安 亮, 蘇 燕

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)

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人類紅細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展*

安 亮1，2, 蘇 燕1

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)

20世紀(jì)末人類基因組計(jì)劃將生物醫(yī)學(xué)研究推入了“組學(xué)”研究的時(shí)代，蛋白質(zhì)組學(xué)無疑是最核心的部分。蛋白質(zhì)組學(xué)包括蛋白質(zhì)的定位、結(jié)構(gòu)和功能、蛋白質(zhì)相互作用以及特定時(shí)空的蛋白質(zhì)表達(dá)譜等。紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)是血液中數(shù)量最多的血細(xì)胞，起著運(yùn)送氧、二氧化碳等的重要功能。相對(duì)于其它細(xì)胞，紅細(xì)胞易獲得、易純化、結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單的特點(diǎn)使它成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的最佳選擇[1]，也是不久的將來最有可能完成完整蛋白質(zhì)組學(xué)分析的細(xì)胞。在過去的十幾年中，隨著質(zhì)譜和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，紅細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究取得了一系列的進(jìn)展。

1 紅細(xì)胞的蛋白組成

紅細(xì)胞發(fā)源于骨髓造血干細(xì)胞，由于沒有細(xì)胞核和內(nèi)膜系統(tǒng)，紅細(xì)胞內(nèi)的蛋白主要分為膜蛋白、膜骨架及胞漿蛋白。膜蛋白分為內(nèi)在蛋白和外周蛋白以及脂錨定蛋白；膜骨架蛋白是細(xì)胞膜下與膜蛋白相連的由纖維蛋白組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，參與維持質(zhì)膜性狀并協(xié)助完成其多種生理功能；胞漿蛋白主要為血紅蛋白(hemoglobin，Hb)，其次還含有碳酸酐酶、硫氧還蛋白過氧化物酶和其它抗氧化酶。

2 紅細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展

研究紅細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)，需要了解紅細(xì)胞中每種蛋白質(zhì)的氨基酸序列、轉(zhuǎn)錄后修飾以及每個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量及蛋白間的相互作用。現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)的應(yīng)用，使人們對(duì)紅細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)有了深層次的認(rèn)識(shí)。2002年之前人們對(duì)紅細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究并未全面展開，爾后隨著這一領(lǐng)域相關(guān)研究技術(shù)的進(jìn)展，紅細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究緊密跟進(jìn)。2002年，Low等首次使用雙向電泳分離紅細(xì)胞膜蛋白，銀染后用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定出84種膜蛋白。之后，Kakhniashvili等利用經(jīng)典的RBC分離技術(shù)，聯(lián)合Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法和ThermoFinnigen LCQ DECA XP離子阱串聯(lián)質(zhì)譜鑒定了RBC中181種膜蛋白和胞漿蛋白，其中包括血型糖蛋白A和C及只有幾百拷貝數(shù)的其他蛋白(如基細(xì)胞黏連分子B-CAM)。Neelam等[2]利用免疫共熒光和蛋白質(zhì)免疫印跡證明，RBC中存在蛋白酶體亞型和完整的蛋白酶體，打破之前RBC中沒有蛋白酶體降解蛋白的研究報(bào)道。2006年底，Pasina等[3]利用四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜和Thermo熱電混合線性離子阱傅里葉變換質(zhì)譜鑒定出RBC內(nèi)566種蛋白質(zhì)，包括314種膜蛋白和252種可溶性蛋白質(zhì)。同時(shí)，Pasini等用乙醇和碳酸鈉優(yōu)化膜蛋白提取方法，對(duì)蛋白質(zhì)鑒定產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性技術(shù)上的貢獻(xiàn)。至此，忽略轉(zhuǎn)錄后修飾和蛋白水解，共鑒定出751種RBC蛋白質(zhì)。隨著肽配體庫和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，2008年，Roux-Dalvai等[4]通過快速和高通量Electron LTQ Orbitrap質(zhì)譜成功鑒定出1578種RBC胞質(zhì)蛋白。2010年，Proteominer技術(shù)的應(yīng)用使紅細(xì)胞蛋白質(zhì)數(shù)量增加1 331種，達(dá)到2 082種[5]。2010年至今，紅細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)展主要集中在膜蛋白領(lǐng)域。van Gestel等[6]用雙向藍(lán)色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)從524種膜蛋白中鑒定出其中67種是胞漿蛋白。最近，這項(xiàng)技術(shù)被拓展為四維正交凝膠系統(tǒng)。該系統(tǒng)由非變性電泳部分及變性電泳部分組成。通過非變性電泳對(duì)RBC及Raji細(xì)胞胞質(zhì)蛋白的分離并結(jié)合SDS-PAGE和質(zhì)譜分析，確定了六種蛋白質(zhì)復(fù)合體，即蛋白酶體20S核心復(fù)合體、HbA、HbA2、過氧化物氧化酶-2(peroxiredoxin-2，Prx2)、碳酸酐酶-1(carbonic anhydrase-1，CA1)以及熱休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)復(fù)合體。從中選擇四種具有不同分子量和等電點(diǎn)的復(fù)合體：CP、HbA、Prx2及HSP60進(jìn)行變性電泳蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果表明，4-DES不僅適用于復(fù)雜生物樣品中的蛋白質(zhì)復(fù)合體及蛋白質(zhì)相互作用的研究，而且可用于復(fù)雜稀釋樣品中完整蛋白質(zhì)復(fù)合體的分離富集[7]。De Palma等[8]將完整RBC用胰蛋白酶消化后分離膜蛋白，將其用Triton X-100溶解后分離可溶部分和膜骨架，將二者再用胰蛋白酶消化，用MudPIT技術(shù)和線性離子阱LTQ質(zhì)譜對(duì)這三部分進(jìn)行蛋白鑒定。結(jié)果顯示，確定的299種蛋白中211種是膜蛋白。Speicher等[9]用SDS-PAGE分離紅細(xì)胞膜蛋白后將凝膠分成30等份，之后用LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜分析鑒定了842種蛋白。創(chuàng)新性的方法的應(yīng)用，使紅細(xì)胞蛋白質(zhì)總數(shù)從2010年的2082上升到2 289，僅增加了207種。因此，要鑒定所有的RBC蛋白質(zhì)還有很長的路要走，這有待于更高靈敏度和準(zhǔn)確性的質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展。

