李琴，毛玉梅，付鳴佳，沈俊良，金華燕，鐘雪晴

(江西師范大學生命科學學院，江西 南昌 330022)

蛹蟲草中藍光受體基因Cmwc–1和Cmwc–2的表達特性分析

李琴，毛玉梅#，付鳴佳*，沈俊良，金華燕，鐘雪晴

(江西師范大學生命科學學院，江西 南昌 330022)

采用 RT–PCR克隆蛹蟲草中藍光受體基因Cmwc–1和Cmwc–2。結果表明，Cmwc–2基因序列的翻譯產物CmWC–2中存在1個PAS結構域和1個鋅指結構域。實時熒光定量PCR結果顯示，蛹蟲草菌絲體Cmwc–1和Cmwc–2基因的表達量分別在藍光照射后6 h和2 h達到峰值。子實體形成不同階段Cmwc–1和Cmwc–2的相對轉錄量都有較大差異，生長50 d時蛹蟲草子實體不同部位的Cmwc–1表達主要在子實體的中下段，Cmwc–2的表達主要在子實體的頂端和中段，畸形子實體中Cmwc–1和Cmwc–2的表達量都不高。

蛹蟲草；藍光；藍光受體；基因Cmwc–1；基因Cmwc–2

投稿網址：http：//xb.ijournal.cn

真菌可感受環(huán)境中的各種信號因子，光照是其中重要的因子。藍光影響真菌的生長和發(fā)育，可以導致真菌的形態(tài)建成和生理生化變化，包括無性孢子的產生[1–2]、菌絲的生長發(fā)育[3]、趨光性[4–5]和類胡蘿卜素產生[6–8]等。真菌受藍光影響的研究[4–5,9–16]已經較為深入，已經在多種真菌中克隆和測序了多個感受藍光信號的藍光受體蛋白基因，對其中藍光受體蛋白感受藍光信號相關機制的研究已較深入。真菌中藍光受體大都帶有PAS域 (Per–Arnt–Sim domain)，只是不同真菌來源藍光受體的PAS域數(shù)量有差異[4–5,9–16]。PAS域可以使不同藍光受體間結合成復合體(white collar complex，WCC)結構[17–19]。此外，部分藍光受體中帶有LOV 域(light, oxygen or voltage domain)，可結合有色素基團黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)，用于接受藍光信號[10,20]。真菌中藍光受體蛋白大多為鋅指蛋白(zinc finger protein)，表明藍光受體接受藍光信號以后轉變成有活性的轉錄因子，產生生理和生化效應[4–5,9–14]。目前對脈孢菌(Neurospora crassa)中藍光受體蛋白White Collar–1(WC–1)、White Collar–2 (WC–2)和VIVID[9–11,21]的研究已比較成熟，這為其他真菌藍光受體的研究提供了依據。

蛹蟲草(Cordyceps militaris)是一種很重要的食藥兼用真菌。根據《中華人民共和國食品衛(wèi)生法》和《新資源食品管理辦法》，蛹蟲草已在中華人民共和國衛(wèi)生部2009年3號公告中被列為新資源食品。目前對蛹蟲草的研究主要集中在蛹蟲草的栽培培養(yǎng)、有效成分提取和品種形態(tài)描述等方面，對菌絲體生長和子實體的形成機制研究不多。筆者對蛹蟲草中2個藍光受體基因進行克隆，并對這2個藍光受體基因在蛹蟲草菌絲體和子實體中的表達特性進行分析，旨在揭示光照對蛹蟲草子實體形成的影響。

1 材料和方法

1.1 菌種

蛹蟲草菌株(Cordyceps militaris F411)由江西師范大學生命科學學院生物技術實驗室保藏。

1.2 蛹蟲草菌絲體的藍光誘導培養(yǎng)和取樣

將蛹蟲草菌種接種在加了1%奶粉的PDA培養(yǎng)基中，在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。將接種的培養(yǎng)皿用錫鉑紙包裹，在黑暗中培養(yǎng)4 d后去除錫鉑紙，持續(xù)進行藍光光照培養(yǎng)，并在設定的照射時間點迅速將蛹蟲草置于–80 ℃冰凍，用于提取蛹蟲草總RNA。

