楊 立，肖明明，李 艷，邢 煜，王 巖，姚 遠

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雷公藤甲素對實驗性大鼠結(jié)腸炎組織中細胞因子IFN-γ、IL-12表達的影響

楊 立*，肖明明，李 艷，邢 煜，王 巖，姚 遠

目的 探討雷公藤甲素對TNBS誘導大鼠結(jié)腸炎的療效及對炎性細胞因子IL-12和IFN-γ表達的影響。方法 將18只成年 SD大鼠隨機分為對照組、模型組及雷公藤甲素組，觀察大鼠的一般情況，比較結(jié)腸組織炎癥程度。HE染色觀察大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學變化。用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western blot(WB)法檢測大鼠結(jié)腸組織中IL-12、IFN-γ的表達水平。結(jié)果 對照組大鼠結(jié)腸組織中 IL-12和IFN-γ的表達水平最低，與對照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中IL-12、IFN-γ表達顯著增高(P<0.01)，與模型組相比，雷公藤甲素組IL-12、IFN-γ表達明顯降低(P<0.05)。雷公藤甲素治療對大鼠結(jié)腸組織及大體變化都有一定程度的改善。結(jié)腸組織IFN-γ和IL-12的陽性細胞表達與結(jié)腸炎病情輕重呈正相關。結(jié)論 雷公藤甲素能有效治療 TNBS誘導的大鼠結(jié)腸炎，其作用機制可能與雷公藤甲素下調(diào)大鼠結(jié)腸黏膜炎性細胞因子IL-12和 IFN-γ的表達，抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展有關。

雷公藤甲素；實驗性結(jié)腸炎;IFN-γ;IL-12

0 引言

免疫調(diào)節(jié)異常在炎癥性腸病(IBD)發(fā)病機制中的作用日益引起人們重視[1]。以往的研究指出，炎癥性腸病結(jié)腸黏膜聚集的炎性細胞通過多種免疫途徑損傷結(jié)腸黏膜的上皮組織，最終導致疾病發(fā)生。雷公藤甲素(TP)又稱雷公藤內(nèi)酯醇，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等活性，臨床上廣泛用于治療多種炎癥性疾病,但用于IBD治療的報道少有。本文以三硝基苯磺酸(TNBS)誘導構建實驗性大鼠結(jié)腸炎模型，檢測模型大鼠結(jié)腸組織干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-12(IL-12)表達水平的變化，探討雷公藤甲素對實驗性大鼠結(jié)腸上皮細胞中IL-12、IFN-γ表達的調(diào)節(jié)及其在炎癥性腸病治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和裝置 濃度5%(w/v)的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)購自Sigma公司(批號：107k5008)。雷公藤甲素(TP)購自中國藥品生物制品檢定所。雷公藤甲素100 μg/(kg·d)與生理鹽水制成混懸液，腹腔注射。IFN-γ和IL-12抗體，美國Santa Cruz 生物技術有限公司產(chǎn)品。生物素化驢抗山羊IgG、辣根酶標記鏈酶親合素、RIPA裂解液PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒均為上海碧云天生物技術有限公司產(chǎn)品。其他試劑和實驗設備同文獻[2]。

1.2 模型建立、結(jié)腸炎表現(xiàn)及病理學觀察 參考文獻[3]建立TNBS大鼠結(jié)腸炎模型。選取18只8周左右SPF級SD雄性大鼠(遼寧長生生物技術有限公司)，體重180～200 g,隨機分為3組，每組6只。分別為對照組(C)、TNBS模型組(D1)、雷公藤甲素治療組(D5)。所有大鼠實驗前適應環(huán)境 1周。具體造模過程及標本處理、制備見文獻[2]。計算疾病活動指數(shù)(DAI)，進行大鼠結(jié)腸組織炎性病變程度評分[4]和病理學(組織學損傷)評分[5]。

