張　杰，宋　磊，段登輝，岳　林△

(1. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院牙體牙髓科，北京　100081； 2. 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京　100101；　3. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院綜合科，北京　100081)

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·論著·

寡發(fā)酵鏈球菌在大鼠口腔內(nèi)定植狀態(tài)的觀察

張杰1，宋磊2，段登輝3，岳林1△

(1. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院牙體牙髓科，北京100081； 2. 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京100101；3. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院綜合科，北京100081)

[摘要]目的：對(duì)寡發(fā)酵鏈球菌在大鼠口腔內(nèi)高糖環(huán)境下的定植能力進(jìn)行初步探索。方法：21天齡SPF-SD大鼠48只，24～27天喂以氨芐青霉素水溶液(內(nèi)源性細(xì)菌抑制)，28天時(shí)將大鼠分為4組，每組12只，高糖持續(xù)飼喂，28～30天連續(xù)3天接種菌液，組1(SM組)接種變形鏈球菌菌液，組2(SO組)接種寡發(fā)酵鏈球菌菌液，組3(SO+SM混合接種組)接種變形鏈球菌和寡發(fā)酵鏈球菌混合菌液，組4為陰性對(duì)照組，不接種任何菌液。細(xì)菌接種次日和第10天，用無菌棉簽擦取大鼠雙側(cè)下頜磨牙(6顆)牙合面、頰、舌面的菌斑，PBS系列稀釋，SM組接種于MSB平皿和BHIS血平皿，SO組接種于MSAE平皿，SO+SM混合接種組接種于MSB平皿、MSAE平皿和BHIS血平皿，陰性對(duì)照組接種于MSB平皿和MSAE平皿。從MSB平皿篩選、計(jì)數(shù)變形鏈球菌，從MSAE平皿篩選寡發(fā)酵鏈球菌疑似菌落并16S rDNA測(cè)序鑒定寡發(fā)酵鏈球菌。結(jié)果：SO組接種寡發(fā)酵鏈球菌次日，寡發(fā)酵鏈球菌檢出率為33.3% (4/12)；SO+SM混合接種組接種次日寡發(fā)酵鏈球菌檢出率為0，而變形鏈球菌檢出率為100.00%，變形鏈球菌占總菌的比例為14.70%±4.53%；SM組在接種次日的變形鏈球菌檢出率也為100.00%，其占總菌的比例為12.42%±4.27%，與SO+SM混合接種組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SO組接種寡發(fā)酵鏈球菌第10天，寡發(fā)酵鏈球菌檢出率為0；SO+SM混合接種組接種第10天，寡發(fā)酵鏈球菌檢出率亦為0，而變形鏈球菌檢出率為100.00%，變形鏈球菌占總菌的比例為15.78%±5.10%；SM組在接種第10天的變形鏈球菌檢出率也為100%，其占總菌的比例為17.08%±5.75%，與SO+SM混合接種組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)條件下，在大鼠口腔內(nèi)高糖環(huán)境下，寡發(fā)酵鏈球菌在大鼠口腔內(nèi)呈一過性顯現(xiàn)，不能定植。

[關(guān)鍵詞]寡發(fā)酵鏈球菌;鏈球菌，變異；大鼠，Sprague-Dawley

寡發(fā)酵鏈球菌(Streptococcusoligofermentans，以下簡(jiǎn)稱SO)是2003年從健康人牙菌斑中分離到的一株新的口腔鏈球菌[1]，主要分布于人健康牙面牙菌斑，SO的檢出和變形鏈球菌(Streptococcusmutans，以下簡(jiǎn)稱SM)的數(shù)量之間似乎呈現(xiàn)一定的負(fù)性關(guān)系[2]。人們對(duì)其進(jìn)行了系列體外研究，發(fā)現(xiàn)SO有較強(qiáng)的黏附能力、較弱的產(chǎn)酸和耐酸能力[2-3]，但上述結(jié)果多基于體外研究，不能模擬體內(nèi)口腔菌斑生物膜的復(fù)雜性，也沒有考慮宿主因素對(duì)SO的影響。更令人感興趣的是SO在體內(nèi)的生存狀況，而SO是否能夠定植是體內(nèi)研究的前提和基礎(chǔ)，因此本研究的目的是對(duì)SO在大鼠口腔內(nèi)的定植能力進(jìn)行初步探索。

