趙仁亮，吳丹，姜依何，朱旗*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

不同產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶中“金花”菌的分離及分子鑒定

趙仁亮1,2，吳丹1,2，姜依何1,2，朱旗1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

為探明不同地域茯磚茶中“金花”菌的異同，采用陜西、湖南和浙江3個(gè)產(chǎn)區(qū)同等級(jí)的黑毛茶為原料，分別在本地及其他2個(gè)產(chǎn)區(qū)同一時(shí)期加工成9個(gè)茯磚茶樣，運(yùn)用純培養(yǎng)技術(shù)，觀察茶樣中“金花”菌在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征，同時(shí)結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)茶樣中的“金花”菌進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明：從9個(gè)茯磚茶樣品中，分離獲得了13株“金花”菌，在不同培養(yǎng)基中的形態(tài)學(xué)特征與散囊菌屬的特征非常相近，且菌株G9、G10的形態(tài)特征與其他“金花”菌明顯不同；通過(guò)對(duì)特異性區(qū)段ITS和β–tubulin序列擴(kuò)增、測(cè)序，經(jīng)同源序列搜索比對(duì)及構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)一步分析，并參照Hubka最新的曲霉屬分類系統(tǒng)，最終將不同地域(陜、湘、浙)加工的茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌鑒定為冠突曲霉，異名冠突散囊菌；浙江產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶中分離獲得的非優(yōu)勢(shì)“金花”菌G9和G10鑒定為謝瓦曲霉。

茯磚茶；“金花”菌；分子鑒定；分類

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茯磚茶是采用黑毛茶為原料再加工的一種緊壓型黑茶，其中“發(fā)花”是其關(guān)鍵工序，對(duì)其獨(dú)特的品質(zhì)及卓越的健康功效形成具有重要的作用。茯磚茶的“發(fā)花”實(shí)質(zhì)是一個(gè)以冠突散囊菌為主體的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程，優(yōu)勢(shì)菌的存在對(duì)茯磚茶獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)形成具有重要影響。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的學(xué)者曾做了大量研究[1–8]，分別以發(fā)花過(guò)程的在制品、成品茶，不同季節(jié)、不同產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵的茯磚茶為研究對(duì)象，運(yùn)用形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)微生物除了冠突散囊菌之外，還有阿姆斯特丹、謝瓦、蠟葉等其他散囊菌。茯磚茶的自然發(fā)酵相比于人工接種冠突散囊菌的發(fā)酵，它們之間優(yōu)勢(shì)微生物的種群組成可能存在一定的差異，因此，產(chǎn)酶能力及分泌的次生代謝產(chǎn)物也可能存在一定的區(qū)別。本研究以不同地域同期交叉制作的茯磚茶樣為研究對(duì)象，通過(guò)形態(tài)觀察及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)不同地域的“金花”菌進(jìn)行了鑒定，以期探明不同地域茯磚茶品質(zhì)的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試茯磚茶樣

采用陜西、湖南和浙江產(chǎn)區(qū)同等級(jí)的黑毛茶為原料，同一時(shí)期分別在本地及其他2個(gè)產(chǎn)區(qū)壓制成茯磚茶樣。具體茯磚茶樣品信息見(jiàn)表1。

表1 供試茯磚茶樣Table 1 The lists of Fuzhuan tea samples

1.1.2 培養(yǎng)基

分離、純化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。鑒定培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基(CZ)，配方為3 g NaNO3，1 g K2HPO4，0.5 g MgSO4，0.5 g KCl，0.01 g FeSO4，30 g蔗糖，20 g瓊脂，定容至1 000 mL。20%察氏培養(yǎng)基(CZ20)，除蔗糖為200 g外，其余成分同CZ培養(yǎng)基。察氏酵母瓊脂培養(yǎng)基(CYA)，除酵母粉為5 g外，其余成分同CZ培養(yǎng)基。麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)，成分為麥芽膏粉130 g、瓊脂20 g、定容至1 000 mL。40%蔗糖麥芽汁酵母瓊脂培養(yǎng)基(M40Y)，除蔗糖為400 g，酵母粉5 g外，其余成分同麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑

DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)買自天根生化科技(北京)有限公司；200 bp DNA Ladder、Taq酶、dNTP購(gòu)買自生工生物工程(上海)股份有限公司。參照White等[9]的方法，合成真菌rDNA ITS序列通用引物ITS1：5'–TCCGTAGGTGA ACCTGCGG–3'和ITS4：5'–TCCTCCGCTTATTGA TATGC–3'；參照Glass等[10]的方法，合成真菌β–微管蛋白基因間隔區(qū)通用引物Bt2a：5'–GGTAACC AAATCGGTGCTGCTTTC–3'和Bt2b：5'–ACCCTC AGTGTAGTGACCCTTGGC–3'。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)，分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)(SW–CJ–2D型，蘇凈集團(tuán))；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(SPX，江蘇環(huán)保儀器廠)；高溫滅菌鍋(TXQ.DY–220，上海醫(yī)用核子儀器廠)；恒溫干燥箱(DHG–9076A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)；電子天平(Mettler AE240，梅特勒-托利多儀器有限公司)；PCR擴(kuò)增儀(Biomrtra，德國(guó))；微型旋渦混合儀(WH–3，上海)；高速冷凍離心機(jī)(MLKR022B，德國(guó))；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY–Ⅲ，北京)及凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)(Gene Genius，英國(guó))等。

1.2 方法

1.2.1 “金花”菌的分離與純化

分別取供試茯磚茶樣25 g，運(yùn)用純培養(yǎng)分離純化技術(shù)，依據(jù)菌落大小、質(zhì)地、顏色等形態(tài)學(xué)特征初步分離，經(jīng)過(guò)多次純化，得到純種菌株。4 ℃保存。

研究開(kāi)發(fā)微藻生物能源特別是生物柴油和生物油替代傳統(tǒng)石油燃料用于交通運(yùn)輸，具有廣闊的前景。微藻生物能源的經(jīng)濟(jì)性受到現(xiàn)有技術(shù)水平和傳統(tǒng)化石燃料價(jià)格雙重影響，大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的發(fā)展受到限制。綜上可知，微藻生物能源發(fā)展的首要阻礙是藻種的選育，藻種的特性影響著后續(xù)的多個(gè)重要環(huán)節(jié)如培養(yǎng)、油脂提取和轉(zhuǎn)化等。規(guī)?；囵B(yǎng)是獲得生物質(zhì)的關(guān)鍵，目前存在的問(wèn)題仍是如何實(shí)現(xiàn)光能的高效利用，解決油脂積累和生物量積累不匹配問(wèn)題。生物能源產(chǎn)品多樣，生產(chǎn)工藝仍需進(jìn)一步優(yōu)化以降低成本。未來(lái)，微藻生物能源的研究應(yīng)集中在以下四個(gè)方面：

1.2.2 “金花”菌的形態(tài)觀察

將供試茶樣中分離、純化得到的 “金花”菌常溫下復(fù)蘇24 h，分別轉(zhuǎn)接于上述5種培養(yǎng)基中，25 ℃避光培養(yǎng)7 d，每天觀察菌落的生長(zhǎng)情況并作好記錄，對(duì)照《中國(guó)真菌志》彩圖和文字描述進(jìn)行初步判斷。

1.2.3 “金花”菌的分子鑒定

1) “金花”菌基因組DNA的提取。分別稱取2.0 g冰凍菌絲，置于預(yù)先放于冰盒上的無(wú)菌研缽中，加少許石英砂，快速研碎成粉，用植物基因組試劑盒(天根)提取總DNA。

2) “金花”菌基因擴(kuò)增及測(cè)序。分別采用通用引物ITS1和ITS4、Bt2a和Bt2b擴(kuò)增“金花”菌的ITS區(qū)、β–微管蛋白基因序列。25 μL反應(yīng)體系：2.5 μL 10×Taq Buffer, 2.5 μL dNTP (2 mmol/L)，2.4 μL引物，2 μL Mg2+(25 mmol/L)，模板2 μL DNA，0.1 μLTaq酶(5 U/μL)，13.5 μL ddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性50 s，53 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