1.3 IFN-γ、IL-12檢測 按公司試劑盒說明書提取大鼠結(jié)腸黏膜組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后得到對應的cDNA在PCR儀上進行擴增。序列引物信息見表1。PCR產(chǎn)物片段經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳過后利用凝膠成像系統(tǒng)對得到的凝膠進行拍照，測定目的條帶灰度值。提取結(jié)腸黏膜總蛋白，SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳，進行Western 雜交。一抗:IFN-γ、IL-12，1∶1 00；二抗，驢抗山羊IgG-HRP 1∶5 000稀釋。內(nèi)參抗體 Mouse antiβ-actin-HRP 1∶10 000稀釋。WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)成像，測定目的條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學分析 使用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 引物序列及擴增片段長度

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)及組織學觀察 對照組結(jié)腸大體正常，可見大量胞質(zhì)富含黏液的杯狀細胞，黏膜固有層、黏膜下層未見炎性細胞浸潤。模型組腸組織腸壁壞死、變薄，腸黏膜可見潰瘍，腸黏膜和黏膜下組織可見大量中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞及嗜酸性粒細胞浸潤，腸黏膜隱窩變形，膿腫形成，黏膜下組織充血、水腫，伴急性小血管炎癥。雷公藤甲素組見炎性細胞浸潤減少、隱窩變形恢復和杯狀細胞胞質(zhì)黏液增多，潰瘍縮小修復。

與對照組比較，模型組和雷公藤甲素組DAI評分、病理學評分明顯升高(P<0.05);與模型組比較，雷公藤甲素治療組DAI評分、病理學評分均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織大體評分、DAI評分、病理學評分比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2 炎性因子IFN-γ和IL-12的RT-PCR法表達 與對照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織 IL-12、IFN-γ相對表達水平明顯上調(diào)，相對表達量由高到低依次為模型組、雷公藤甲素組、對照組(圖1、圖 2)。模型組和雷公藤甲素組 IL-12的表達與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)，雷公藤甲素組與模型組相比，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05);模型組 IFN-γ的表達與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，雷公藤甲素組與對照組和模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 IL-12 和IFN-γ的Western blot法表達 以β-actin為內(nèi)參，WB法檢測各組大鼠結(jié)腸組織的IL-12的表達。對照組大鼠結(jié)腸組織 IL-12低水平表達(IL-12/β-actin:0.16±0.07);模型組較對照組明顯偏高(IL-12/β-actin:0.88±0.27，P<0.01);雷公藤甲素組中 IL-12表達(IL-12/β-actin:0.44±0.31)高于對照組、低于模型組，與對照組和模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。和IL-12表達類似，大鼠結(jié)腸組織 IFN-γ在對照組中也處于較低水平表達(IFN-γ/β-actin∶0.27±0.09);模型組IFN-γ表達較對照組明顯增高(IFN-γ/β-actin∶0.59±0.20，P<0.05);雷公藤甲素組IFN-γ表達較對照組明顯增加(IFN-γ/β-actin∶0.43±0.12，P<0.05);雷公藤甲素組IFN-γ表達低于模型組，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3、圖4。

圖1 大鼠結(jié)腸組織中IL-12和 IFN-γ的表達(RT-PCR法)

圖2 大鼠結(jié)腸組織中IFN-γ和IL-12的光密度值比較(RT-PCR法)

圖3 大鼠結(jié)腸組織中IL-12和 IFN-γ的表達(WB法)

2.4 結(jié)腸炎大鼠腸組織IL-12、IFN-γ表達與DAI、病理損傷指數(shù)，以及 IL-12與IFN-γ表達的相關分析 結(jié)腸炎大鼠腸組織IL-12、IFN-γ的 IOD值與腸組織病理損傷評分、DAI評分均呈正相關，R值分別為 0.673 1、0.633 6、0.434 2、0.436 3 (α=0.05)。結(jié)腸炎大鼠腸組織IL-12與IFN-γIOD值呈線性正相關，回歸方程:RT-PCR法：IOD(IFN-γ)=-0.053 7+1.430 7* IOD(IL-12)，R=0.968 1;WB法：IOD(IFN-γ)=0.228 3+0.413 9* IOD(IL-12)，R=0.951 2。見圖5。