1材料與方法

1.1細(xì)菌及培養(yǎng)條件

SM NCTC 10449T和SO LMG21535T(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存)于-70 ℃，50%(體積分?jǐn)?shù))甘油中凍存。將凍存的兩種細(xì)菌在腦心浸液(brain heart infusion，BHI)瓊脂培養(yǎng)基上活化，95%(體積分?jǐn)?shù))N2，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2，37 ℃培養(yǎng)48 h后挑取單菌落，接種于BHI培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，用BHI培養(yǎng)液將菌懸液調(diào)至光密度值D600 nm=2.0[4]，備用。

1.2實(shí)驗(yàn)大鼠準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)由北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理分會(huì)批準(zhǔn)，在北京大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)完成。

選用同一天出生的21天齡SPF-SD大鼠48只(維通利華公司提供)，21天斷奶，編號(hào)并稱記體重，持續(xù)喂以2000#飼料(高糖飲食)[5]，飲用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖水溶液。

1.3內(nèi)源性細(xì)菌抑制

第25～27天，連續(xù)3天飲用含200 mg/L氨芐青霉素(華北制藥股份有限公司)的飲用水。第28天以無菌干棉簽涂擦大鼠雙側(cè)下頜磨牙(6顆)牙合面、頰、舌面取菌斑，PBS系列稀釋，接種于SM選擇性培養(yǎng)基：輕唾桿菌肽瓊脂平皿(mitis salivarius agar supplemented with bacitracin, MSB)[6]和SO選擇性培養(yǎng)基：添加有終濃度為15 mg/L紅霉素的輕唾瓊脂平皿(mitis salivarius agar with erythromycin, MSAE)[7]，95% N2、5% CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h檢測(cè)內(nèi)源性細(xì)菌抑制情況。

1.4細(xì)菌接種、培養(yǎng)

第28天停用氨芐青霉素飲用水，喂以5%蔗糖水溶液，48只大鼠隨機(jī)分為4組，每組12只。28～30天，連續(xù)3天以無菌棉簽蘸取準(zhǔn)備好的菌懸液(1 mL)多次涂擦大鼠下頜磨牙(6顆)牙合面、頰、舌面接種細(xì)菌，至1 mL菌懸液用盡。組1(SM組)接種變形鏈球菌菌液，組2(SO組)接種寡發(fā)酵鏈球菌菌液，組3(SO+SM混合接種組)接種變形鏈球菌和寡發(fā)酵鏈球菌等量混合菌液，組4為陰性對(duì)照組，不接種任何菌液。

細(xì)菌接種后次日和第10天用無菌棉簽涂擦大鼠雙側(cè)下頜磨牙(6顆)牙合面、頰、舌面2次獲得菌斑，經(jīng)PBS系列稀釋，SM組接種于SM的選擇性培養(yǎng)基MSB平皿和計(jì)數(shù)總菌的加有5%(體積分?jǐn)?shù))羊血的腦心浸液血瓊脂平皿(brain heart infusion agar supplemented with 5% defibrinated sheep blood, BHIS)，SO組接種于SO的選擇性培養(yǎng)基MSAE平皿，SO+SM組同時(shí)接種于MSB平皿、MSAE平皿和BHIS血平皿，陰性對(duì)照組同時(shí)接種于MSB平皿和MSAE平皿，95% N2、5% CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.5SM的篩選、計(jì)數(shù)和鑒定

從菌落數(shù)為30～300個(gè)的MSB平皿上根據(jù)SM的典型菌落形態(tài)(菌落直徑約1.0～1.5 mm，圓形，奶黃色隆起，表面似肉芽腫或霜玻璃樣，質(zhì)地堅(jiān)硬，嵌入瓊脂，在菌落頂部或周圍常見水滴樣或黏液樣的葡聚糖產(chǎn)物)篩選、計(jì)數(shù)SM，SM菌量(CFU/mL)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)。從30～300個(gè)菌落的BHIS血平皿上計(jì)數(shù)總菌的數(shù)量(CFU/mL)，SM的數(shù)量以SM占總菌的比例表示，SM占總菌的比例=SM數(shù)量(CFU/mL)/相應(yīng)樣本的總菌數(shù)量(CFU/mL)×100%。

1.6SO的篩選和鑒定

根據(jù)張杰等[7]建立的方法并加以改進(jìn)，從菌落數(shù)為30～300個(gè)的MSAE平皿上根據(jù)SO的典型菌落形態(tài)(菌落直徑為0.5～1.0 mm，乳白色，突出于培養(yǎng)基表面，質(zhì)地黏、軟)篩選SO疑似菌落，1 mL BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)增菌，革蘭氏染色，在顯微鏡下(Olympus，日本)觀察，根據(jù)SO典型菌體形態(tài)(革蘭氏染色陽(yáng)性，不規(guī)則短鏈狀排列)進(jìn)一步篩選SO疑似菌落。