2 結(jié)果與分析

2.1 從供試茯磚茶樣中分離獲得的“金花”菌

依據(jù)“金花”菌的大小、質(zhì)地、顏色等形態(tài)特征，從9個(gè)供試茯磚茶樣中初步分離獲得13株“金花”菌，其中從陜西產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶(FBT 1、FBT 2、FBT 3)中分離獲得3株(G1、G2、G3)；從湖南產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶(FBT 4、FBT 5、FBT 6)中分離獲得4株(G4、G5、G6、G7)，從浙江產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶(FBT 7、FBT 8、FBT 9)中分離獲得6株(G8、G9、G10、G11、G12、G13)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 從供試茯磚茶中分離、純化的“金花”菌Fig.1 The “golden flora” fungi isolated and purified from Fu brick tea produced in different regions

2.2 13株“金花”菌在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征

從由陜西產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶中分離的“金花”菌株G1、G2和G3，在CZ培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，直徑11～14 mm，邊緣呈白色至淡黃色，中央呈淡黃褐色，背面呈淡黃色至黃褐色，菌落稀疏、平伏(圖2–G1–A、圖2–G2–A、圖2–G3–A)；在CZ20培養(yǎng)基上生長(zhǎng)慢，直徑15～19 mm，菌落平展、疏松，背面呈淡黃色至黃色(圖2–G1–B、圖2–G2–B、圖2–G3–B)；在CYA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)略快，直徑19～27 mm，邊緣呈白色至淡黃色，中央呈黑褐色，閉囊殼大量、黃色，背面呈淡黃色至黃褐色，菌落致密(圖2–G1–C、圖2–G2–C、圖2–G3–C)；在MEA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，直徑48～65 mm，邊緣呈白色至淡黃色，中央呈黃褐色至深褐色，閉囊殼大量、黃色，背面呈黃色至黃褐色，菌落致密(圖2–G1–D、圖2–G2–D、圖2–G3–D)；在M40Y培養(yǎng)基上生長(zhǎng)極為迅速，其中菌株G1和G2直徑為75～85 mm，幾乎長(zhǎng)滿平板，邊緣呈白色至淡黃色，中央呈淡黃褐色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，閉囊殼大量、黃色，背面呈橙黃色，色素?cái)U(kuò)散于培養(yǎng)基中(圖2–G1–E、圖2–G2–E、圖2–G3–E)。

圖2 從陜西產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶中分離的“金花”菌在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征Fig.2 The morphological characteristics of “golden flora” fungi isolated from FBT produced in Shanxi region on different culture media

從湖南產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶中分離的“金花”菌株G4、G5和G6，在CZ培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，直徑14～18 mm，菌落稀疏、平薄，淡黃色至橄欖褐色，背面呈淡黃至黃褐色，閉囊殼少量，少量色素?cái)U(kuò)散于培養(yǎng)基中(圖3–G4–A、圖3–G5–A、圖3–G6–A)；在CZ20培養(yǎng)上生長(zhǎng)慢，直徑16～25 mm，淡黃至蜜黃色，背面呈黃色至黃褐色，閉囊殼少量、黃色，菌落稀疏、平展(圖3–G4–B、圖3–G5–B、圖3–G6–B)；在CYA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)略快，直徑26～28 mm，邊緣呈白色至淡黃色，中央呈黑褐色，閉囊殼大量，背面呈淡黃至黃褐色，菌落致密(圖3–G4–C、圖3–G5–C、圖3–G6–C)；在MEA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，直徑36～49 mm，邊緣呈白色至橙黃色，中央呈橄欖褐色，閉囊殼大量，背面呈淡黃至深褐色，菌落致密，色素?cái)U(kuò)散于培養(yǎng)基中，其中菌株G6有輻射狀溝紋(圖3–G4–D、圖3–G5–D、圖3–G6–D)；在M40Y培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，其中菌株G5和G6直徑達(dá)65～67 mm，菌株G4略小，菌落直徑36～38 mm；邊緣呈白色至黃色，中央呈淡黃色至淡黃褐色，閉囊殼大量，氣生菌絲發(fā)達(dá)，背面呈淡黃至黃褐色(圖3–G4–E、圖3–G5–E、圖3–G6–E)。