圖4 大鼠結(jié)腸組織中IL-12和IFN-γ的光密度值比較(WB法)

圖5 促炎因子IL-12和 IFN-γ在2種檢測法中的線性關系

3 討論

在炎癥性腸病多種致病因素中，患者自身免疫紊亂、抗炎細胞因子與促炎細胞因子失衡是目前公認的致病機制之一[6-7]。病理研究證實，作為重要的促炎因子,IFN-γ和 IL-12表達異常參與了潰瘍性結(jié)腸炎的病理損傷過程[8-9]。IL-12作為異源二聚體形式的前炎癥細胞因子，能誘導早期輔助性T細胞分化為Th1細胞，并促進Th1細胞的發(fā)育和增殖。在IBD動物模型中，炎癥小鼠結(jié)腸部位的巨噬細胞異?；罨?，導致IL-10、IL-12等細胞因子表達異常[10]。 IFN-γ由活化T細胞和NK細胞產(chǎn)生,主要功能是免疫調(diào)節(jié)作用，是強有力的吞噬細胞和中性粒細胞激活物，促進T、B細胞分化。已有實驗表明，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清中IL-4、IL-10含量明顯降低，而IFN-γ、IL-12 含量明顯升高[11-12]。IL-12 或IFN-γ對單核/巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞的趨化作用會產(chǎn)生過量的基質(zhì)降解酶，破壞黏膜的完整性[13]。亦有文獻報道，UC患者Th1細胞存在異常激活，UC小鼠IFN-γ表達明顯升高[14-15]。

雷公藤甲素是從中藥雷公藤的提取物中分離出來的一種單體成分。藥理研究指出，作為一種新型的免疫抑制劑，雷公藤甲素對腸道炎癥具有一定的抗炎和免疫抑制作用。雷公藤甲素能抑制樹突狀細胞和T細胞的活化，促進體外培養(yǎng)的T細胞caspase的表達，誘導小鼠結(jié)腸固有層T細胞凋亡[16-18]。李毅[19]研究表明，經(jīng)雷公藤甲素治療的小鼠的結(jié)腸炎性浸潤和淋巴細胞的數(shù)量顯著減少，小鼠結(jié)腸組織、固有層的T細胞均出現(xiàn)顯著的凋亡現(xiàn)象。表明雷公藤甲素在減輕炎癥程度方面，既能夠減少細胞自身的細胞因子的釋放，也能夠減少炎性細胞的數(shù)量。機制為雷公藤甲素通過抑制腸黏膜過激IL-6/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)CD狀態(tài)下固有層T細胞的凋亡抵抗，從而達到抑制腸道炎癥的目的。

張文志等[20]報道，UC大鼠腸道局部黏膜發(fā)生免疫功能紊亂，促炎因子IFN-γ和IL-12表達水平升高,誘導和促進腸道黏膜炎癥的發(fā)生和發(fā)展。而經(jīng)蘆薈多糖治療后，結(jié)腸炎大鼠的結(jié)腸黏膜促炎細胞因子IL-12和IFN-γ水平較模型組顯著降低。與張文志等研究類似，我們在實驗中觀察到，在實驗性大鼠結(jié)腸炎組織中，模型組大鼠結(jié)腸組織中 IL-12、IFN-γ的表達水平顯著增加(與對照組比較)；雷公藤甲素組IL-12、IFN-γ蛋白表達水平呈不同程度下降(與模型組比較)。雷公藤甲素給藥后，大鼠結(jié)腸炎癥明顯好轉(zhuǎn)，說明雷公藤甲素可以有效下調(diào)促炎細胞因子 IFN-γ和IL-12的分泌，降低IL-12、IFN-γ的表達活性，從而有利于消除炎癥、修復損傷。

