周 靜，楊蘇文，方小波，方 蓉，吳榮歸，冉永姣，劉紅美▲

(1貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2貴陽市開陽縣人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 貴陽 550300)

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照波的植物組織培養(yǎng)研究*

周 靜1，楊蘇文2，方小波1，方 蓉1，吳榮歸1，冉永姣1，劉紅美1▲

(1貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2貴陽市開陽縣人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 貴陽 550300)

目的：建立照波組織培養(yǎng)體系。方法：以照波莖段為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，通過添加不同的植物生長(zhǎng)物質(zhì)種類和濃度配比，篩選各階段最適宜的培養(yǎng)基。結(jié)果：在MS+NAA0.1mg/L+ 6 -BA1.0mg/L的培養(yǎng)基組合中利于愈傷組織誘導(dǎo)，在MS+NAA0.05mg/L+ 6 -BA0.3mg/L的培養(yǎng)基中有較多不定芽形成。MS+NAA0.1mg/L培養(yǎng)基為最佳的誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基，生根苗移栽成活率達(dá)到90 %，在1/2MS+NAA0.06mg/L和 1/2MS+NAA0.03mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)60天后可見黃色花苞形成。結(jié)論：試驗(yàn)初步建立了照波組織培養(yǎng)體系。

照波，莖段，愈傷組織，組織培養(yǎng)

照波(Bergeranthus)為番杏科照波屬的多年生草本植物，是番杏科多肉植物中的小屬，又名仙女花。肉質(zhì)葉短錐形，叢生，對(duì)生葉基部聯(lián)合成肉質(zhì)鞘，葉正面扁平，背面棱凸，葉頂端尖。葉表皮薄，有許多透明的疣。葉高2 cm～5 cm，基部聯(lián)合。幼株單生，老株則密集叢生?；◤膬扇~的中縫開出，黃色花，直徑約2 cm～3 cm，每株只開一花，群生開花非常壯觀[1]。因其小巧精致，葉片和花卉觀賞性較強(qiáng)，具有防輻射功能，目前，多肉植物在花卉市場(chǎng)銷售中所占比例越來越高。國(guó)內(nèi)外有較多企業(yè)進(jìn)行種植銷售。據(jù)調(diào)查，美國(guó)一盆照波銷售價(jià)格達(dá)4美元左右。多肉植物食藥用價(jià)值目前也正在研究中，市場(chǎng)需求前景較大[2]，此外，多肉植物葉片還可用于蛋白分離提取研究[3]。但目前，照波多采用種子和分株繁殖，存在繁殖系數(shù)較低，擴(kuò)繁速度較慢等問題，無法滿足市場(chǎng)生產(chǎn)需求。因而，應(yīng)用植物組織培養(yǎng)方法建立照波組織培養(yǎng)方法體系較為重要。對(duì)于多肉植物組織培養(yǎng)研究，主要集中在對(duì)于仙人掌、玉露等研究[4，5]，未見有關(guān)多肉植物照波組織培養(yǎng)研究相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)將以市面銷售的照波為研究材料，篩選最佳的激素組合誘導(dǎo)照波愈傷組織和不定芽的發(fā)生以及生根開花培養(yǎng)基篩選及最后煉苗出瓶。以期為規(guī)模化繁殖栽培降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)材料購(gòu)于貴陽市花鳥市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為黃花照波(Bergeranthusmulticeps)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)使用試劑：6—BA、NAA 植物生長(zhǎng)激素及配制大量元素相關(guān)化學(xué)試劑均購(gòu)自貴州凱信生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體處理

(1)外植體選擇

將照波置于植物組織培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)一周左右，待莖段生長(zhǎng)長(zhǎng)度在1 cm左右時(shí)，選取生長(zhǎng)良好、植株健壯的照波莖段作為外植體。用軟毛刷小心清除植株表面雜質(zhì)，流水下沖洗1 h左右，置于潔凈容器中，待消毒處理。

