丁 利，代小梅，方振華，汪繼超，史海濤

( 1. 海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571158；2. 海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，海南 海口 570216 )

龜致病性維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌雙重PCR檢測(cè)方法的建立

丁 利1，代小梅1，方振華2，汪繼超1，史海濤1

( 1. 海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571158；2. 海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，海南 ?？?570216 )

應(yīng)用2對(duì)特異性引物，通過對(duì)反應(yīng)條件和體系的優(yōu)化，成功建立了能快速檢測(cè)維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌兩種病原的雙重PCR方法。研究結(jié)果表明，該方法特異性強(qiáng)，僅對(duì)龜鱉維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌有擴(kuò)增，而對(duì)其他龜鱉常見病原無擴(kuò)增；該方法對(duì)維氏氣單胞菌最低檢測(cè)核酸質(zhì)量濃度為1.75×10-3ng/μL，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌最低檢測(cè)核酸質(zhì)量濃度為3.96×10-3ng/μL，檢出率較傳統(tǒng)檢測(cè)方法高。該研究所建立的雙重PCR方法靈敏度高、特異性好，可為臨床龜鱉維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌感染的診斷和流行病學(xué)調(diào)查等提供幫助。

維氏氣單胞菌；鮑曼不動(dòng)桿菌；雙重PCR

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)屬于弧菌科、氣單胞菌屬中近年來發(fā)現(xiàn)的新種，可以引起人的胃腸炎、腦膜炎、腹瀉、菌血癥等疾病[1-2]。近年來，越來越多的報(bào)道表明，其可感染水生動(dòng)物并引發(fā)疾病，國內(nèi)學(xué)者已從框鏡鯉(Cyprinuscarpio)、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)、日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)和泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)等水生動(dòng)物體內(nèi)分離到具有較強(qiáng)致病性的維氏氣單胞菌[3-7]。鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)是奈瑟氏球菌科、不動(dòng)桿菌屬中的一種革蘭陰性球桿菌，該菌能通過多種方式感染人和其他動(dòng)物[8-9]，目前研究發(fā)現(xiàn)，不動(dòng)桿菌也存在于患病的水生動(dòng)物體內(nèi)[10-13]。筆者自患病龜體內(nèi)同時(shí)分離出維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌，通過動(dòng)物回歸試驗(yàn)證實(shí)這兩種菌對(duì)龜鱉有較強(qiáng)的致病性。兩種病原菌在龜鱉發(fā)病癥狀、剖檢變化等方面有較多的共同點(diǎn)，表現(xiàn)為腹甲和背甲有明顯的潰爛，頸部和四肢有大小不一的白點(diǎn)；剖檢腹腔有惡臭，肝脾腫大，有瘀血，質(zhì)脆易碎，呈紫黑色[14]。該病原常呈混合感染，傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)很難準(zhǔn)確、快速地作出判斷。因此建立一種鑒別維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌及兩種病原混合感染的PCR檢測(cè)方法十分必要。該研究選擇維氏氣單胞菌gryB基因及鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因保守序列為靶基因設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，建立了快速鑒別診斷維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌及其混合感染的雙重PCR診斷方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

龜源維氏氣單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)、假單胞菌(Pseudomonadaceae)均為實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

1.2 主要試劑

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒；ExTaq酶(5 U/μL)、pMD18-T載體為Promega公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞購自上海潤成生物科技有限公司；dNTP、DL2000 DNA Marker等購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中登錄的維氏氣單胞菌gryB基因及鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因保守序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物(表1)，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 PCR引物的核苷酸序列、擴(kuò)增長度及登錄號(hào)

1. 4 DNA模板的制備

將維氏氣單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌在普通營養(yǎng)瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，取單個(gè)菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，取菌液2 mL按照細(xì)菌DNA 提取試劑盒的說明書提取DNA，待檢病料組織DNA的提取步驟按照說明書進(jìn)行。