本研究表明，在大鼠結(jié)腸炎腸組織中，IL-12和IFN-γ的表達上調(diào)水平與結(jié)腸炎癥程度呈正相關，說明雷公藤甲素的療效機制可能與降低IL-12和 IFN-γ的表達有密切關系。IFN-γ陽性表達與IL-12陽性表達呈線性相關關系，無論是RT-PCR 檢測法還是WB檢測法都是如此。這可能是因為作為促炎因子，除能促進分化的 CD4+T輔助細胞(Th1細胞)的增殖，增強 NK和 CTL細胞的細胞毒活性外，IL-12還能促進 NK細胞和 T細胞的發(fā)育與增殖，并刺激這些細胞產(chǎn)生 IFN-γ。反之，IFN-γ也會增加IL-12的分泌[21]，IFN-γ在抗原致敏過程中可以和細胞因子IL-12共同調(diào)節(jié)Thl 細胞分化，IFNγ-可以通過阻抑Th2細胞分化，使Thl 細胞分化占優(yōu)勢[22]，兩者共同參與了實驗性結(jié)腸炎的炎性損害過程。

總之，本研究結(jié)果表明，IL-12和IFN-γ作為促炎因子，在實驗性大鼠結(jié)腸炎中表達明顯上調(diào)，雷公藤甲素治療后，一定程度上降低了這兩種促炎因子的表達，減輕和改善了大鼠結(jié)腸炎癥狀。說明促炎因子IL-12和IFN-γ與大鼠結(jié)腸炎發(fā)病關系密切，但其在大鼠實驗性結(jié)腸炎中表達調(diào)控的具體過程有待進一步開展研究。

[1]Bengmark S.Gut microbiota,immune development and function [J].Pharmacol Res，2013，69(1):87-113.

[2]楊立，李艷，尹秋華,等.實驗性大鼠結(jié)腸黏膜中炎性因子對Th1/Th2平衡的影響及VSL#3的調(diào)節(jié)作用[J].胃腸病學和肝病學雜志，2014，23(5)：529-534.

[3]Morris GP，Beck PL，Herridge MS，et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon[J].Gastroenterology,1989，96(3):795-803.

[4]Hamamoto N，Maemura K，Hiram I，et al. Inhibition of dextran sulphate sodium(DSS) induced colitis in mice by intracolonically administered antibodies against adhesion molecules (endothelial leucocyte adhesion molecule-I (ELAM-1) or intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) )[J].Clin Exp lmmun，1999，117(3):462-468.

[5]Dieleman LA，Palmen MJ，Akol H，et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines [J].Clin Exp Immunol，1998，114(3):385-391.

[6]方健松，馬媛萍，劉暢，等.自噬介導腸黏膜屏障維持腸道穩(wěn)態(tài)在炎癥性腸病中的作用[J].實用醫(yī)學雜志，2016,32(8):1367-1369.

[7]安琦，牛小娟，閻凱，等.T細胞免疫球蛋白結(jié)構域相關分子1在炎癥性腸病小鼠不同部位淋巴細胞中表達的變化[J].中國醫(yī)院，2015，10(8):1227-1231.

[8]Wendelsdorf K,Bassaganya-Riera J,Hontecillas R,et al.Model of colonic inflammation:immune modulatory mechanisms in inflammatory bowel disease[J].J Theor Boil,2010,264(4)：1225-1239.

[9]Brown KA，Back SJ，Ruchelli ED，et al.Lamina propria and circulating interleukin-6 in newly diagnosed pediatric inflammatory bowel disease patients[J].Am J Gastroenterol，2002，97(10):2603-2608.

[10]Kamada N.Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 response to bacteria[J].J Immunol,2005,175:6900-6908.

[11]王雪茜,王新月.2 種給藥途徑對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎血清IFN-γ和 IL-4 的影響[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2010,33(7)：468-471.