(2)外植體消毒

將流水沖洗潔凈的外植體進(jìn)行消毒處理，75 %酒精浸泡8～10 s，無菌水沖洗3～4次，每次2～3 min；3.0 %次氯酸鈉消毒8～10 min，無菌水沖洗4～5次，每次2～3 min；消毒后的無菌材料置于無菌濾紙上吸干水分，將照波莖段切成0.5 cm小段接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上(MS + 3 %蔗糖 + 0.9 %瓊脂，pH5.9)，每個(gè)消毒方案接種10塊外植體，篩選適宜照波外植體消毒最佳方案。

1.2.2 愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)

(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇

將消毒好的照波莖段接種于以MS為基本培養(yǎng)基，選取不同濃度的NAA(萘乙酸)、6-BA(6-芐基腺嘌呤)的外源激素進(jìn)行配比。從中篩選出最佳誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽培養(yǎng)基。

(2)培養(yǎng)條件及方法

選取生命活力較強(qiáng)無污染的莖段，接種到愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每種外源激素配比培養(yǎng)基中接種10瓶，培養(yǎng)25 d以后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)分析。

以MS為基本培養(yǎng)基，不同處理組合激素濃度(表2)，蔗糖3.0 %，瓊脂粉0.8～0.9 %，pH值5.8～6.0。溫度(24±2℃)，光照強(qiáng)度1 800 lx，光照時(shí)間12 h/d，濕度保持在80 %[6]。

待不定芽長(zhǎng)出，小苗生長(zhǎng)到15 mm左右，將植株進(jìn)行繼代繁殖培養(yǎng)。

1.2.3 生根及開花培養(yǎng)

選取長(zhǎng)勢(shì)較好，不定芽長(zhǎng)20 mm～30 mm左右照波再生苗接種到生根培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)基以1/2 MS或MS為基本培養(yǎng)基，NAA為主要激素，蔗糖3.0 %，瓊脂粉0.8～0.9 %，pH值5.8～6.0。培養(yǎng)條件：溫度(24±2℃)，光照強(qiáng)度1 800 lx，光照時(shí)間12 h/d，濕度保持在80 %，培養(yǎng)15 d統(tǒng)計(jì)分析生根情況；培養(yǎng)60 d統(tǒng)計(jì)分析開花情況。

1.2.4 馴化與移栽

選取根系較為健壯且分支較多的植株進(jìn)行馴化培養(yǎng)。首先進(jìn)行瓶?jī)?nèi)馴化，將封口膜放松室溫下煉苗培養(yǎng)5 d逐步適應(yīng)室外環(huán)境，再轉(zhuǎn)移到育苗床上進(jìn)行瓶外馴化，注意保濕和遮光處理。經(jīng)過一段時(shí)間馴化后，將根部培養(yǎng)基徹底沖洗干凈，移栽到珍珠巖與腐殖土為1∶1經(jīng)高壓滅菌處理的移栽基質(zhì)中，用塑料薄膜覆蓋，早晚灑水以保持培養(yǎng)基質(zhì)濕度，10 d以后隔日灑水。培養(yǎng)20 d以后統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑配伍消毒效果分析

對(duì)照波外植體進(jìn)行消毒處理中，為有效提高消毒效果并盡量保持外植體生長(zhǎng)活性，本實(shí)驗(yàn)采用了3 %次氯酸鈉與75 %乙醇聯(lián)合配伍消毒法[7](表1)。接種兩周后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)兩種消毒劑4種不同時(shí)間消毒處理，3 %次氯酸鈉消毒10 min與75 %乙醇消毒8 s聯(lián)合消毒處理效果最好，污染率褐化率較低，存活率較高達(dá)75 %。

表1 消毒劑不同消毒時(shí)間對(duì)照波消毒效果的影響

注：污染率(%)=污染數(shù)/接種總數(shù)×100 %，褐化率(%)=褐化數(shù)/接種總數(shù)×100 %，存活率(%)=存活數(shù)/接種總數(shù)×100 %。

Note：Pollution rate(%)=number of pollution/the total of vaccination×100 %，Browning rate(%)=number of browning/the total of vaccination×100 %，The survival rate(%)=number of survival/the total of vaccination×100 %.