1.3 蛹蟲草子實體的培養(yǎng)和取樣

將蛹蟲草已經活化菌種接入到100 mL PDB培養(yǎng)基中，20 ℃搖菌至菌絲體成球狀，直徑約0.4 mm，而后取5 mL液體菌種接種到固體培養(yǎng)基中(將30 g優(yōu)質大米加入到450 mL罐頭瓶中，再加入液體培養(yǎng)基35 mL，高壓121 ℃滅菌40 min)，于溫度20 ℃、相對濕度75%左右避光培養(yǎng)。待菌絲布滿整個平面并扎到瓶底時開始見光，補充日光燈照于溫度20 ℃、相對濕度70%下培養(yǎng)。當培養(yǎng)基表面出現(xiàn)米粒狀的橘黃色菌蕾時換透氣瓶蓋，繼續(xù)見光培養(yǎng)至子實體形成。

待蛹蟲草形成子實體原基后取樣。取樣時分2種情況：一是對在不同階段的子實體取樣，分別是接種后18 d的菌絲體、接種后18 d的子實體原基、20 d子實體、24 d子實體、28 d子實體、32 d子實體、36 d子實體、40 d子實體和45 d子實體；二是對生長50 d的正常子實體和畸形子實體取樣，其中將正常生長的子實體分為頂端膨大部分、子實體上段(子實體上部1/3)、子實體中段(子實體中部1/3)和子實體下段(子實體下部1/3) 4個部分。每次取樣后，–80 ℃超低溫冰箱保存。

1.4 蛹蟲草總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

按照Trizol試劑(上海生工生物工程有限公司)說明書提取蛹蟲草RNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳和OD值檢測。以Oligo(dT)15為引物，用第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程有限公司)將所提取的總RNA 反轉錄成cDNA，用作基因的克??；熒光定量cDNA第一鏈的合成參照PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser(大連寶生物工程有限公司)試劑盒說明書進行。

1.5 蛹蟲草Cmwc–1和Cmwc–2基因的克隆

根據http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez? db=Nucleotide&cmd=Search&term=AEVU01000000 NCBI上相關蛹蟲草序列Cordyceps militaris CM01 whole genome shotgun sequence contig55(GenBank序列號為AEVU010 00055.1)和contig5(GenBank序列號為AEVU01 000005.1)設計引物[22]。使用軟件ORF finder尋找藍光受體基因的ORF，再使用Oligo 6.0軟件設計一系列引物(表1)。 PCR反應程序：95 ℃預變性2 min，94 ℃變性 40 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個循環(huán)。Cmwc–1–mRNA和Cmwc–1–mRNA的3'端采用3'–RACE方法進行擴增，其cDNA第一鏈的合成采用引物3'Adaptor Primer。1st PCR采用Downtouch PCR，引物GSP1和3'Outer；2nd PCR使用的引物為GSP2和3' Inner。

表1 PCR擴增中用到的引物Table 1 Primers for PCR amplification

1.6 蛹蟲草Cmwc–1和Cmwc–2表達的real–time PCR檢測

針對Real–time PCR設計擴增Cmwc–1基因和Cmwc–2基因的部分序列引物列于表2。內標基因采用管家基因甘油醛–3–磷酸脫氫酶(glyceraldehyde–3–phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因，在NCBI上搜索到了GAPDH基因(GenBank序列號為FJ374269.1)[23]，并設計相應的引物(表2)。每個反應設置3 次重復，取平均值，用2–ΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

表2 在熒光定量PCR中用到的引物Table 2 Primers for RT–qPCR amplification

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草Cmwc–2的克隆和序列分析結果

將蛹蟲草總RNA經反轉錄后得到的cDNA作為PCR的底物，用上游引物WC2e1及下游引物WC2e2進行PCR擴增，得到Cmwc–2基因的序列，長度約為1 575 bp(圖1)，通過3' 端RACE方法獲得了長1 009 bp的3' 端序列。用DNAman軟件對上述兩端序列進行拼接及比對，得到了Cmwc–2–mRNA的部分序列，其長度為1 575 bp (其GenBank序列號為JX852619.1)，且ORF序列長度為1 509 bp。

圖1 蛹蟲草Cmwc–2基因開放讀框中部分序列的PCR擴增結果Fig.1 Electrophoresis of partial sequence of PCR products from gene Cmwc–2 open reading frame in C. militaris

