朱玉廣，朱 艷，孫寶琪，陳 晨，李 珺，李 霞

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ILK介導(dǎo)Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的研究

朱玉廣，朱 艷，孫寶琪，陳 晨，李 珺，李 霞

目的 研究ILK抑制劑QLT0267對(duì)轉(zhuǎn)分化人晶狀體上皮細(xì)胞(HLECs)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化糖原合酶激酶-3β(p-GSK3β)的影響，探討ILK介導(dǎo)Akt信號(hào)通路在HLECs轉(zhuǎn)分化的作用。方法 選擇傳3代HLECs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分三組：TGF-β2組加入含有濃度為100 ng/L的TGF-β2培養(yǎng)基，ILK抑制劑組加入10 nmol/L QLT0267預(yù)處理1 h后，再加入濃度為100 ng/L TGF-β2培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基。Western blot法檢測(cè)HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的變化。采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt、p-GSK3β的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，TGF-β組E-cadherin表達(dá)減弱，α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與TGF-β組比較，ILK抑制劑組α-SMA、p-Akt和p-GSK3β表達(dá)明顯減弱，E-cadherin的表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.325、17.686、8.547、6.812，P<0.001)，QLT0267部分逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的HLECs α-SMA、p-Akt、p-GSK3β和E-cadherin的表達(dá)。結(jié)論 ILK介導(dǎo)Akt信號(hào)通路參與TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs轉(zhuǎn)分化過(guò)程，QLT0267通過(guò)特異性結(jié)合ILK，影響下游信號(hào)的傳導(dǎo)，降低了HLECs的轉(zhuǎn)分化。ILK介導(dǎo)Akt信號(hào)通路可能在后囊膜混濁過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

ILK；Akt信號(hào)通路；晶狀體上皮細(xì)胞；轉(zhuǎn)分化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2

白內(nèi)障是常見(jiàn)的致盲性眼病，后囊膜混濁(posterior capsular opacification，PCO)是現(xiàn)代白內(nèi)障術(shù)后影響視力提高的主要因素[1]。人晶狀體上皮細(xì)胞(human len epithelialcells，HLECs) 的轉(zhuǎn)分化是PCO 的主要病理改變，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2 ( transforming growth factor-β2，TGF-β2) 以誘導(dǎo)HLECs 的轉(zhuǎn)分化[1-2]。前期研究[3-4]顯示整合素β1參與TGF-β2誘導(dǎo)HLECs轉(zhuǎn)分化，并且抑制整合素β1的表達(dá)可以抑制HLECs轉(zhuǎn)分化。整合素激活后主要通過(guò)整合素連接激酶(integrin-linked kinase,ILK)發(fā)揮核心作用，ILK參與體內(nèi)多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路，ILK及其信號(hào)通道在HLECs轉(zhuǎn)分化中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。該研究利用HLECs轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型，探討Akt信號(hào)通道在HLECs轉(zhuǎn)分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人晶狀體上皮細(xì)胞HLEC-h3細(xì)胞株(上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司)。

1.2 主要試劑 兔抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)；兔抗人磷酸化Akt(p-Akt)多克隆抗體、兔抗人磷酸化糖原合酶激酶-3β(p-GSK-3β)單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；兔抗人E-鈣黏素(E-cadherin) 單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz 公司)；Recombinant Human TGF-β2(美國(guó)R&D Systems公司)；FITC-標(biāo)記羊抗兔二抗(美國(guó)BETHYL公司)；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)；ILK抑制劑QLT0267(加拿大 QLT公司)。

1.3 HLECs的復(fù)蘇、培養(yǎng)與傳代 取液氮凍存的HLEC-h3細(xì)胞株，放置于37 ℃水浴箱快速解凍，將細(xì)胞懸液移到離心管，加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，吹打混勻，離心后棄去上清液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打混勻后移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4 d換1次DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。待HLECs 90%融合后，胰蛋白酶(1 ∶3)消化傳代。選擇傳3代的HLECs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 制作HLECs細(xì)胞爬片，待HLECs達(dá)80%融合后，24 h血清饑餓培養(yǎng)后分組。分為對(duì)照組、TGF-β2組和ILK抑制劑組。對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基，TGF-β2組加入含濃度為100 ng/L的TGF-β2培養(yǎng)基，ILK抑制劑組預(yù)先加入10 nmol/L QLT0267孵育1 h，再加入濃度為100 ng/L TGF-β2培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western blot法檢測(cè)HLECs α-SMA、E-cadherin、p-Akt和p-GSK3β的表達(dá) 細(xì)胞裂解法冰上裂解細(xì)胞提取蛋白，用BCA protein assay reagent測(cè)定蛋白濃度并配平，取變性蛋白20 g/孔加入10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，恒壓下蛋白轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂奶粉封閉。分別加入相應(yīng)一抗α-SMA(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000) 、p-Akt(1 ∶1 000)、p-GSK-3β(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶800)，4 ℃孵育搖床過(guò)夜。二抗(1 ∶3 000) 室溫孵育1～2 h, PBS-T洗膜，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色、曝光、顯影并定影。UVP凝膠成像掃描分析系統(tǒng)對(duì)膠片條帶進(jìn)行吸光度(absorbance,A) 測(cè)定。