3 紅細(xì)胞蛋白相互作用的研究

蛋白質(zhì)通過與其它物質(zhì)(蛋白質(zhì)，核酸，小分子等)相互作用而行使其功能，一旦這種有序的相互作用遭到破壞，就會(huì)導(dǎo)致疾病甚至死亡。因此，蛋白質(zhì)與其它物質(zhì)的相互作用成為人類疾病預(yù)防和治療的重要對(duì)象，而蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用又成為其中最關(guān)鍵的一部分。在高通量RBC及RBC膜蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)獲得后，關(guān)于RBC內(nèi)蛋白質(zhì)之間的相互作用主要是通過生物信息學(xué)進(jìn)行預(yù)測(cè)。初步的紅細(xì)胞相互作用分析是基于UniHI數(shù)據(jù)庫[9，10]。Goodman等最初基于已發(fā)現(xiàn)的RBC內(nèi)751種蛋白建立了RBC蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并發(fā)現(xiàn)751種蛋白中有279種與其它蛋白之間存在相互作用。在對(duì)紅細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用的研究中重要的發(fā)現(xiàn)是“損傷和修復(fù)”盒，此盒主要由蛋白酶體亞基、伴侶分子、熱休克蛋白組成，對(duì)紅細(xì)胞的損傷修復(fù)至關(guān)重要。Ammann和Goodman[11]用稱為廣泛拓?fù)渲丿B分析的方法對(duì)節(jié)點(diǎn)的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的聚類分析。運(yùn)用這樣的方法發(fā)現(xiàn)在鐮刀形紅細(xì)胞貧血中“損傷和修復(fù)”盒中的蛋白酶體亞基發(fā)生改變。這之后有學(xué)者提出了VDG的概念對(duì)紅細(xì)胞蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行分析，認(rèn)為這是一種比聚類分析更快速的分析方法[12]。

4 疾病的紅細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)

早期對(duì)RBC蛋白質(zhì)組學(xué)與疾病關(guān)系的研究是利用雙向電泳來比較疾病組織與正常組織中的蛋白質(zhì)含量。Jiang等[13]用這樣的方法比較正常人群和2型糖尿患者之間膜蛋白的差異，在2型糖尿患者的膜蛋白中發(fā)現(xiàn)了27個(gè)上調(diào)點(diǎn)和15個(gè)下調(diào)點(diǎn)。經(jīng)MALDI TOF質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)脂筏蛋白、Flotlin 1、精氨酸酶增加，突觸融合蛋白1C減少。推測(cè)融合蛋白減少會(huì)導(dǎo)致2型糖尿病紅細(xì)胞膜Glut 4糖尿病載體減少，推測(cè)由于精氨酸酶增加而與一氧化氮合酶競(jìng)爭(zhēng)，從而減少一氧化氮產(chǎn)生。Tonge等[14]利用2D-DIGE研究純合子鐮狀細(xì)胞疾病(sickle cell disease，SCD)時(shí)發(fā)現(xiàn)，SCD紅細(xì)胞膜蛋白中有38個(gè)點(diǎn)增加，而純合子SCD中有11個(gè)點(diǎn)增加。用Nano LC MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)44個(gè)點(diǎn)進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)其中有22個(gè)有轉(zhuǎn)錄后修飾，而純合子中的蛋白多數(shù)與氧化應(yīng)激有關(guān)。Prabakaran等[15]用2D-DIGE對(duì)精神分裂患者的紅細(xì)胞蛋白進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，Spectrinα和β-actin的改變可能會(huì)影響轉(zhuǎn)錄后修飾的改變，而硒綁定蛋白1可作為一種精神分裂癥的生物標(biāo)志物。最近對(duì)疾病與紅細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要是利用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)疾病的分子基礎(chǔ)、疾病進(jìn)程等進(jìn)行研究，瘧疾、溶血性貧血、阿爾茨海默病、慢性腎病等紅細(xì)胞膜蛋白組學(xué)的相關(guān)研究取得了一定的進(jìn)展。

紅細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究為我們提供大量的數(shù)據(jù)和信息，同時(shí)也為研究帶來困擾。如何通過海量信息找尋隱藏其中的奧秘，需要我們?cè)诮窈蟮难芯恐胁粩噙M(jìn)行挖掘。

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國家自然科學(xué)基金(81160214)、內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2010BS1101)、內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳基金(2010056)和內(nèi)蒙古自治區(qū)研究生教育創(chuàng)新項(xiàng)目(S201310127-Y02、S201410127-Y01)

蘇 燕

2015-08-26)