使用DNASTAR editseq的Translate DNA功能得到Cmwc–2基因ORF可能的翻譯后的蛋白質CmWC–2，其氨基酸序列長度為502 aa，GeneBank序列號為AFZ15762.1。序列呈送NCBI后初步確定為cutinase palindrome–binding protein。進一步分析表明，CmWC–2包含1個PAS功能域(161～235)和1個GATA型的鋅指結構域(447～484)。將CmWC–2的氨基酸序列在http：//smart.embl–heidelb erg.de/進行在線分析，得到了與上述一致的結果(圖2)。 將CmWC–2氨基酸序列在NCBI上進行蛋白質BLAST比對的結果表明，CmWC–2與多種真菌中的WC–2蛋白有很高的同源性。 用DNAman軟件將蛹蟲草中CmWC–2的PAS域和鋅指結構域分別與7種真菌的WC–2相應功能域進行比對的結果表明，CmWC–2與球孢白僵菌(Beauveria bassiana， NCBI參考序列號為XP_008594722.1)、Stachybotrys chlorohalonata (GenBank序列號為KFA63896.1)、脈孢菌(Neurospora crassa，GeneBank序列號為XP_963819.3)、冬蟲夏草(Ophiocordyceps sinensis，GenBank序列號為 EQK98372.1)、水稻惡苗病菌(Fusarium fujikuroi，GenBank序列號為CCT62872.1)、頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum，GenBank序列號為KFH41821.1)和羅伯茨綠僵菌(Metarhizium robertsii，NCBI 參考序列號為

XP_007823629.2)中相應的功能結構域都有同源性(圖3)。

圖2 蛹蟲草藍光受體CmWC–2的功能域Fig.2 Functional domain of blue light receptor CmWC–2 in C. militaris

圖3 不同真菌WC–2中的PAS結構域與GATA型鋅指結構域的同源性分析結果Fig. 3 Homology of PAS domain and GATA type of zinc finger domain in WC–2 for different fungus

2.2 蛹蟲草Cmwc–1的克隆和序列分析結果

用分段上游引物WC1e1U、WC1e2U、WC1e3U、WC1e4U、WC1e5U分別與分段下游引物WC1e1D、WC1e2D、WC1e3D、WC1e4D、WC1e5D對應進行PCR擴增，得到Cmwc–1基因ORF的5個分段序列，3' 端RACE方法可獲得1 020 bp左右的序列。 將得到的序列采用DNAman軟件分析，Cmwc–1–mRNA長為3 248 bp(GenBank序列號為JX845417.1)，且ORF序列長度為2 892 bp。

用軟件DNASTAR editseq中的Translate對Cmwc–1基因進行ORF翻譯后，獲得的蛋白質CmWC–1的氨基酸序列長度為963 aa(GenBank 序列號為AFU65172.1)。將其于NCBI上進行蛋白質分析比對的結果（圖 4）表明，此蛋白質為GATA型鋅指結構蛋白(zinc finger domain–containing protein，GATA–type)，包含3個PAS結構域(324～440，520～618，639～734)和一個鋅指結構功能域(836～882)。

圖4 蛹蟲草藍光受體CmWC–1的功能域Fig.4 Functional domain of blue light receptor CmWC–1 in C. militaris

2.3 蛹蟲草Cmwc–1和Cmwc–2基因表達的real–time PCR檢測結果

2.3.1 蛹蟲草菌絲體藍光誘導下的Cmwc–1和

Cmwc–2表達的real–time PCR檢測結果結果表明，Cmwc–1和Cmwc–2基因在無藍光情況下的相對表達量非常低，在有藍光情況下的相對表達量有很大的變化，其中Cmwc–2基因的相對表達量在持續(xù)藍光照射之初有個快速的上升，在藍光照射2 h的時候達到最大值，而后快速下降并維持在較低水平，至照射12 h時又開始快速上升，在照射14 h時出現(xiàn)第2次高峰，但轉錄水平值比照射2 h時的小(表3)。 Cmwc–1基因表達量的上升較慢，在藍光照射6 h時出現(xiàn)峰值，隨后平緩下降，在藍光照射22 h也再次出現(xiàn)峰值，轉錄水平也比照射6 h時的小(表3)。比較這2種藍光受體的表達，Cmwc–1基因的表達有一個明顯的滯后效應，且Cmwc–2基因每次出現(xiàn)表達高峰時，Cmwc–1基因的表達也有所上升。另外Cmwc–2的相對表達量比Cmwc–1的相對表達量要高很多。