從湖南產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶中分離的“金花”菌株G7在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)與G4、G5和G6略有不同。G7在CZ培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，直徑約11 mm，邊緣呈黃色，中央呈黃褐色，菌落稀疏、平而薄，背面呈黃褐色，少量色素?cái)U(kuò)散于培養(yǎng)基中(圖3–G7–A)；G7在CZ20培養(yǎng)基上生長(zhǎng)慢，直徑15～16 mm，黃色至橙黃色，菌落稀疏，閉囊殼大量，背面呈黃褐色(圖3–G7–B)；G7在CYA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，直徑10～12 mm，橙黃色至黃褐色，菌落致密，中央隆起，背面呈黃褐色(圖3–G7–C)；G7在 MEA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快，直徑29～30 mm，邊緣黃色至橙黃色，中央呈橄欖褐色，背面呈黃褐色，少量色素?cái)U(kuò)散于培養(yǎng)基中(圖3–G7–D)；G7在M40Y培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，直徑29～36 mm，形狀不規(guī)則，淡黃色至黃褐色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，閉囊殼大量，背面呈橙黃色(圖3–G7–E)。

圖3 從湖南產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶中分離的“金花”菌在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征Fig.3 The morphological characteristics of “golden flora” fungiisolated from FBT produced in Hunan region on different culture media

從浙江產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶中分離的“金花”菌株G8、G11和G12，在CZ培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，直徑7～18 mm，邊緣呈淡黃色，中央呈黃褐色，菌落稀疏、平伏，閉囊殼少量，背面呈淡黃色(圖4–G8–A、圖4–G11–A、圖4–G12–A)；在CZ20培養(yǎng)基上生長(zhǎng)略快，直徑26～31 mm，黃色至淡黃褐色，閉囊殼大量，背面呈黃色至淡黃褐色，菌落致密(圖4–G8–B、圖4–G11–B、圖4–G12–B)；在CYA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)略快，直徑22～32 mm，邊緣呈白色至黃色，中央呈黃褐色至黑褐色，背面呈淡黃色至黃褐色，菌落致密(圖4–G8–C、圖4–G11–C、圖4–G12–C)；在MEA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，直徑45～68 mm，邊緣呈白色至黃色，中央呈橙黃至橄欖褐色，閉囊殼大量，背面邊緣呈淡黃色，中央黃褐色(圖4–G8–D、圖4–G11–D、圖4–G12–D)；在M40Y培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快，菌株G8和G11直徑37～40 mm，菌株G12生長(zhǎng)迅速，菌落直徑50～58 mm，形狀不規(guī)則，邊緣呈白色至黃色，中央呈淡黃褐色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，背面呈橙黃色至橙紅色(圖4–G8–E、圖4–G11–E、圖4–G12–E)。

從浙江產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶中分離的“金花”菌株G9，在CZ培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，直徑約16 mm，菌落平展，黃綠色，分生孢子及閉囊殼大量，背面呈黃色(圖4–G9–A)；G9在CZ20培養(yǎng)基上生長(zhǎng)慢，直徑約28 mm，菌落平坦，黃綠色，分生孢子及閉囊殼大量，背面呈黃綠色(圖4–G9–B)；在CYA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)慢，直徑22～23 mm，菌落致密，鵝黃色，有皺褶，背面呈橙紅色，有輻射狀溝紋(圖 4–G9–C)；在MEA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，直徑15～16 mm，菌落致密，中央隆起，黃綠色， 背面呈繡紅色，有輻射狀溝紋(圖4–G9–D)；在M40Y培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，直徑32～38 mm，形狀不規(guī)則，大量氣生菌絲，邊緣呈灰綠色，中央有大量閉囊殼，背面深黃，兼帶灰綠色(圖4–G9–E)。

圖4 從浙江產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶中分離的“金花”菌在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征Fig.4 The morphological characteristics of “golden flora” fungiisolated from FBT produced in Zhejiang region on different culture media