1. 5 PCR擴(kuò)增及雙重反應(yīng)條件的優(yōu)化

分別針對(duì)維氏氣單胞菌gryB基因及鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因2對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件與體系參照ExTaq酶試劑推薦，1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，目的片段進(jìn)行凝膠回收與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化，挑取單個(gè)陽性菌落并進(jìn)行重組質(zhì)粒(pMD-gryB和pMD-rpoB)的提取，質(zhì)粒經(jīng)PCR 鑒定后由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。采用2對(duì)特異性引物，對(duì)反應(yīng)的退火溫度、dNTP濃度、Mg2+濃度、引物濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳反應(yīng)體系。按25 μL反應(yīng)體系：退火溫度分別為54、55、56、57、58、59、60 ℃和61 ℃，dNTP(2.5 mmol/L)分別為1、1.5、2、2.5 μL，Mg2 +(25 mmol/L)分別為1、1.5、2 μL和2.5 μL，引物(10 pmol/L)分別為0.5、1.0、1.5 μL和2.0 μL進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，優(yōu)化一項(xiàng)時(shí)保持其他項(xiàng)參數(shù)不變。

1. 6 特異性試驗(yàn)

分別用龜源維氏氣單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、松鼠葡萄球菌、摩氏摩根菌、假單胞菌基因組DNA 作為模板，按優(yōu)化好的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分析特異性結(jié)果。

1.7 敏感性試驗(yàn)

提取維氏氣單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌的DNA，經(jīng)核酸蛋白定量儀測(cè)定質(zhì)量濃度。將2種菌的DNA等量混勻作為模板，并做10 倍比稀釋，用建立的雙重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得雙重PCR 反應(yīng)的敏感性。

1.8 PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

采集來自海南省?？凇|方市等地區(qū)不同養(yǎng)龜場發(fā)病龜?shù)母闻K組織參照1.4方法進(jìn)行DNA模板的制備并進(jìn)行雙重和單重PCR檢測(cè)，并與傳統(tǒng)方法的鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。

1.9 臨床病料的常規(guī)檢測(cè)方法

無菌采取疑似病料，低溫條件下研磨后，用無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，無菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，再挑取單個(gè)菌落在無菌條件下進(jìn)行劃線分離、培養(yǎng)，重復(fù)以上步驟，直至菌落特征相同時(shí)，再挑取單個(gè)菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，觀察菌落形態(tài)及染色特點(diǎn)，并將分離菌純培養(yǎng)物進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定。

2 結(jié) 果

2. 1 PCR擴(kuò)增及雙重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

通過用2對(duì)特異性引物分別擴(kuò)增維氏氣單胞菌gryB基因及鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因，出現(xiàn)379、752 bp 大小的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。目的片段測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，測(cè)序結(jié)果與NCBI 中維氏氣單胞菌gryB基因及鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因序列的同源性分別為96%和95% 。

分別對(duì)gryB基因和rpoB基因的引物濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果為：10xPCR緩沖液2.5 μL，25 mmol/L的Mg2+2 μL，2.5 mmol/L的dNTP 2 μL，5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.25 μL，gryB基因上、下游引物(10 pmol/L)各0.75 μL，rpoB基因上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL，模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)2條清晰的條帶，大小分別約379 bp 和752 bp(圖1)。

圖1 gyrB、rpoB基因單獨(dú)和雙重PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，維氏氣單胞菌gryB基因及鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因出現(xiàn)2 條清晰條帶，大小分別約379 bp 和752 bp，而龜源假單胞菌、摩氏摩根菌、松鼠葡萄球菌及陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出目的片段(圖2)。

圖2 雙重PCR 的特異性試驗(yàn)結(jié)果注：M,DL2000 DNA Marker; 1,鮑曼不動(dòng)桿菌; 2,維氏氣單胞菌; 3,鮑曼不動(dòng)桿菌和維氏氣單胞菌; 4,假單胞菌; 5,摩氏摩根菌; 6,松鼠葡萄球菌; 7,陰性對(duì)照.

2.3 敏感性試驗(yàn)

分別對(duì)維氏氣單胞菌DNA(17.5 ng/μL)和鮑曼不動(dòng)桿菌的DNA(39.6 ng/μL)進(jìn)行100～106倍比稀釋作為擴(kuò)增模板，模板混合物雙重PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析表明，雙重PCR對(duì)維氏氣單胞菌最低檢測(cè)核酸質(zhì)量濃度為1.75×10-3ng/μL，鮑曼不動(dòng)桿菌最低檢測(cè)核酸質(zhì)量濃度為3.96×10-3ng/μL(圖3)。

圖3 雙重PCR的敏感性試驗(yàn)注：M，DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000; 1～7，模板DNA依次稀釋100～106倍.

