李先信，楊迎花，鄒學(xué)校，鄧子牛

(1.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a.園藝研究所；b.蔬菜研究所，湖南 長沙 410125；3.株洲市農(nóng)業(yè)局，湖南 株洲412007；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128)

湖南地方柚資源及其近緣種多樣性的SRAP分子評價

李先信1,2a，楊迎花3，鄒學(xué)校2b，鄧子牛4*

(1.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a.園藝研究所；b.蔬菜研究所，湖南 長沙 410125；3.株洲市農(nóng)業(yè)局，湖南 株洲412007；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128)

以湖南本地柚類資源為試材，應(yīng)用SRAP標(biāo)記對41份柚類資源及5份近緣種的遺傳多樣性進(jìn)行分析與鑒定。結(jié)果表明：平均每個引物組合可擴(kuò)增出16.6條譜帶，17對SRAP引物共擴(kuò)增出283條譜帶，其中多態(tài)性譜帶235條，多態(tài)率為83.0%，基因多樣度變幅為0.431 7～0.770 0，平均基因多樣度為0.544 3；獲得了21個基因型的37個SRAP特異性標(biāo)記，不同引物組合可將42個基因型完全分開；柚類及近緣種等位基因平均數(shù)、平均雜合位點(diǎn)占比、SRAP表型雜合度(H0)分別為9.02、67.77%和0.343。聚類分析結(jié)果顯示，41份柚種質(zhì)及5份近緣種材料在遺傳相似系數(shù)0.792處可分為6個組群：第1、2組群分別由24個和11個柚的地方品種構(gòu)成；第3組群為柚的種間雜種類型，包括菠蘿香柚、慈利金香柚、慈利甜柚2號和慈利水柚子；第4組群由慈利柚09–1、金瓜兩雜種柚和酸橙、臭皮柑兩近緣種組成；第5組群包括無核大紅甜橙和溫州蜜柑；第6組群為檸檬。綜合SRAP標(biāo)記結(jié)果與形態(tài)特征分析，認(rèn)為慈利金香柚可能源于以柚類為母本、以橙類(或?qū)捚ら兕?為父本的自然種間雜交后代。

柚；遺傳多樣性；種質(zhì)鑒定；湖南

投稿網(wǎng)址：http：//xb.ijournal.cn

Keywords： pummelo (Citrus grandis Osbeck); genetic diversity; germplasm identification; Hunan

柚(Citrus grandis Osbeck)是柑橘屬的3個基本種之一，是一類重要的種質(zhì)資源[1]，也是中國柑橘類中三大栽培種之一。中國作為世界柚類的原產(chǎn)地和遺傳變異中心，不僅有豐富的種質(zhì)資源，而且有長達(dá)3 000多年的栽培歷史[2]，柚類栽培遍及中國南部10多個省市自治區(qū)，已形成東南沿海地區(qū)、華南地區(qū)和西南地區(qū)3大柚產(chǎn)區(qū)[3]。目前中國選育和栽培的柚類品種、品系、類型和株系達(dá)200個以上[4]。湖南是中國內(nèi)陸性系統(tǒng)柚種質(zhì)的多樣化分布中心之一[2]，蘊(yùn)藏的柚類種質(zhì)資源極其豐富，經(jīng)過長期的自然演化與人類有目的的選擇與栽培后，柚類資源發(fā)生了廣泛的變異，形成了眾多的種群類型[5–6]，但對其進(jìn)行的系統(tǒng)研究尚少。因為對柚類資源的豐富度與特色缺乏了解，所以地方柚資源的開發(fā)利用一直受到限制。深入、系統(tǒng)地研究地方柚類資源的遺傳變異與種群構(gòu)成，分析其遺傳多樣性，對于有效保護(hù)與合理利用柚資源十分必要。

