包怡紅，趙楠

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

脫脂松仁粕中球蛋白的提取工藝及其SDS–PAGE分析

包怡紅，趙楠

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

以脫脂松仁粕為原料，采用Osborne法提取松仁粕中的球蛋白，設(shè)NaCl質(zhì)量分數(shù)(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、料(質(zhì)量，g)液(體積，mL)比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35)、提取時間(30、60、90、120、150、180 min)和提取溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)4個單因素試驗，再用響應(yīng)面法優(yōu)化松仁粕中球蛋白的提取工藝，并對其分子量進行分析。結(jié)果表明：當(dāng)NaCl質(zhì)量分數(shù)為2.5%，料液比為1∶15，提取時間為150 min，提取溫度為56 ℃時，松仁粕中球蛋白的提取率較高，為15.32%；SDS–PAGE分析結(jié)果表明，脫脂松仁粕球蛋白的分子量為41 320、27 520、21 690、16 310、15 180。

脫脂松仁粕；球蛋白；提取工藝； 十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS–PAGE)

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紅松籽(Pinus konaiensis Sieb. et Zucc)又名果松子、海松子，主要分布于東北長白山與小興安嶺一帶[1]，是一種重要的藥食同源的食物。早在《本草綱目》就有記載，紅松籽有“味甘、小溫、無毒。主治骨節(jié)風(fēng)、頭眩，去死肌、散水氣，潤肺、治燥結(jié)咳嗽，治虛秘，久服，輕身延年不老”[2–3]之功效。

目前，國內(nèi)對松仁蛋白的研究主要集中在分離蛋白的提取及其生理功能的研究，如楊立賓等[4]利用超聲波輔助法提取松仁蛋白并對其進行抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)的生理功能研究；吳曉紅等[5]提取松仁蛋白將其純化并對其抗氧化性進行研究；楊麗娜[6]利用堿溶酸沉法提取松仁分離蛋白并通過動物實驗驗證了其降血脂的生物功效；劉軒廷等[7]對紅松籽粕蛋白酶解物對小鼠NK細胞活性進行研究，而對松仁蛋白的組分蛋白研究鮮見報道。此外，由于原料產(chǎn)地的特殊性，國外對松仁蛋白的研究報道也較少。本研究以脫脂松仁粕為材料，采用Osborne蛋白分級法提取球蛋白，在單因素的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面法優(yōu)化其最佳提取工藝，并對其進行SDS–PAGE分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

脫脂松仁粕由七臺河市宏泰松果有限公司提供。

試劑：氯化鈉、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、甲基紅、溴甲酚綠等均為分析純；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G–250、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉，由Biotopped公司提供，均為優(yōu)級純；蛋白質(zhì)分子量標準由TaKaRa公司提供。

儀器與設(shè)備：分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；恒溫水浴振蕩器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；722型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司制造)；DYY–50型電泳儀(北京六一儀器廠)；pH計EL20(梅特勒–托利多儀器上海有限公司)。

1.2 方法

1) 脫脂松仁粕的制備。將榨取松仁油后的餅粕按1∶10的比例加入石油醚除去剩余油脂，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去石油醚，烘干，即得脫脂松仁粕。

2) 蛋白質(zhì)含量的測定。原料中的總蛋白含量采用凱氏定氮法測定[8]；提取液中的蛋白含量采用考馬斯亮藍法進行測定。

3) 松仁粕球蛋白的制備與測定。參照Osborne分級提取蛋白的方法，分別提取松仁粕清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白。提取工藝如下：脫脂松仁粕→水溶液浸提→離心→殘渣→水溶液二次浸提→離心→殘渣→鹽提→離心→殘渣→二次鹽提→離心→上清液→合并2次上清液→調(diào)至等電點→真空冷凍干燥→松仁粕球蛋白。采用考馬斯亮藍法測定蛋白的含量，再與原料中的總蛋白含量相比，得松仁粕球蛋白的提取率。

4) 松仁粕球蛋白單因素試驗。以NaCl溶液為提取溶劑，按照3)工藝提取松仁粕球蛋白，設(shè)NaCl質(zhì)量分數(shù)(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、料(g)液(mL)比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、 1∶35)、提取時間(30、60、90、120、150、180 min)和提取溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)4個單因素試驗，比較松仁粕球蛋白的提取率。

5) 響應(yīng)面優(yōu)化試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用響應(yīng)面試驗的Box–Behnken設(shè)計原理，通過Design–Expert 8.0.6軟件對單因素篩選出的顯著影響因素進行四因素三水平的優(yōu)化試驗(表1)。