從浙江產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶中分離的“金花”菌株G10在CZ培養(yǎng)基上生長(zhǎng)慢，直徑約19 mm，邊緣呈淡黃色至黃色，中央呈淡黃褐色，菌落平伏，背面呈淡黃褐色(圖4–G10–A)；G10在CZ20培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快，直徑約38 mm，邊緣呈淡黃色，中央呈黃色至黃綠色，分生孢子結(jié)構(gòu)和閉囊殼大量，背面呈黃褐至深褐色(圖4–G10–B)；G10在CYA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)慢，直徑約21 mm，邊緣呈淡黃色，中央呈土黃至深黃色，閉囊殼大量，菌落致密，背面呈黃褐色(圖4–G10–C)；G10在MEA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快，直徑31～32 mm，邊緣呈綠色，中央呈黃綠色，菌落平伏，分生孢子結(jié)構(gòu)和閉囊殼大量；背面呈磚紅色，有輻射狀溝紋(圖4–G10–D)；G10在M40Y培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，直徑57～59 mm，近圓形，黃綠色，分生孢子結(jié)構(gòu)和閉囊殼大量，氣生菌絲發(fā)達(dá)；背面呈橙黃色，兼帶灰綠色(圖4–G10–E)。

從浙江產(chǎn)區(qū)加工的茯磚茶中分離的“金花”菌株G13在CZ培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，直徑約5 mm，淡黃色，菌落稀疏，閉囊殼少量，背面呈黃褐色(圖4–G13–A)；在CZ20培養(yǎng)基上生長(zhǎng)慢，直徑20～22 mm，黃色，菌落稀疏，閉囊殼少量，背面呈淡黃色(圖4–G13–B)；在CYA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)稍快，直徑22～23 mm，邊緣呈白色至黃色，中央呈橄欖褐色，平伏，背面呈黃褐色，色素?cái)U(kuò)散于培養(yǎng)基中(圖4–G13–C)；在MEA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快，直徑約26～31 mm，邊緣呈淡黃色，中央呈橄欖褐色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，背面呈黃褐色，色素?cái)U(kuò)散于培養(yǎng)基中(圖4–G13–D)；在M40Y上生長(zhǎng)快，直徑35～38 mm，邊緣呈白色，中央呈淡黃色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，背面呈淡黃色(圖4–G13–E)。

對(duì)照《中國(guó)真菌志》，13株“金花”菌在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征與中散囊菌屬最為相近，且Ⅰ類菌株G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G11和G12形態(tài)特征極為相近，可能為散囊菌屬中的1個(gè)種；Ⅱ類菌株G7、G13與Ⅰ類菌株形態(tài)特征接近，但又不完全相同，是否與Ⅰ類同種，需要進(jìn)一步研究；Ⅲ類菌株G9、G10與Ⅰ、Ⅱ類形態(tài)特征明顯不同，可能為散囊菌屬中的另外1個(gè)種。

2.2 供試茯磚茶中“金花”菌的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

2.2.1 基于rDNA–ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)過(guò)雙向測(cè)序、拼接，最終獲得菌株G1–G13的ITS共13條系列，分別提交至GenBank進(jìn)行Blast同源序列搜索比對(duì)，下載與待鑒定菌株序列同源性達(dá)99%以上的已知分類地位的模式菌株，一起構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。由圖5可知，與13株“金花”菌同源性最高的已知分類地位的菌株為散囊菌屬和曲霉屬。依據(jù)最新國(guó)際命名法規(guī)，散囊菌屬已歸入曲霉屬曲霉組，是1個(gè)單系的類群[11]，因此，由構(gòu)建的整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，從茯磚茶樣中分離獲得的13株“金花”菌均屬于曲霉屬曲霉組，即散囊菌屬。但基于目前的研究[12–13]，ITS區(qū)序列在該屬種的分類鑒定上缺乏足夠的分辨率，不能有效區(qū)分曲霉屬曲霉組(散囊菌屬)下的種類，因此，必須通過(guò)測(cè)定其他基因位點(diǎn)，與ITS分析結(jié)果對(duì)照，再結(jié)合形態(tài)特征，才能最終鑒定曲霉屬曲霉組(散囊菌屬)下的種類。