SRAP具有多態(tài)性豐富和操作快捷、簡便及不需要預(yù)知物種的序列信息等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用在果樹的遺傳多樣性檢測[7–8]、種質(zhì)鑒定[9–10]、遺傳圖譜構(gòu)建[11]等領(lǐng)域。本研究中采用SRAP技術(shù)對湖南省41個地方柚資源及其5個近緣種進(jìn)行遺傳多樣性分析與評價，以期更好地為保護(hù)與開發(fā)利用柚資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用41個柚資源及其5個近緣種材料均采自湖南省境內(nèi)(表1)。為更好地確定柚類種質(zhì)間的遺傳關(guān)系，選取酸橙、大紅甜橙、檸檬、臭皮柑和溫州蜜柑等柚的近緣種作為參照。

表1 41個柚種質(zhì)及其5個近緣種材料Table 1 41 pummelo germplasms and 5 relative species

1.2 DNA的提取與檢測

參照程運(yùn)江等[12]的方法提取幼葉基因組DNA。DNA經(jīng)純化后用1.0% 的瓊脂糖電泳檢測，并用核酸蛋白質(zhì)儀檢測其濃度與質(zhì)量，然后稀釋DNA濃度至50 ng/μL，–20 ℃保存，備用。

1.3 SRAP–PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Biometra Tgradient上進(jìn)行。25 μL 的反應(yīng)體系包括：3 μL 10×Tris–HCl，1.6 mmol/L MgCl2，0.12 mmol/L dNTP，0.4 U Taq DNA聚合酶，各0.1 μmol/L的上、下游引物，50 ng模板DNA。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行5個循環(huán) (94 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min)， 然后再進(jìn)行35個循環(huán) (94℃變性1 min，55 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min)，最后72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。在2%的瓊脂糖凝膠電泳上分離擴(kuò)增產(chǎn)物，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀測、照相，檢測PCR效果。

1.4 SRAP引物的合成與篩選

按照文獻(xiàn)[6]的原則設(shè)計引物。共設(shè)計合成10個正向引物和11個反向引物,組成110對SRAP引物組合進(jìn)行篩選(引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成)，選取擴(kuò)增譜帶清晰、多態(tài)性穩(wěn)定的引物組合進(jìn)行后續(xù)分析，10個正向引物為Me1，Me2，Me3，…，Me10；11個下游引物為Em1，Em2，Em3，…，Em11。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用篩選出的SRAP引物組合分析、鑒定柚類的種質(zhì)及其近緣種的遺傳多樣性。根據(jù)擴(kuò)增譜帶的“有”與“無”來統(tǒng)計擴(kuò)增結(jié)果，將遷移位置相同的譜帶記為一個位點(diǎn)，同一位點(diǎn)上有譜帶記為“1”，無譜帶記為“0”，依此對所有擴(kuò)增譜帶的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，構(gòu)建(0, 1)矩陣，并輸入計算機(jī)計算各位點(diǎn)在總樣本中的基因多樣度。參照Zhen等[13]的方法計算各品種的等位基因平均數(shù)、雜合位點(diǎn)占比，按Nei等[14]的方法計算各品種的平均SRAP表型雜合度。采用NTSYS–PC2.10e分析軟件計算各基因型間的遺傳相似系數(shù)。采用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，獲得聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP引物的PCR擴(kuò)增效率與多態(tài)性

用安江沙田柚、中秋蜜柚、慈利金香柚、胡柚、大紅甜橙和酸橙共6個差異較大的材料進(jìn)行引物篩選，從110對引物中篩選出17對能產(chǎn)生清晰多態(tài)性譜帶的引物。這些引物能檢測出至少9個、最多29個的基因位點(diǎn)。利用篩選出的引物組合對41個柚及其5個近緣種材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共檢測到283個基因位點(diǎn)，平均每對引物檢測到16.6個位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)235個，多態(tài)性位點(diǎn)占檢測到的總位點(diǎn)的比例達(dá)83.0%(各引物組合的多態(tài)性位點(diǎn)占比為57.9%～95.2%)。在283個位點(diǎn)上共擴(kuò)增出7 051條譜帶，其中多態(tài)性譜帶5 853條，平均每對引物在各基因型中檢測到的多態(tài)性譜帶為7.5條；平均每個位點(diǎn)檢測到9.02個等位基因，在檢測的所有位點(diǎn)上，等位基因數(shù)最多的引物組合是Me1/ Em2，最少的是Me7/Em11和Me8/Em2；基因多樣度變幅為0.431 7(Me8/Em1)～0.770 0 (Me5/Em9)，平均基因多樣度為0.544 3(表2)。統(tǒng)計結(jié)果表明，46份基因型中有21份產(chǎn)生了37個特異性遺傳標(biāo)記(圖1圓圈所示)， 用17對SRAP引物可將46份資源中的42份資源區(qū)別開來。