表1 響應(yīng)面設(shè)計的因素與水平Table 1 Experimental design of response surface methodology

6) SDS–PAGE分析。采用電泳儀進行不連續(xù)雙垂直板聚丙烯酰氨凝膠電泳。參照Roshni Chatterjee等[9]方法并略有修改：將脫脂松仁粕的球蛋白提取液與樣品緩沖液(10%SDS 4 mL，巰基乙醇 0.15 mL，溴酚藍 0.02 g，甘油 2 mL，Tris–HCl(pH6.8，1.0 mol/L) 1 mL，雙蒸水定容至10 mL)按體積比1∶1混合均勻，100 ℃煮沸5～10 min，4 000 r/min離心10 min，上樣量為20 μL，分離膠濃度為12%，濃縮膠為5%。開始電壓為80 V，進入分離膠后為120 V，電泳時間為2.5～3 h。電泳結(jié)束后固定4 h，用考馬斯亮藍R–250，50 ℃搖床染色2 h，脫色液脫色數(shù)次直至電泳條帶清晰。根據(jù)標準蛋白的遷移率，計算出松仁粕球蛋白的分子量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007處理；運用SPSS 21.0軟件進行單因素分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 松仁粕蛋白質(zhì)的含量

采用凱氏定氮法測得脫脂松仁粕中蛋白質(zhì)的含量為42.37%。

2.2 松仁粕球蛋白提取單因素試驗結(jié)果

當(dāng)NaCl質(zhì)量分數(shù)分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時，提取率分別為(1.83±0.02)%、(2.88±0.01)%、(4.85±0.02)%、(9.09±0.03)%、(8.50± 0.01)%、(8.28±0.03) %，可知，NaCl質(zhì)量分數(shù)為2.0%時提取率最高。當(dāng)料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35時，提取率分別為(9.63±0.10)%、(11.61±0.12)%、(11.41±0.1)%、(11.38± 0.1)%、(11.34±0.02)%、(11.26±0.014)%，可知，料液比為1∶15時提取率最高。當(dāng)提取時間為30、60、90、120、150、180 min時，提取率分別為(11.71±0.11)%、(11.95±0.1)%、(12.33±0.09)%、(12.30±0.08)%、(13.15±0.06)%、(12.13±0.08)%，可知提取時間為150 min時提取率最高。當(dāng)提取溫度為40、45、50、55、60、65 ℃時，提取率分別為(11.52± 0.06)%、(12.85±0.09)%、(13.35±0.03)%、(14.28± 0.10)%、(13.67±0.08)%、(13.66±0.1)%，可見，提取溫度為55℃時，球蛋白的提取率最高。

2.3 松仁粕球蛋白提取優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用響應(yīng)面對松仁粕球蛋白提取條件進行優(yōu)化。利用Design–Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行二次多元回歸擬合，可得到球蛋白提取率(Y)和各個因子(NaCl質(zhì)量分數(shù)(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取溫度(D))之間的回歸方程模型為：Y=15.18+0.11A+0.53B+0.069C+1.57D–0.77AB–0.022AC+0.31AD–0.24BC–0.025BD–0.098CD–2.25A2–1.36B2–1.22C2–2.62D2，回歸模型P＜0.000 1，表明此模型極顯著；失擬項P＞0.056 7，說明沒有失擬項產(chǎn)生；相關(guān)系數(shù)R2=0.937 7，說明該模型與試驗值之間有較好的擬合度。在各個因素中，按影響大小依次為提取溫度、料液比、NaCl質(zhì)量分數(shù)、提取時間。由回歸模型可知，NaCl質(zhì)量分數(shù)與料液比的交互作用對松仁粕球蛋白提取率線性效應(yīng)顯著(P＜0.05)。根據(jù)上述方程繪制響應(yīng)面(圖1)，得出最佳提取工藝為NaCl質(zhì)量分數(shù)2.38%，料液比1∶14.88，提取時間150.26 min，提取溫度56.12 ℃，提取率可達15.18%。

圖1 NaCl質(zhì)量分數(shù)和料液比交互作用下松仁粕球蛋白的提取率Fig.1 Globulin yield from defatted pine nut under different mass fraction of NaCl and liquid-solid ratio

2.3.2 驗證試驗結(jié)果

通過響應(yīng)面得到的最佳提取工藝，考慮實際操作方便，將提取條件修正為NaCl質(zhì)量分數(shù)為2.5%，料液比為1∶15，提取時間150 min，提取溫度56 ℃。在此條件下，松仁粕球蛋白的提取率為15.32%，與模型預(yù)測值之間的誤差為0.92%，說明該響應(yīng)面得出的模型是可靠的。