表3 藍光照射下蛹蟲草菌絲體Cmwc–1和Cmwc–2基因mRNA的相對表達量Table 3 mRNA relative expression level of gene Cmwc–1 and Cmwc–2 in C. militaris under the blue light radiation of different time

2.3.2 蛹蟲草子實體不同生長階段Cmwc–1和

Cmwc–2表達的real–time PCR檢測結果檢測結果表明：蛹蟲草每個生長階段Cmwc–1和Cmwc–2的相對轉錄量都有較大的差異(圖5)。Cmwc–1總體相對轉錄量較低，在菌絲體、原基和子實體0～1 cm階段相對轉錄量非常低，而在子實體長至1～2 cm(生長24 d)時上升很快，而后在子實體2～3 cm(生長28 d)時又迅速降低，在子實體3～7 cm(生長32～45 d)階段一直保持穩(wěn)定的低轉錄水平。Cmwc–2基因總體相對轉錄量較高，在菌絲體、原基和子實體0～3 cm(生長18～28 d)時的相對轉錄量保持穩(wěn)定，在子實體3～4 cm(生長32 d)時快速上升，而在子實體4～6 cm(生長36～40 d)又降到了相對最低，最后在子實體6～7 cm(生長45 d)時階段上升到了與子實體3～4 cm(生長32 d)階段相當?shù)乃健?/p>

圖5 蛹蟲草子實體不同生長階段Cmwc–1和Cmwc–2的相對表達量Fig.5 mRNA relative expression level of gene Cmwc–1 and Cmwc–2 at different growing stages of fruiting body of C. militaris

2.3.3 蛹蟲草子實體不同部位Cmwc–1和Cmwc–2表達的real–time檢測結果

蛹蟲草子實體生長過程中可產生正常子實體和畸形子實體，本研究中所用的為生長50 d的正常子實體(子實體長7～8 cm)和畸形子實體。將正常生長的子實體分為4個部分：頂端膨大部分、子實體上段(子實體上部1/3)、子實體中段(子實體中部1/3)和子實體下段(子實體下部1/3)。 對正常子實體4個部分和畸形子實體的Cmwc–1、Cmwc–2表達的相對轉錄量進行檢測與分析的結果(圖6)顯示：正常子實體中Cmwc–1在頂端膨大部分相對轉錄量極低，在子實體下段的轉錄量相對較高；畸形子實體Cmwc–1基因的轉錄水平與正常子實體中段的相似。Cmwc–2的相對轉錄量在子實體中段部分最高，在子實體頂端膨大部分較高，在其他部分的轉錄量相對較低；Cmwc–2在畸形子實體中的基因轉錄水平與正常子實體中段的相當。

圖6 蛹蟲草子實體不同部位Cmwc–1和Cmwc–2的相對表達量Fig.6 mRNA relative expression level of gene Cm wc–1 and Cmwc–2 at different fruiting body sections of C. militaris

3 結論與討論

藍光是很重要的環(huán)境因子，真菌可以感受到藍光信號，并產生生理和生化改變，而其感受藍光的重要機制就是在菌體中產生藍光受體。本研究中克隆了蛹蟲草2個藍光受體基因Cmwc–1和Cmwc–2的ORF序列，并確定了這2個基因翻譯產物CmWC–1和CmWC–2的氨基酸序列。結果表明，在CmWC–1中有3個PAS域(其中第1個PAS域也稱做LOV域)和1個鋅指結構域。該結果與文獻[24]中的CmWC–1基本相同。在CmWC–2中有1個PAS域和1個鋅指結構域， CmWC–2與另外7種真菌藍光受體WC–2相應結構域的同源性很高。CmWC–1和CmWC–2的結構與脈孢菌中藍光受體蛋白WC–1和WC–2的結構類似[9,11]，CmWC–1和CmWC–2是蛹蟲草中的藍光受體蛋白。蛹蟲草中藍光受體蛋白WC–1和WC–2均帶有PAS結構域，表明這2個藍光受體在行使功能時可形成CmWC–1/CmWC–2復合體結構。