圖1 SRAP引物Me8/Em7對41份柚資源及5個近緣種的擴(kuò)增圖譜Fig.1 Electrophorogram of 46 pummelo germplasms and their relatives amplified by SRAP primer Me8/Em7

表2 SRAP檢測的位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)占比與基因多樣度Table 2 No. of loci, percentage of polymorphic loci and value of gene diversity detected by SRAP

表2(續(xù))

2.2 柚類資源及其近緣種的遺傳變異

在41份柚類種質(zhì)及其5份近緣種中，等位基因平均數(shù)最大的品種為江永酸柚(10.53)，最小的為慈利金香柚(7.29)，平均值為9.02；雜合位點(diǎn)占比最大的品種為江永酸柚 (72.63%)，最小的品種為慈利金香柚(60.48%)，其平均值為67.77%；SRAP 表型雜合度平均值為0.343。由聚類分析結(jié)果可知，各種群之間，雜合位點(diǎn)占比和平均SRAP表型雜合度均以柚類近緣種的最高，分別為69.69%、0.410，以雜種柚品種群的最低，分別為64.10%和0.312，以沙田柚為主的品種群和以文旦柚為主的品種群介于近緣種與雜種柚品種群之間，其中文旦柚品種群的雜合位點(diǎn)占比(68.27%)略高于沙田柚品種群的(68.16%)，而平均SRAP表型雜合度以沙田柚品種群的略高于文旦柚品種群的。在種群內(nèi)，雜合度以沙田柚品種群的辰州香柚和文旦柚品種群的江永酸柚的最高，分別為0.381和 0.398，而以白玉霜柚和安江香柚的最低，分別為0.302和0.287；種間雜種中以大庸金瓜的雜合度 (0.368) 最高，以慈利香柚的雜合度 (0.269) 最低；近緣種中以臭皮柑的雜合度 (0.385) 最低，以檸檬的雜合度 (0.439) 最高(表3)。

表3 柚類種質(zhì)及其近緣種的遺傳變異分析結(jié)果Table 3 Genetic variability of pummelo germplasm and their relatives

表3(續(xù))

2.3 柚類資源及其近緣種的UPGMA聚類分析結(jié)果

由SRAP數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果計算出的41份柚資源及其5份近緣種兩兩種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)可知，不同基因型間最大的遺傳相似系數(shù)為0.950 5(江永香柚與江永酸柚的)，最小的為0.554 8(安江紅心柚與檸檬的)，平均相似系數(shù)為0.736 9。在柚種群內(nèi)以江永香柚與江永酸柚的遺傳相似系數(shù)最大，為0.950 5，其次是吉首紅心柚與江永蜜柚的，為0.936 3。近緣種與柚類群之間以雜種柚‘慈利柚09–1’與臭皮柑的遺傳相似系數(shù)最大，為0.816 3，以安江紅心柚與檸檬之間的最小，為0.554 8。外類群之間以臭皮柑與酸橙的遺傳相似系數(shù)最大，為0.929 3，而以檸檬與溫州蜜柑的最小，為0.724 4。

由41個柚類及其5個近緣種基因型283個位點(diǎn)的SRAP標(biāo)記聚類分析結(jié)果(圖2)可知，以遺傳相似系數(shù)0.792為臨界點(diǎn)，41份柚類資源與5份近緣種聚類成6個組群。第I組群由1～24號共24個地方柚類品種組成；第Ⅱ組群由25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、37號共11個柚類品種組成；第Ⅲ組群由35、36、38、40號共4個雜種柚類型組成；第IV組包括39、43號2個雜種柚和41、44號2個近緣種；第V組群為42、46號近緣種；第VI組為45號近緣種。

圖2 41份柚資源及其5份近緣種的SRAP聚類分析圖Fig.2 Dendrogram of 41 pummelo germplasms and their 5 relatives based on SRAP markers

