透壓平衡是不必要的，因?yàn)闈B透壓平衡只存在于活細(xì)胞中，細(xì)胞一旦和固定液接觸，即被固定并死亡，因此失去了滲透壓平衡調(diào)節(jié)的能力[21]。在已發(fā)表的貝類血細(xì)胞透射電鏡制樣的文獻(xiàn)中，有學(xué)者在固定液和緩沖液中通過添加蔗糖[10]、氯化鈉[11]或者海水[17-18]來調(diào)節(jié)固定液的滲透壓平衡，而有學(xué)者則沒考慮固定液滲透壓[9]。菲律賓蛤仔屬于海水貝類，其體內(nèi)滲透壓要比淡水生物的滲透壓要高，本文選取的低滲2.5%、5%戊二醛固定液沒有考慮到固定液滲透壓，細(xì)胞器發(fā)生腫脹，尤其是線粒體腫脹明顯，提高戊二醛的含量，線粒體的腫脹程度會(huì)降低，而等滲固定液通過添加蔗糖或NaCl調(diào)節(jié)了固定液的滲透壓，細(xì)胞沒有發(fā)生腫脹。這充分說明了在選擇菲律賓蛤仔血細(xì)胞固定液時(shí)一定要考慮固定液和緩沖體系的滲透壓，調(diào)節(jié)固定液的滲透壓和固定樣品滲透壓一致，同時(shí)試驗(yàn)表明細(xì)胞內(nèi)線粒體相比其他細(xì)胞器對(duì)固定液滲透壓變化敏感。

通過本研究，筆者發(fā)現(xiàn)，固定液滲透壓、含量對(duì)菲律賓蛤仔血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響較大，低滲固定液使細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器腫脹，尤其是線粒體較其他細(xì)胞器更加敏感，提高固定液的含量能部分緩解細(xì)胞器的腫脹，但是高含量的固定液對(duì)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)保存不佳。所以合適的固定液含量以及離子組成是細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)較好保存的關(guān)鍵。

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ScreeningofSpecimenPreparationandFixativesofManilaClamRuditapesphilippinarumHaemocytesforTransmissionElectronMicroscopy

LIU Jing1,2, YUAN Yuqing1

( 1.Central Laboratory, Qingdao Agriculture University, Qingdao 266109,China；2.School of Environmental Science and Public Health，Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035，China )

Fixation is the key step of the specimen preparation for transmission electron microscopy. The aim of this paper is to investigate and compare the influence of 5 different fixatives on the ultrastructure alterations of haemocytes in Manila clamRuditapesphilippinarumusing transmission electron microscope in order to find the proper fixative for Manila clam. The results showed that fixative affected the haemocyte ultrastructure directly. The haemocytes were swelled in 2.5% and 5% glutaraldehyde groups, the higher in 2.5% glutaraldehyde groups than in 5% glutaraldehyde fixative treatments, and higher swollen in the haemocytes mitochondria than in the other organelles. No organelles swelling was found in isotonic fixative treatments, while the inner structures of the haemocytes were not preserved very well in 5% glutaraldehyde fixative with 7% saccharose groups and 4% paraformaldehyde-2.5% glutaraldehyde fixative treatments, especially the endomembrane system. In 2% paraformaldehyde-2.5% glutaraldehyde fixative treatments, the haemocytes had better ultrastructure than in other groups, with clear outer membrane structure of haemocytes. The cytoplasmic matrix was rich and evenly distributed, as well the ultrastructure of the organelles such as mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus and the nucleus were better preserved. From this study we can concluded that the hypotonic fixative could cause haemocytes swelling and that the mitochondria are more sensitive to the fixative osmotic pressure than other organelles. Raised fixative concentration reduces the cell swelling degree, but the high fixative concentration is not benefit to the haemocytes ultrastructure. Thus the suitable fixative is the foundation of the cell ultrastructure preservation.

Ruditapesphilippinarum; haemocyte; transmission electron microscope; sample fixative

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.05.013

S917.4

A

1003-1111(2016)05-0535-06

2016-03-01；

2016-05-06.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31302166)；浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(J2013004).

劉靜(1982—)，女，助理研究員，博士研究生；研究方向：貝類免疫學(xué). E-mail：liujingandlele@163.com.