2.4 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

對(duì)臨床疑似病料進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)和PCR方法檢測(cè)，36份病料，采用常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)方法檢出維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌分別為11份和14份，檢出率分別為30.5%和38.9%；雙重PCR方法檢測(cè)到維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌感染樣品分別為13份和15份，陽性檢出率分別為36.1%和41.7%，混合感染陽性樣品6 份，陽性檢出率為16.7%(表2)。這與單一PCR的陽性檢出率一致，且敏感度高于常規(guī)檢測(cè)方法。

表2 送檢樣品的檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌作為重要條件致病菌可引發(fā)多種動(dòng)物感染[9]，也有發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌存在于患病的水生動(dòng)物體內(nèi)[10-12]。目前研究發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌除感染人外，還可引起多種水生動(dòng)物患病[3-5]，本研究發(fā)現(xiàn)龜維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌是嚴(yán)重危害我國龜鱉養(yǎng)殖業(yè)的兩種細(xì)菌性傳染病，在臨床上癥狀接近且經(jīng)常呈現(xiàn)混合感染，給我國龜鱉養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。

維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法包括形態(tài)學(xué)檢測(cè)、生理生化特征檢測(cè)和血清學(xué)鑒定等，這些檢測(cè)手段不僅工作量大，且耗時(shí)較長。目前也有針對(duì)維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌建立的雙重PCR檢測(cè)方法[15-16]，但建立的方法均是針對(duì)單一菌的檢測(cè)。維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌引發(fā)龜鱉發(fā)病的研究幾乎未見，對(duì)疾病的快速診斷增加了難度，并且作為主要病原菌往往混合感染，導(dǎo)致龜鱉發(fā)病。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法已不能滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)上的診斷要求[17]。研究特異性強(qiáng)、靈敏度高的快速診斷技術(shù)和方法應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖已十分必要。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，該研究針對(duì)龜維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌所建立的雙重PCR檢測(cè)方法操作簡單，具有較好的特異性、穩(wěn)定性和較高的敏感性和準(zhǔn)確性，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)上述兩種病原的同步快速檢測(cè)和區(qū)分診斷，為臨床診斷提供參考。

本次研究檢測(cè)引物是參照維氏氣單胞菌的gyrB 和鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因序列設(shè)計(jì)的。近年來，gyrB基因和rpoB基因常分別被應(yīng)用于氣單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬菌種分類鑒定[18-19]。該研究所設(shè)計(jì)的2對(duì)特異性引物在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下分別能從維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌中擴(kuò)增出379 bp 和752 bp的2個(gè)DNA片段，而龜源松鼠葡萄球菌、摩氏摩根菌、假單胞菌及陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出目的條帶，說明建立的雙重PCR方法具有較高的種特異性。

本次研究對(duì)建立的雙重PCR診斷方法的敏感性、臨床實(shí)用性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，所建立的雙重PCR對(duì)維氏氣單胞菌最低檢測(cè)核酸質(zhì)量濃度為1.75×10-3ng/μL，鮑曼不動(dòng)桿菌最低檢測(cè)核酸質(zhì)量濃度為3.96×10-3ng/μL。相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法對(duì)兩種菌的檢出率高。這說明本試驗(yàn)所建立的雙重PCR檢測(cè)方法可為龜鱉維氏氣單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌感染的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供幫助。

[1] Figueras M J, Aldea M J, Ferna'ndez N, et al.Aeromonashemolytic uremic syndrome. A case and a review of the literature [J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2007, 58(2):231-234.

[2] Fraisse T, Lechiche C, Sotto A, et al.Aeromonasspp. infections: retrospective study in Nimes University Hospital, 1997—2004 [J]. Pathol Biol, 2008, 56(2):70-76.

[3] 李聰，蔡巖，周永燦，等. 海南羅非魚致病性維氏氣單胞菌分離鑒定及藥敏特性研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2015, 34(10):640-646.

[4] 房海, 陳翠珍, 張曉君, 等. 中華絨螯蟹病原維氏氣單胞菌的檢驗(yàn)[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào),2008,24(1)：45-49.

[5] 張德鋒, 劉禮輝, 李寧求, 等. 我國南方地區(qū)魚源氣單胞菌不同種類的流行特征[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2015,34(11):673-682.

[6] 秦蕾, 徐靜, 張曉軍. 泥鰍的凡隆氣單胞菌感染[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24(12)：1100-1102.