第I 柚組群在遺傳相似系數(shù)0.819時可以分為5個亞組，第1亞組有1、2、3、4、5、6、7、18、19號共9個品種，由沙田柚類群品種和文旦柚類群品種交互聚類而成，其中江永香柚與江永酸柚緊密地聚在一起，兩者的相似系數(shù)高達(dá)0.950 5；第2亞組由23、24號共2個品種組成，為文旦柚品種群；第3亞組包括8、10、11、12、13、14、15、17、20共9個品種，為文旦柚品種群；第4亞組為16、21、22號共3個品種，主要為文旦柚品種群；第5亞組為9號品種。

在相似系數(shù)0.849處第Ⅱ柚組群亦可分為3個亞組。第1亞組包括33、34號2個品種，為沙田柚品種群；第2亞組包括25、26、27、28、29、30、31、32號共8個品種，除30號外，主要為文旦柚品種群；37號慈利香柚單獨(dú)構(gòu)成第3亞組。

3 結(jié)論與討論

關(guān)于利用SRAP標(biāo)記鑒定柚類遺傳多樣性的可行性問題。SRAP標(biāo)記主要以開放讀碼框(ORFs)中的外顯子為主要目標(biāo)對外顯子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增，因不同個體的內(nèi)含子、啟動子及間隔區(qū)長度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP標(biāo)記以其豐富的多態(tài)性被廣泛地應(yīng)用于柑橘等果樹品種的遺傳多樣性分析[7–10]。筆者對湖南地方柚類資源及其近緣種進(jìn)行研究，用17對SRAP引物共檢測到283個基因位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)235個，平均每對引物檢測到16.6個基因位點(diǎn)，平均每個位點(diǎn)的等位基因數(shù)9.02個，多態(tài)性位點(diǎn)占比為83.0%，高于利用RAPD[15]對79份柚種質(zhì)及近緣種的多態(tài)性(81.71%)，也高于利用AFLP[16]對122份柚資源及近緣種的多態(tài)性(72%)，且每對SRAP引物檢測到的多態(tài)性帶數(shù)(13.8條)亦明顯高于ISSR[17](6.5條)和SSR[16](10.7條)每對引物檢測的多態(tài)性帶數(shù)。在46份基因型中有21份產(chǎn)生了37個特異性遺傳標(biāo)記，利用篩選的SRAP引物組合可以將42份基因型區(qū)別開來，因此，利用SRAP標(biāo)記來分析評價柚類資源的遺傳多樣性、鑒定品種是非常有效的。

關(guān)于湖南地方柚類資源各類群與其近緣種間的遺傳差異問題。雜合度是度量物種群體遺傳變異的重要參數(shù)，能反映出各群體在多個位點(diǎn)上的遺傳變異。本研究分析結(jié)果表明，湖南地方柚類資源及近緣種的平均雜合位點(diǎn)占比、SRAP表型雜合度平均值分別為67.77%和0.343，與劉勇[18]等用SSR標(biāo)記分析的結(jié)果類似，但在本研究中雜合位點(diǎn)占比、平均SRAP表型雜合度最高的為近緣種(分別為69.69%、0.410)，最低的是雜種柚品種群(分別為64.10%和0.312)，而以沙田柚為主的品種群和以文旦柚為主的品種群介于近緣種與雜種柚品種群之間，其中文旦柚品種群的雜合位點(diǎn)占比(68.27%)略高于沙田柚品種群的(68.16%)，而平均SRAP表型雜合度以沙田柚品種群的(0.345)略高于文旦柚品種群的(0.338)。試驗結(jié)果反映出柚類資源不同類群之間以及柚類資源與其近緣種間顯著的遺傳差異，同時也反映出湖南地方柚類資源及其近緣種間豐富的遺傳多樣性。