2.4 SDS–PAGE試驗結(jié)果

球蛋白的SDS–PAGE分析結(jié)果如圖2。從圖2可以看出，松仁粕球蛋白的亞基分布范圍集中在44 300～ 14 300，主要條帶分別為41 320、27 520、21 690、16 310、15 180。

圖2 松仁粕球蛋白的SDS–PAGE結(jié)果Fig.2 Results of SDS–PAGE from pine nut globulin

3 結(jié)論與討論

松仁粕中球蛋白的提取涉及的各個因素均會對其提取率造成一定的影響。本試驗結(jié)果表明，松仁粕球蛋白的提取率隨提取劑NaCl質(zhì)量分數(shù)的升高而增加，但當(dāng)NaCl質(zhì)量分數(shù)升高至2.0%以上時，提取率不再增加，這與程皓[10]提取脫脂米糠中球蛋白的研究結(jié)果趨勢相一致。這主要是由于蛋白質(zhì)具有鹽溶性質(zhì)，低濃度的鹽溶液會增加蛋白質(zhì)表面的電荷數(shù)量，提高蛋白質(zhì)在溶液中的溶解性，因此，低濃度的鹽溶液能夠促進蛋白質(zhì)的溶出，但當(dāng)鹽溶液的濃度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)的表面電荷被大量中和，從而降低了球蛋白的溶解度。球蛋白的提取率隨著料液比的增加而增加，當(dāng)料液比為1∶15時，球蛋白的提取率最高，之后呈下降趨勢。可能是由于料液比值變小，松仁粕球蛋白與脫脂松仁粕之間的吸附力大于其與提取劑之間的相互作用，使松仁粕種球蛋白的溶出減少，這與王艷玲等[11]提取脫脂米糠中球蛋白的研究結(jié)果一致。隨著溫度的升高，溶液中分子的擴散運動加劇，從而促進蛋白質(zhì)的溶出，當(dāng)溫度為55 ℃時，球蛋白的提取率趨于平穩(wěn)，溫度過高會使蛋白質(zhì)部分性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致蛋白的提取率無明顯變化。

對球蛋白分子量的測定采用的是十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS–PAGE)[12–14]，由于不同分子量的物質(zhì)通過膠孔的速度不同，進而可將球蛋白中存在的不同分子量的蛋白亞基分離開來。本試驗結(jié)果表明，松仁粕中球蛋白的亞基分布范圍集中在44 300～14 300，而王曉飛等[15]提取長白山核桃球蛋白的分子量范圍為14 300～59 000，孫琳琳[16]提取的長白山核桃楸的球蛋白的分子量為18 500～ 22 000、30 000～33 500和49 000～56 000的條帶，松仁粕球蛋白的分子量比長白山核桃球蛋分子量小。

綜上所述，松仁粕中球蛋白提取最佳工藝：NaCl質(zhì)量分數(shù)2.5%，料液比1∶15，提取時間150 min，提取溫度56 ℃，在此條件下球蛋白的提取率為15.32%。松仁粕中球蛋白的SDS–PAGE分析結(jié)果表明，松仁粕球蛋白的分子量為41 320、27 520、21 690、16 310、15 180。

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責(zé)任編輯：尹小紅

英文編輯：梁 和

Optimization of extraction globulin from defatted pine nut meal and analysis of SDS–PAGE

Bao Yihong, Zhao Nan
(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040,China)

Defatted pine nut meal was used as material, four single factors of NaCl extraction solvent (0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5% and 3.0%), ratio of material to solvent (1∶10, 1∶15, 1∶20, 1∶25, 1∶30, and 1∶35), extraction time(30, 60, 90, 120, 150, and 180 min) and extraction temperature (40, 45, 50, 55, 60, and 65 ℃) were designed to extract globulin by the method of Osborne and to improve extraction process by response surface method and to analyze relative molecular mass of globulin by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE). The result showed that the optimum extraction conditions were 2.5% of NaCl, extraction at 56 ℃ for 150 min with ratio of material to solvent 1∶15, the extraction ratio of globulin was up to 15.32%, and the relative molecular mass of the proteins were 41 320, 27 520, 21 690, 16 310, 15 180.

defatted pine nut; globulin; extraction process; sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE)

TS201.2

A

1007-1032(2016)06-0654-04

2016–03–23

2016–10–15

中央高?？蒲袠I(yè)務(wù)費專項(2572014EA02)；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項目(2015RAXXJ010)

包怡紅(1970—)，女，黑龍江哈爾濱人，博士，教授，主要從事食品生物技術(shù)與功能食品研究，baoyihong@163.com