圖5 13株“金花”菌基于ITS基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 The NJ tree based on ITS gene of 13 strains of “golden flora” fungi

2.2.2 基于β–Tubulin基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

同樣經(jīng)過(guò)雙向測(cè)序、拼接，最終獲得菌株G1至G13的β–tubulin共13條系列，分別提交至GenBank進(jìn)行Blast同源序列搜索比對(duì)，與菌株G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G11、G12和G13同源性較高的模式菌株僅有Eurotium sp. FZ(ACCESSION NO. HQ148162.1)和Aspergillus cristatus NRRL 4222(ACCESSION NO. EF651914.1)，相似度分別為100%和99%。

與菌株G9、G10同源性在99%以上的模式菌株中，均屬于Aspergillus chevalieri，且與其中的模式菌株Aspergillus chevalieri PRK9a (ACCESSION NO. KU872182.1)的相似度為100%，序列比對(duì)結(jié)果如圖6、圖7。

由圖6、圖7可知，與Ⅰ、Ⅱ類菌株高度同源的模式菌株Eurotium sp. FZ(ACCESSION NO. HQ148162.1)，是Xu等[4]提交到GenBank數(shù)據(jù)的，最終鑒定該模式菌株是冠突散囊菌。高度同源的另一模式菌株Aspergillus cristatus NRRL 4222 (ACCESSION NO. EF651914.1)，根據(jù)最新的分類系統(tǒng)，兩模式菌株是屬同一種。與Ⅲ類菌株G9、G10高度同源的模式菌株均屬于Aspergillus chevalieri。綜合形態(tài)特征及ITS和菌株的β–tubulin同源序列比對(duì)，G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G11、G12和G13最終鑒定為冠突曲霉(A. cristatus)，異名冠突散囊菌(E. cristatus)；菌株G9、G10最終鑒定為謝瓦曲霉(A. chevalieri)。

圖6 Ⅰ、Ⅱ類菌株與模式菌株Eurotium sp. FZ BenA序列比較Fig.6 The BenA sequence of Ⅰ, Ⅱ strains comparison with model strains Eurotium sp. FZ

圖7 Ⅲ類菌株與模式菌株Aspergillus chevali eri strain PRK9a BenA序列比較Fig.7 The BenA sequence of Ⅲstrain comparison with model strains Aspergillus chevalieri strain PRK9a

圖8 13株“金花”菌基于β–tubulin基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.8 The NJ tree based on β–tubulin sequence data of 13 strains of “golden flora” fungi

由圖8可知，Ⅰ、Ⅱ類菌株與Ⅲ類菌株聚為2個(gè)大的分支，再次驗(yàn)證了它分別是曲霉屬曲霉組中的2個(gè)種。另外從陜西產(chǎn)區(qū)茯磚茶中分離的菌株G1、G2和G3與從湖南、浙江產(chǎn)區(qū)茯磚茶中分離的菌株G4、G5、G6、G7、G8、G11、G12、G13雖然最終鑒定為同種，但卻聚在2個(gè)分支上。探究3個(gè)產(chǎn)區(qū)茯磚茶的起源與演變：一是浙江茯磚茶工藝技術(shù)傳承于湖南茯磚茶，且制作茶樣的兩企業(yè)生產(chǎn)茯磚茶的歷史均超過(guò)了30年，而陜西雖然是茯茶之源，但其間中斷生產(chǎn)近60年，直至2009年才恢復(fù)生產(chǎn)，制作茶樣的企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)茯磚茶的歷史并不長(zhǎng)；二是茯磚茶生產(chǎn)地湖南安化和浙江武義氣候相似，但與陜西涇陽(yáng)差別較大。綜合分析，由于受地域和環(huán)境的影響，冠突曲霉(異名冠突散囊菌)在遺傳上可能呈現(xiàn)出了多樣性。

3 討論與小結(jié)