用離心柱型細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒(百泰克公司)提取疑似寡發(fā)酵鏈球菌菌株的DNA。使用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCATGGCTCAG-3′)和1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成[8]，擴(kuò)增疑似菌株的16S rDNA，片段長(zhǎng)度為1 514 bp。25 μL PCR反應(yīng)體系中含：1 μL DNA，引物27F和1541R各1 μL，dNTP 1 μL，10×buffer 2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.1 μL和ddH2O 18.5 μL。95 ℃預(yù)變性6 min后，進(jìn)行下述30個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，最后72 ℃保溫10 min。所用儀器為Thermolyne公司AmplitronⅠ型PCR儀。將疑似菌落16S rDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序，將測(cè)定的序列提交GenBank，用Blast程序?qū)ふ彝葱宰罡叩?6S rDNA序列，以確定疑似菌落是否是SO。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，用非參數(shù)檢驗(yàn)比較：SM單獨(dú)接種和混合接種時(shí)，接種后次日SM的數(shù)量；SM單獨(dú)接種和混合接種時(shí)，接種后第10天SM的數(shù)量。用符號(hào)秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon法)比較：SM單獨(dú)接種時(shí)，接種次日和第10天SM的數(shù)量；SM和SO混合接種時(shí)，接種次日和第10天SM的數(shù)量。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2結(jié)果

2.1內(nèi)源性細(xì)菌抑制情況

全部大鼠飲用含有氨芐青霉素的飲用水后菌斑中未檢出SM和SO。

2.2陰性對(duì)照組細(xì)菌檢出情況

全部大鼠在兩個(gè)時(shí)點(diǎn)的菌斑樣本經(jīng)鑒定均沒有檢出SM和SO。

2.3SM單獨(dú)接種時(shí)檢出情況

SM組在接種后次日，SM檢出率為100.00%，占總菌的比例是12.42%±4.27%；接種后第10天，SM檢出率仍為100.00%，占總菌的比例是17.08%±5.75%。SM單獨(dú)接種時(shí)在接種后次日和接種后第10天占總菌的比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.071)。

2.4SO單獨(dú)接種時(shí)檢出情況

SO組接種后次日，經(jīng)鏡檢和16S rDNA測(cè)序鑒定，4只大鼠口腔內(nèi)可檢出SO，檢出率為33.3%。接種后第10天，SO檢出率為0。

2.5SO和SM等量混合接種時(shí)細(xì)菌檢出情況

SO+SM混合接種組接種次日和第10天，SO檢出率均為0，SM檢出率均為100.00%。接種次日，SM占總菌的比例為14.70%±4.53%，與單獨(dú)接種時(shí)(12.42%±4.27%)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=57.000,P=0.386)；接種第10天，SM占總菌的比例為15.78%±5.10%，與單獨(dú)接種時(shí)(17.08%±5.75%)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=64.000,P=0.644)；SM占總菌的比例在接種次日(14.70%±4.53%)和接種第10天(15.78%±5.10%)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.583)。

3討論

3.1細(xì)菌接種近期的SO生存狀態(tài)

本研究中，SO組接種次日，12只大鼠中有4只檢出了SO，檢出率為33.3%。Zhang等[2]的研究結(jié)果顯示，18人中有7人的牙面菌斑可檢出SO，檢出率是38%，兩研究的檢出率相似。從體外對(duì)SO生物學(xué)特性的研究結(jié)果可以看出，該細(xì)菌在體外表現(xiàn)出較強(qiáng)的黏附能力，對(duì)光滑硬玻璃板的附著略強(qiáng)于戈登鏈球菌(Streptococcusgordonii)，但明顯弱于SM[2]；合成細(xì)胞外多糖尤其是不溶于水的多糖的能力較差，明顯弱于SM。由此可見，SO具備附著于牙齒表面的條件，但附著的能力并不很強(qiáng)。與體外實(shí)驗(yàn)不同，大鼠口腔是一個(gè)多種細(xì)菌共存的微生態(tài)環(huán)境，SO在這種復(fù)雜的環(huán)境中是否能夠定植和生存受到許多因素的影響，細(xì)菌間的相互作用被視為決定性因素[9]。細(xì)菌間的相互作用包括協(xié)同作用和拮抗作用，拮抗作用可以通過細(xì)菌間競(jìng)爭(zhēng)空間位點(diǎn)、競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及產(chǎn)生拮抗物質(zhì)(如細(xì)菌素、有機(jī)酸過氧化氫等物質(zhì))來抑制其他細(xì)菌的附著、生長(zhǎng)[10]。本研究采用的大鼠是SPF級(jí)動(dòng)物，口腔內(nèi)有常駐菌存在，它是否對(duì)SO的附著和定植有影響尚待研究。