關(guān)于慈利金香柚的親本起源問題。慈利金香柚是湖南省的特色柚類良種，主要分布于慈利、常德、石門、桑植、張家界、吉首等縣(市)。該品種母株原為回蔸樹，通常被認(rèn)為是柚的芽變良種，但從其形態(tài)學(xué)性狀看，其樹形、樹姿、樹冠大小介于柚和橙之間，葉片大小及形狀與橙類相似，花瓣大多數(shù)為5瓣，與橙類和橘類相似，花的大小也介于柚類與橙類或柚類與橘類之間，果實的形狀、大小、果皮厚度等形態(tài)性狀與柚類相似，而果皮色澤橙紅色與橙類相似，表明慈利金香柚具有橙與柚的部分特征。SRAP聚類分析結(jié)果表明，慈利金香柚與菠蘿香柚、慈利甜柚2號、慈利水柚子等種間雜種柚緊密聚在一起，構(gòu)成第IV類群，其遺傳相似系數(shù)分別為0.858 7、0.826 9和0.826 9，說明其親緣關(guān)系較近，彼此間應(yīng)有相似或共同的親本來源。該結(jié)果與筆者基于形態(tài)性狀的聚類分析結(jié)果[19]完全吻合。綜合形態(tài)與SRAP標(biāo)記結(jié)果分析，認(rèn)為慈利金香柚起源于雜種后代，屬于柚類與橙類或柚類與寬皮橘類的自然種間雜種，但其確切的親本來源尚需進(jìn)一步研究確定。該猜想印證了鐘廣炎等[20]應(yīng)用同工酶分析的研究結(jié)果。從形態(tài)性狀和遺傳相似系數(shù)判斷，慈利金香柚和慈利水柚子可能是以柚類為母本、以橙類(或?qū)捚ら兕?為父本進(jìn)行自然雜交所得，而菠蘿香柚和慈利甜柚2號可能是以橙類(或?qū)捚ら兕?為母本、以柚類為父本自然雜交而來。雜種柚品種慈利柚09–1和大庸金瓜與近緣種臭皮柑和酸橙聚類為第V類群，說明他們的起源與近緣種臭皮柑和酸橙有關(guān)。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Molecular level’s evaluation on the genetic diversity of pummelo germplasm and their relative species in hunan province based on srap markers

Li Xianxin1,2a, Yang Yinghua3, Zhou Xuexiao2b, Den Ziniu4*
(1.Longping Branch of Central South University, Changsha 410125, China; 2.a.Horticultural Research Institute; b.Vegetable Research Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China; 3.Zhuzhou Agriculture Bureau, Zhuzhou, Hunan 412007, China; 4.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Genetic diversity of 41 pummelo (Citrus grandis Osbeck) germplasms and 5 relative species collected from Hunan province were identified and evaluated using the markers from sequence related amplified polymorphism (SRAP). The results showed that the average number of 16.6 alleles could be amplified out from every primer combination, and total of 283 alleles were detected from 17 SRAP markers, 235 out of which presented polymorphic, accounted for 83.0%. Gene diversity value changed from 0.431 7 to 0.770 0 with an average of 0.544 3 for each primer, which showed a high level of genetic diversity among the analyzed germplasms. 37 specific SRAP polymorphic bands were scored, and 42 genotypes from the 46 germplasms were completely identified by SRAP markers. The mean number of alleles per locus (A), percentage of polymorphic loci (P) and direct count heterozygosity (H0) of the genotypes from the pummelo germplasms and their relative species were 9.02, 67.77% and 0.343, respectively. 41 pummelo germplasms and 5 relatives could be clustered into 6 groups with the similarity coefficient of 0.792 by the method of UPGMA. Group 1 and group 2 were respectively composed of 24 and 11 pummelo varieties, group 3 was hybrid pummelos, group 4 was two of hybrid pummelos and two relatives, group 5 included two relatives of seedless red peel orange and Satsuma mandarin, and group 6 was only limon (Citrus limon (L.) Burm f.). Parental origin of the hybrid pummelos were discussed in the paper as well.

S666.3

A

1007-1032(2016)06-608-07

2016–09–15

2016–09–20

湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目(2014td04)；中南大學(xué)博士創(chuàng)新基金項目(2340–77226)

李先信(1962—)，男，湖南瀏陽人，博士研究生，研究員，主要從事柑橘資源與育種研究，nkylxx118@163.com；*通信作者，鄧子牛，教授，博士，主要從事柑橘遺傳育種研究，deng7009@163.com