[12]徐霞,戴幸平,蔣榮鑫,等.三皮湯對小鼠實驗性潰瘍性結(jié)腸炎相關因子的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2014,24(6)：9-13.

[13]MacDonald TT，Monteleone G，Pender SL. Recent developments in the immunology of inflammatory bowel disease [J]. Scand J Immunol，2000，51(1):2-9.

[14]Kumawat AK，Strid H，Tysk C，et al. Microscopic colitis patients demonstrate a mixed Th17/Tc17 and Th1/Tc1 mucosal cytokine profile[J].Mol Immunol，2013，55(3/4):355-364.

[15]Chu CC，Hou YC，Pai MH，et al.Pretreatment with alanyl-glutamine suppresses T-helper-cell- associated cytokine expression and reduces inflammatory responses in mice with acute DSS-induced colitis[J].J Nutr Biochem，2012，23(9):1092-1099.

[16]Wei X,Gong J,Zhu J,et al.Therapeutic effects of triptolide on interleukin-10 gene deficient mice with colitis[J].Int J Immunopharmacol,2008,8:1808-1812.

[17]Wei X,Gong J,Zhu J,et al.The suppressive effect of triptolide on chronic colitis and TNF-alpha/TNFR2 signal pathway in interleukin-10 deficient mice[J].Clini Immunol,2008,129:211-218.

[18]Zhu KJ,Shen QY.Triptolide affects the differentiation,maturation and function of human dendritic cell[J].Int Immunopharmacol,2005,5:1415-1426.

[19]李毅.雷公藤甲素對炎性腸病(克羅恩病)腸黏膜免疫系統(tǒng)IL-6/STAT3信號通路的干預機制[D].南京：南京大學，2011.

[20]張文志,歐水平,吳會超，等.蘆薈多糖對實驗性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜的保護作用及其機制研究[J].實用醫(yī)學雜志,2016,32(3):352-355.

[21]Xue X，F(xiàn)eng T，Yao S，et al. Microbiota down-regulates dendriti ccell expression of miR-10a，which targets IL-12/IL-23p40[J].J Immunol，2011，187(11):5879-5886.

[22]郭新紅，趙芳，石偉，等. 特發(fā)性血小板減少性紫癜患者Th1/Th2的細胞因子水平及臨床意義[J].細胞與分子免疫學雜志，2012，24(11):1185-1187.

Effects of tripotlide on the expression of IFN-γ and IL-12 of intestinal mucosa in rats with colitis

YANG Li*,XIAO Ming-ming,LI Yan,XING Yu,WANG Yan,YAO Yuan

(Department of Gastroenterology，People′s Hospital of Liaoning Province，Shenyang 110016，China)

Objective To evaluate the curative effect and regulation of tripotlide on the expression of intestinal mucosa IL-12 and IFN-γ in rats with colitis induced by trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).Methods Eighteen adult Sprague-Dawley rats were averagely randomized into three groups:control group,model group,tripotlide treatment group.After treatments,the general status of all rats was observed;the histopathologic changes in the colon were examined;reverse transcription-polymerase chain reaction and Western blot techniques were used to detect the expression of cytokines IL-12 and IFN-γ.Results Compared with control group,the immunoreactive positive cells of IL-12 and IFN-γ increased significantly in model group.Compared with model group,the expression of Il-12 and IFN-γ in tripotlide treatment group decreased significantly (P< 0.05).It indicated that tripotlide could decrease the expression of IL-12 and IFN-γ in the colonic mucous membrane.Conclusion Tripotlide can effectively treat TNBS-induced colitis in rats by down-regulating the expression of IL-12 and IFN-γ and relieving the inflammation.

Triptolide;Experiment colitis;IFN-γ;IL-12

2016-08-05

遼寧省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科，沈陽 110016

遼寧省自然科學基金課題(201102106)

10.14053/j.cnki.ppcr.201611003

*通信作者