2.2 幾種激素組合對(duì)愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)效果分析

將滅菌處理后生命力較強(qiáng)的照波莖段接種于愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d后在外植體切口處開始膨大，有淡綠色愈傷組織出現(xiàn)，培養(yǎng)15 d后在莖段愈傷組織的側(cè)面和基部可見不定芽生長(zhǎng)，培養(yǎng)25 d統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表2)。

表2 不同激素組合對(duì)照波愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)影響

由表2可見，9種培養(yǎng)基組合對(duì)照波莖段外植體均可誘導(dǎo)出愈傷組織，其中1號(hào)培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)數(shù)最多，形成較早，褐化少，愈傷組織淡綠色較為疏松(圖1 A，B)。而在7號(hào)培養(yǎng)基中，隨著外源激素NAA濃度變化，愈傷組織誘導(dǎo)數(shù)目明顯減少，愈傷組織生長(zhǎng)勢(shì)較差。因此，照波愈傷組織誘導(dǎo)最佳激素組合為NAA 0.1 mg/L和6 - BA 1.0 mg/L，即培養(yǎng)基組成為MS + NAA 0.1 mg/L + 6 - BA 1.0 mg/L。

9種培養(yǎng)基對(duì)照波愈傷組織均可誘導(dǎo)出不定芽誘導(dǎo)，其中6號(hào)培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)數(shù)最多，形成較早，褐化少，不定芽長(zhǎng)度在20 mm左右(圖1 C，D)。而在8、9號(hào)培養(yǎng)基中鮮有不定芽生長(zhǎng)。因此，照波不定芽誘導(dǎo)最佳激素組合為NAA 0.05 mg/L和6 - BA 0.3 mg/L，即培養(yǎng)基組成為MS + NAA 0.05 mg/L + 6 - BA 0.3 mg/L。

圖1 A，B：莖段培養(yǎng)25 d后愈傷組織誘導(dǎo)情況；C，D：莖段培養(yǎng)25 d后不定芽從基部和側(cè)面誘導(dǎo)生長(zhǎng)情況

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)試管苗生根和開花效果分析

選取長(zhǎng)勢(shì)較好，不定芽長(zhǎng)20 mm～30 mm左右照波再生苗接種到生根培養(yǎng)基中。培養(yǎng)15 d后，統(tǒng)計(jì)照波生根和開花情況(表3)。幾種培養(yǎng)基組合均能促進(jìn)根生長(zhǎng)，無愈傷組織形成。1號(hào)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加NAA(0.1 mg/L)，生根率最高達(dá)到80 %，根短、粗壯且數(shù)量較多，有許多須根，生長(zhǎng)勢(shì)較好(圖2 A，B)。4、5、6號(hào)培養(yǎng)基生根率明顯降低，根條數(shù)少而纖細(xì)，生長(zhǎng)勢(shì)較差。由此可見適合照波生根的培養(yǎng)基為1號(hào)培養(yǎng)基。即培養(yǎng)基組成為MS + NAA 0.1 mg/L。

培養(yǎng)60 d后，幾種培養(yǎng)基中僅4、5號(hào)培養(yǎng)基中照波有黃色花苞形成(圖2 C，D)，花期約2周左右。即培養(yǎng)基組成為1/2MS+NAA0.06 mg/L 和1/2MS+NAA 0.03 mg/L。

表3 不同培養(yǎng)基組合對(duì)照波生根和開花影響

注：生長(zhǎng)勢(shì)：較好+++，一般++，較差+

Note：The growth potential：good+++，general++，poor+

圖2 A，B：不定芽接種15 d后生根情況；C，D：組培苗培養(yǎng)60 d后開花情況

2.4 馴化煉苗結(jié)果

選取根系較為健壯且分支較多的植株(圖3 A)，打開瓶蓋煉苗4-5 d后，取出洗凈根部瓊脂移栽到滅菌好的基質(zhì)中(珍珠巖∶腐殖土=1∶1)，用塑料薄膜覆蓋，早晚灑水以保持培養(yǎng)基質(zhì)濕度，10 d以后隔日灑水。培養(yǎng)20天以后統(tǒng)計(jì)成活率達(dá)到90 %(圖3B)。