[7] 潘曉藝, 沈錦玉, 李建應(yīng), 等. 青蝦“軟殼綜合癥”病原及其特性[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2009，36(10)：1571-1576.

[8] Méndez J A, Mateos J, Beceiro A, et al. Quantitative proteomic analysis of host-pathogen interactions:a study ofAcinetobacterbaumanniiresponses to host airways[J]. BMC Genomics，2015, 16(1):1-21.

[9] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 4版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2007.

[10] 林溪, 田國明, 朱凝瑜, 等. 浙江地區(qū)異育銀鯽內(nèi)臟攜帶細(xì)菌多樣性與毒力基因分析[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2014, 33(12):785-789.

[11] 顧天釗, 陸承平, 陳懷青. 鮑氏不動(dòng)桿菌—鱖魚暴發(fā)性死亡的新病原[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1997, 24(2):104-106.

[12] 顧澤茂, 柳陽, 陳昌福, 等. 鮑曼不動(dòng)桿菌斑點(diǎn)叉尾鮰株的分離與鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 24(4):489-493.

[13] 陸文浩, 陳輝, 鄒勇, 等. 銀鯽不動(dòng)桿菌病原菌鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2010, 29(3):156-161.

[14] 丁利， 黎俊瑜， 代小梅， 等. 烏龜鮑曼不動(dòng)桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2016，35(4)：426-430.

[15] 邊宇, 錢宏偉, 孟慶峰, 等. 框鏡鯉致病性維氏氣單胞菌雙重PCR 檢測(cè)方法的建立[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 35(4):304-307.

[16] 閆中強(qiáng), 沈定霞, 羅燕萍, 等. 多重PCR方法檢測(cè)多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌基因型[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2008, 26(6):422-424.

[17] 李莉, 陳穎, 張超, 等. 水產(chǎn)動(dòng)物氣單胞菌鑒定方法研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2015, 34(2):128-134.

[18] Chacon M R,Castro-Escarpulli G,Soler L,et al. A DNA probe specific forAeromonascolonies [J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2002, 44(3):221-225.

[19] 王建峰, 傅鷹, 王海萍, 等. rpoB基因在不動(dòng)桿菌屬菌種鑒定中的應(yīng)用[G]//中華醫(yī)學(xué)會(huì)，浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)微生物與免疫學(xué)分會(huì)，等.中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國臨床微生物學(xué)術(shù)年會(huì)暨第九屆全球華人臨床微生物與感染癥學(xué)術(shù)論壇暨2013年浙江省醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)及醫(yī)學(xué)病毒學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì).杭州：中華醫(yī)學(xué)會(huì)，2013：103.

EstablishmentofDuplexPCRforDetectionofAeromonasveroniiandAcinetobacterbaumanniifromTurtles

DING Li1, DAI Xiaomei1, FANG Zhenhua2, WANG Jichao1, SHI Haitao1

( 1. College of Life Sciences, Hainan Normal University, Haikou 571158, China;2. School of Biological Engineering, Hainan College of Vocation and Technique, Haikou 570216, China )

In this study, a duplex PCR (dPCR) was established and optimized to detect pathogenic bacteriaAeromonasveroniiandAcinetobacterbaumanniisimultaneously in turtles, and two sets of specific primers were designed for development of the duplex PCR. After optimization of PCR components and reaction profile, a duplex PCR method was established. The results showed that the assay is highly specific toA.veroniiandA.baumannii, and no-target pathogens were detected with the minimum detectable nucleic acid concentration of 1.75×10-3ng/μL inA.veroniiand 3.96×10-3ng/μL inA.baumannii, more sensitive than conventional methods. The duplex PCR established in this study is specific and sensitive, and will be useful for clinical detection and identification ofA.veroniiandA.baumannii.

Aeromonasveronii;Acinetobacterbaumannii; duplex PCR

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.05.023

S947

A

1003-1111(2016)05-0587-04

2016-02-16；

2016-05-03.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31502036, 31372228)；海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(314076, 20153086)；海南省高等學(xué)校研究項(xiàng)目(Hnky2016-15).

丁利(1982—)，女，副教授，博士；研究方向：動(dòng)物疾病. E-mail: dingli705@163.com.通訊作者：史海濤(1963—)，男，教授，博士生導(dǎo)師；研究方向：龜鱉生態(tài)學(xué)及保護(hù)生物學(xué). E-mail: haitao-shi@263.net.