SO+SM混合接種組接種次日SO的檢出率為0，而SM檢出率為100.00%，SM占總菌的比例為14.70%±4.53%。本研究所設(shè)SM組在接種次日的SM檢出率也為100.00%，其占總菌的比例為12.42%±4.27%，與SO+SM混合接種組相比無顯著差異。本研究結(jié)果顯示，SO在與等量SM同時(shí)接種于高糖飼喂產(chǎn)生的低pH口腔環(huán)境條件中時(shí)，SO并不能附著生長(zhǎng)，而SM卻如單獨(dú)接種時(shí)一樣在此環(huán)境條件下生長(zhǎng)。Tong等[11]在體外胰胨酵母精葡萄糖瓊脂培養(yǎng)皿上同時(shí)將SO和SM進(jìn)行鄰近接種培養(yǎng)，結(jié)果顯示SO抑制了SM的生長(zhǎng)，并且認(rèn)為這種抑制作用是通過產(chǎn)生過氧化氫實(shí)現(xiàn)的。分析本研究結(jié)果與上述體外研究結(jié)果不同的原因可能是：(1)體外研究在培養(yǎng)皿上進(jìn)行，SO和SM分別有各自的生長(zhǎng)空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，SO和SM都能生長(zhǎng)并分別產(chǎn)生自己的代謝產(chǎn)物達(dá)到相互對(duì)抗的效果；但在體內(nèi)不同，口腔內(nèi)的生物膜具有高密度和微生物多樣性的特點(diǎn)，空間、營(yíng)養(yǎng)等資源有限，需要通過競(jìng)爭(zhēng)獲得，而SO的黏附能力，耐酸能力[2-3]，合成細(xì)胞外多糖尤其是不溶于水的多糖能力明顯弱于SM，兩者同時(shí)接種時(shí)SO處于弱勢(shì)，在和SM競(jìng)爭(zhēng)附著位點(diǎn)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)難以勝出，故難以在牙齒表面附著和生長(zhǎng)。(2)體外試驗(yàn)中，SO對(duì)SM的抑制是通過過氧化氫實(shí)現(xiàn)的，過氧化氫的產(chǎn)生是氧氣依賴型的，一旦菌斑到達(dá)一定的厚度，細(xì)菌到達(dá)一定的密度，由于擴(kuò)散的有限性，氧氣張力會(huì)降低，導(dǎo)致過氧化氫到達(dá)一個(gè)不能抑制SM的水平[12]。(3)SM可以通過產(chǎn)生變鏈素，像抑制其他口腔細(xì)菌一樣[13]，干擾 SO在牙面的附著和生長(zhǎng)，而且由于SM有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力[2]，可以在大鼠口腔內(nèi)的高糖環(huán)境中大量產(chǎn)酸，進(jìn)一步降低環(huán)境的pH值，從而徹底干擾了耐酸能力較弱的SO的附著和生長(zhǎng)。

3.2細(xì)菌接種遠(yuǎn)期的SO生存狀態(tài)