圖3 A：根系較為發(fā)達(dá)粗壯的植株；B：馴化煉苗20 d后植株生長(zhǎng)情況。

3 討論和結(jié)論

3.1 照波外植體選擇及處理

適宜外植體選擇是植物組織培養(yǎng)關(guān)鍵因素之一。一方面選取分化能力較強(qiáng)的外植體；另一方面選取污染程度低的外植體，可有效降低消毒劑處理強(qiáng)度，增強(qiáng)外植體再生能力。因而，在選取照波外植體中，將植株置于相對(duì)潔凈培養(yǎng)室中培養(yǎng)一周左右，待其莖部長(zhǎng)出淡黃色莖段，作為照波植物組織培養(yǎng)外植體，降低了消毒強(qiáng)度，利于愈傷組織形成。

3.2 植物外源激素選擇

外源激素對(duì)組織分化的調(diào)節(jié)起著非常重要的作用，尤其是生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比值對(duì)組織的發(fā)育方向起決定性作用[8]。外源激素的種類及濃度決定了照波組培的成苗率。6 - BA與NAA配合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、分化具有明顯促進(jìn)作用，參照多肉植物仙人掌及玉露外源激素選擇[4，5]，本試驗(yàn)采用6 - BA與NAA兩種外源激素，以不同濃度進(jìn)行配比組合，在MS + NAA 0.1 mg/L + 6 - BA 1.0 mg/L培養(yǎng)基和MS + NAA 0.05 mg/L + 6 - BA 0.3 mg/L培養(yǎng)基中分別利于愈傷組織和不定芽形成。在MS + NAA 0.1 mg/L 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根根系最為發(fā)達(dá)健壯。在1/2MS + NAA 0.06 mg/L 和1/2MS + NAA 0.03 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)60天后可見黃色花苞形成。

因而，本試驗(yàn)初步建立了照波植物組織培養(yǎng)體系。

【REFERENCES】

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Tissue Culture of Bergeranthus*

ZHOU Jing1，YANG Suwen2，F(xiàn)ANG Xiaobo1，F(xiàn)ANG Rong1，WU Ronggui1，RAN Yongjiao1，LIU Hongmei1▲

(1SchoolofBiologyandEngineering，GuizhouMedcialUniversity，Guiyang550004，China；2ClinicalLaboratoryofKaiyangPeople’sHospital，Guiyang550300，China)

In this study，we developed a tissue culture system forBergeranthus.WithBergeranthusstems as explants，MS as basic medium，through adding different types and concentrations of plant growth regulators，we screened out the optimum medium for different phases of growth.The optimum callus induction medium was MS + NAA 0.1 mg/L + 6 - BA 1.0 mg/L，the optimum adventitious bud induction medium was MS + NAA 0.05 mg/L + 6 - BA 0.3 mg/L，and the best medium for rooting was MS + NAA0.1 mg/L.Under above conditions，90 % plantlets survived.After 60 days culturing in the medium of 1/2 MS + NAA 0.06 mg/L and 1/2 MS + NAA 0.03 mg/L，the plant produced yellow buds.This study preliminarily established the tissue culture system forBergeranthus.

Bergeranthus，stems，callus，tissue culture

Q

A

2016-09-05；

2016-09-29

貴陽醫(yī)學(xué)院高等學(xué)校2014年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(HPLC分析白芨組培苗與實(shí)生苗有效成分含量，201410660015)；貴州醫(yī)科大學(xué)高等學(xué)校2015年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(貴州大方天麻蜜環(huán)菌篩選和鑒定，201510660034)。

周 靜(1981-)，女，漢族，碩士研究生，貴州貴陽人，貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院講師，研究方向：植物組織培養(yǎng)研究。

▲通訊作者：劉紅美(1975-)，女，漢族，博士研究生，貴州遵義人，貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院副教授，研究生導(dǎo)師，研究方向：植物生物技術(shù)。