藍光受體WC–1和WC–2帶有鋅指結構，表明這類蛋白質為轉錄因子，調控其他基因的表達[9–11]。蛹蟲草Cmwc–1和Cmwc–2基因的充分表達在藍光照射6 h比較合適，Cmwc–1轉錄水平峰值的出現(xiàn)與Cmwc–2的并不同步。在脈孢菌中wc–1基因的表達對wc–2基因的表達存在負反饋作用[18]。蛹蟲草中Cmwc–1和Cmwc–2基因表達的不同步可推測這種負反饋機制可能存在。

Cmwc–2基因的相對轉錄量比Cmwc–1基因的高很多。在脈孢菌中，WC–1和WC–2通過PAS域形成復合體(white collar complex ，WCC)結構，且WCC復合體中含有超過1個以上的WC–1分子[18]，所以蛹蟲草中Cmwc–1和Cmwc–2基因表達量的差異表明在形成CmWC–1/CmWC–2復合體時，其復合體結構不同于脈孢菌中的WCC結構。

在蛹蟲草的菌絲體和子實體中均存在Cmwc–1和Cmwc–2基因的表達,說明這2個藍光受體基因的表達產物形成的CmWC–1/CmWC–2復合體對蛹蟲草菌絲體和子實體發(fā)育有重要作用。這2個基因在蛹蟲草子實體不同生長發(fā)育階段的相對表達量不同。 Cmwc–1在子實體形成前期的表達量很低，在接近中期時有個快速的增長，中后期的表達比較穩(wěn)定；Cmwc–2的相對表達量在子實體形成的前期和中期都維持在一個較高的水平，在中后期有較大的波動。由此可推測：在子實體形成的前期和中期，Cmwc–1和Cmwc–2基因表達有利于促進CmWC–1/ CmWC–2復合體的形成和子實體的生長發(fā)育。這2個基因在蛹蟲草子實體不同部位的相對表達量也不同， Cmwc–1在子實體頂端的表達量極低，其表達主要集中在子實體的中下段部位，而Cmwc–2在子實體的頂端部位和中段部位均有較好的表達。這表明子實體頂端的生長不依賴于CmWC–1/ CmWC–2復合體的形成，而子實體中、下部分的生長可能依賴CmWC–1/CmWC–2復合體結構。

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責任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Expression characteristics of blue light receptor Cmwc–1 and Cmwc–2 gene from Cordyceps militaris

Li Qin, Mao Yumei#，F(xiàn)u Mingjia*, Shen Junliang, Jin Huayan, Zhong Xueqing
(College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

ORF sequence of gene Cmwc–1 and Cmwc–2, the blue light receptor, were cloned from fungus Cordyceps militaris by approach of RT–PCR. There were 1 PAS functional domains and 1 zinc finger functional domain at putative CmWC–2 amino acid sequence in Cmwc–2 ORF. The real-time PCR results showed that the translation of gene Cmwc–1 and Cmwc–2 reached their peaks in 6 h and 2 h, respectively. The relative transcription level of gene Cmwc–1 and Cmwc–2 were quite different according to their growing stages. The relative transcription level of Cmwc–1 was mainly distributed at the middle and lower section of fruiting body, and rarely spotted at the top after 50 d inoculation, while, it was mainly at the top and the middle section for Cmwc–2. There were little relative transcription level of Cmwc–1 and Cmwc–2 in abnormal fruiting body.

Cordyceps militaris; blue light; blue light receptor; Cmwc–1; Cmwc–2

Q939.5

A

1007-1032(2016)06-0601-07

2015–12–31

2016–10–24

國家自然科學基金項目(31060004；31260010)

李琴(1990—)，女，江西南昌人，碩士研究生，主要從事真菌分子生物學研究，15070811079@163.com；#共同第一作者，毛玉梅(1989—)，女，山東聊城人，碩士研究生，主要從事真菌分子生物學研究，maoyumei.love@163.com；*通信作者，付鳴佳，博士，教授，主要從事真菌分子生物學研究，mingjiafu@126.com