SO組接種SO第10天，12只大鼠無一檢出SO，檢出率為0；SO+SM混合接種組接種第10天，SO檢出率亦為0；SO+SM混合接種組表現(xiàn)為與SM組同樣的SM定植生長(zhǎng)現(xiàn)象，提示在本實(shí)驗(yàn)的高糖環(huán)境下，SO不能定植。分析SO不能定植的原因?yàn)槠漯じ搅Α⒛退崃黠@弱于SM，在低pH環(huán)境中生長(zhǎng)受到明顯的抑制[2-3]，而本研究對(duì)大鼠持續(xù)喂以高糖飲食和蔗糖水導(dǎo)致了大鼠口腔的低pH環(huán)境，隨時(shí)間的延長(zhǎng)低pH環(huán)境持續(xù)存在，從而導(dǎo)致SO的生長(zhǎng)、繁殖和定植受到抑制，而這種環(huán)境卻有利于SM定植生長(zhǎng)。另外，由于目前對(duì)SO的認(rèn)識(shí)尚有限，且口腔環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、溫度、pH、唾液的流速、氧氣、細(xì)菌間的相互作用等都會(huì)影響細(xì)菌的定植，因此，在本實(shí)驗(yàn)條件下，可能有尚未了解的SO的生物學(xué)特性影響其定植。以往的研究也表明，并非所有分離自人類口腔的鏈球菌都能在口腔中定植，如口腔中的血鏈球菌雖然在菌斑形成過程中起重要作用，但它并不能定植[14]。不同的口腔鏈球菌在大鼠口腔內(nèi)是否能夠定植與細(xì)菌種的特異性有關(guān)，也與不同的飼養(yǎng)環(huán)境下動(dòng)物口腔內(nèi)獲得的常駐口腔細(xì)菌有關(guān)[9]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)條件下，在大鼠口腔內(nèi)高糖環(huán)境中，SO在大鼠口腔內(nèi)一過性顯現(xiàn)，不能定植，但本研究?jī)H對(duì)SO在大鼠口腔內(nèi)的定植狀態(tài)進(jìn)行了初步探索，需要有更多的研究來加深和拓展對(duì)SO定植能力的認(rèn)識(shí)。

(志謝：感謝中國(guó)科學(xué)院微生物所的佟卉春副研究員和北京大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的王大明老師在實(shí)驗(yàn)過程中給予的幫助。)

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(2014-10-10收稿)

(本文編輯：任英慧)

Observation of oralStreptococcusoligofermentanscolonization in rats

ZHANG Jie1, SONG Lei2, DUAN Deng-hui3, YUE Lin1△

(1. Department of Cariology and Endodontology, Peking University School and Hospital of Stomatology, Beijing 100081, China; 2. Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; 3. Department of General Dentistry, Peking University School and Hospital of Stomatology, Beijing 100081, China)

ABSTRACTObjective：To study the colonization ability of Streptococcus oligofermentans (S. oligofermentan) in the condition of high sucrose in oral cavity of rats. Methods: In this study, 48 SPF-SD rats aged 21 days were selected. From 24(th) to 27(th) days, the rats were fed with water of antibiotic and fed with high glucose diet continuously. On the 28(th) day, the rats were divided into four groups randomly, 12 rats per group. From the 28(th) day to 30(th) day, the first group (SM group) was inoculated with S. mutans, the second group (SO group) with S. oligofermentan, the third group (SO+SM group) with mixture of S. mutans and S. oligofermentan, the control group not with any bacteria. On the next day and the 10(th) day after inoculation of bacteria, the samples of dental plaque of the rats were acquired by scrubbing occlusal, buccal and lingual surfaces of bilateral mandibular molars with sterile swabs. The samples of SM group were inoculated on MSB and BHIS, of SO group on MSAE, of SO+SM group on MSB, MSAE and BHIS,of the control group on MSB and MSAE. S. mutans were screened and calculated on MSB, the suspected colonies of S. oligofermentan were screened and identified by the analysis of 16S rDNA. Results:On the next day, the detection rate of S. oligofermentan was 33.3% (4/12) in the group of SO; in the group of SO+SM, the detection rate of S. oligofermentan was 0, the detection rate of S. mutans 100.00%, and the proportion of S. mutans 14.70%±4.53%; in the group of SM, the detection rate of S. mutans was 100.00%, the proportion of S. mutans 12.42%±4.27%. On the 10(th) day, in the group of SO, the detection rate of S. oligofermentan was 0; in the group of SO+SM, the detection rate of S. oligofermentan was 0, the detection rate of S. mutans 100.00%, and the proportion of S. mutans 15.78%±5.10%; in the group of SM, the detection rate of S. mutans was 100.00%,and the proportion of S. mutans 17.08%±5.75%. Conclusion: In the condition of the experiment where high glucose was maintained in the oral cavity in rats, S. oligofermentan appeared transiently and couldn’t colonize in the rats.

KEY WORDSStreptococcus oligofermentans; Streptococcus mutans; Rats, Sprague-Dawley

doi:10.3969/j.issn.1671-167X.2016.02.025

[中圖分類號(hào)]R378.12

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-167X(2016)02-0316-04

基金項(xiàng)目:北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院青年科研基金(PKUSS20110111)資助 Supported by the Foundation of Peking University School of Stomatology (PKUSS20110111)

△ Corresponding author’s e-mail, kqlinyue@bjmu.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-10-1215：06：00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20151012.1506.014.html