“金花”菌是茯磚茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)菌種，研究不同地域茯磚茶品質(zhì)形成機(jī)理，“金花”菌種名的鑒定是首要解決的問(wèn)題。然而，真菌的鑒定異常復(fù)雜，過(guò)去主要依靠形態(tài)學(xué)進(jìn)行分類，但部分真菌的形態(tài)特征會(huì)隨著環(huán)境發(fā)生一定變化，此方法并不穩(wěn)定可靠。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸序列分析已被廣泛地應(yīng)用到真菌分類鑒定中，其中，rDNA的ITS區(qū)段因具有易擴(kuò)增、穩(wěn)定性高、長(zhǎng)度短等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為眾多學(xué)者研究真菌分類鑒定及群體遺傳多樣性時(shí)普遍使用的一種分子標(biāo)記方法?；谏⒛揖鷮賰?nèi)物種高度的同源性，Peterson等[12]和Hubka等[13]均證實(shí)了ITS序列不能有效區(qū)分該屬內(nèi)下的種類。β–微管蛋白是微管的組成成分之一，廣泛分布于真核生物中，其基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)受外界環(huán)境因素的影響較小，進(jìn)化速度很快，因而可以提供較豐富的信息位點(diǎn)和變異位點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于菌株的分類鑒定及生物種間的系統(tǒng)發(fā)育。

在本研究中，通過(guò)在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征，結(jié)合ITS和β–tubulin基因序列同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育分析，最終得出以下結(jié)論：第一，單純地通過(guò)形態(tài)學(xué)及ITS區(qū)來(lái)鑒定曲霉屬曲霉組(散囊菌屬)下的物種，可能會(huì)得出錯(cuò)誤的鑒定結(jié)果；第二，部分來(lái)源不同的“金花”菌盡管最終被鑒定為同種，但在不同的培養(yǎng)基中其形態(tài)特征還是存在一定差別，且以BenA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)聚在了不同的分支上，因而推測(cè)冠突曲霉(異名冠突散囊菌)可能存在亞型，在遺傳上呈現(xiàn)多樣性，需要采用其他技術(shù)進(jìn)一步研究；第三，不同產(chǎn)區(qū)茯磚茶中的“金花”菌存在著種類多樣性，除冠突曲霉外，還有謝瓦曲霉存在，這與王文濤等[5]、胡志遠(yuǎn)等[1]、劉石泉[14]的研究結(jié)論是一致的。

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責(zé)任編輯：尹小紅

英文編輯：梁 和

Isolation and molecular identification of “Jinhua” fungi on the Fuzhuan tea produced in different regions

Zhao Renliang1,2, Wu Dan1,2, Jiang Yihe1,2, Zhu Qi1,2*
(1.Key laboratory of Education Ministry for Tea Science, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China)

In order to study the differences of the “Jinhua” fungi from the fuzhuan tea (FZT)produced in different regions, 9 FZT samples, which were processed with the same standard of raw dark teas from Shanxi, Hunan, Zhejiang at the same season, were used as materials. The “Jinhua” fungi obtained from the FZT samples were cultured with different mediums. The species of the tested fungi were identified by the morphology of colony observed with microscope and DNA sequencing. The results revealed that 13 strains of “Jinhua” fungi were obtained from the 9 FZT samples. All the fungi had similar morphological characteristics to the Eurotium sp., while the strains of G9 and G10 were obviously different from the other “golden flora” fungi. By amplifying and sequencing the specific segments sequences of the ITS and β–tubulinand, comparing the homology sequence, analyzing phylogenetic trees, and referring to Hubka’s latest classification system of Aspergillus, the dominant fungi obtained from the FZT produced in different regions were identified as A. cristatus and the non-dominant fungi strains of G9, G10 were identified as A. chevalieri.

Fuzhuan tea; “Jinhua” fungi; molecular identification; taxonomy

TS272.5+4

A

1007-1032(2016)06-0592-09

2016–08–30

2016–10–15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571802)；湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(14A066)

趙仁亮(1983—)，男，河南周口人，博士研究生，主要從事茶葉加工及功能成分研究，584194216@qq.com；*通信作者，朱旗，教授，主要從事茶葉加工及功能成分研究，1965994459@qq.com