1.6 免疫熒光檢測(cè)HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達(dá) 取出HLECs細(xì)胞爬片，PBS沖洗2次，冷丙酮/甲醇(1 ∶1)固定20 min，10%正常山羊血清封閉1 h，分別加入相應(yīng)兔抗人單克隆抗體，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜，滴加FITC-標(biāo)記羊抗兔二抗，室溫下避光孵育1 h。滴入20%甘油封片劑封片，熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)觀察并拍照。PBS代替一抗或二抗作為陰性對(duì)照。以綠色熒光為陽(yáng)性表達(dá)，比較HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)結(jié)果 Western blot 分析結(jié)果顯示TGF-β2明顯抑制E-cadherin的表達(dá)，TGF-β2明顯促進(jìn)α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達(dá)。QLT0267能部分逆轉(zhuǎn)TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達(dá)。HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達(dá)三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.325、17.686、8.547、6.812，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 HLECs中E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的相對(duì)表達(dá)

2.2 免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果 免疫熒光結(jié)果顯示：對(duì)照組HLECs E-cadherin在細(xì)胞膜上表達(dá)較強(qiáng)，ILK抑制劑組HLECs E-cadherin的表達(dá)減弱，TGF-β2組HLECs E-cadherin在細(xì)胞膜的表達(dá)明顯減弱，轉(zhuǎn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核表達(dá)，分布較彌散(圖2)。對(duì)照組HLECs α-SMA微量表達(dá)，ILK抑制劑組HLECs α-SMA的表達(dá)增強(qiáng)，TGF-β2組HLECs α-SMA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要表達(dá)于胞質(zhì)內(nèi)，并在細(xì)胞核周積聚(圖3)。對(duì)照組HLECs p-Akt表達(dá)較弱，ILK抑制劑組HLECs p-Akt的表達(dá)增強(qiáng)，TGF-β2組HLECs p-Akt的表達(dá)明顯增強(qiáng)，并向細(xì)胞膜聚集(圖4)。與p-Akt的表達(dá)類似，對(duì)照組HLECs p-GSK3β表達(dá)較弱，ILK抑制劑組HLECs p-GSK3β的表達(dá)增強(qiáng)，TGF-β2組HLECs p-GSK3β的表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要在細(xì)胞膜表達(dá)并聚集，少量彌散于胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖5)。

圖2 免疫熒光檢測(cè)HLECs E-cadherin的表達(dá) ×400

圖3 免疫熒光檢測(cè)HLECs α-SMA的表達(dá) ×400

圖4 免疫熒光檢測(cè)HLECs p-Akt的表達(dá) ×400

圖5 免疫熒光檢測(cè)HLECs p-GSK3β的表達(dá) ×400

3 討論

白內(nèi)障是臨床上常見(jiàn)的致盲性眼病，白內(nèi)障超聲乳化聯(lián)合人工晶體植入術(shù)是現(xiàn)代白內(nèi)障治療的最佳手術(shù)方式。但由于PCO的發(fā)生，引起患者部分視功能喪失。同時(shí)，PCO也是現(xiàn)代白內(nèi)障術(shù)后影響視力提高的主要因素之一[5]?，F(xiàn)代白內(nèi)障手術(shù)保留了囊袋，囊袋殘存的HLECs增生是白內(nèi)障手術(shù)后PCO形成的主要原因[6]。研究[7]顯示 HLECs的轉(zhuǎn)分化是PCO 的主要病理改變。

前期研究[1-2]顯示，TGF-β2可以誘導(dǎo)HLECs 的轉(zhuǎn)分化。利用TGF-β2可以建立HLECs轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型。利用HLECs轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)顯示整合素β1參與TGF-β2可以誘導(dǎo)HLECs轉(zhuǎn)分化，并且抑制整合素β1的表達(dá)可以抑制晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[3-4]。整合素激活后主要通過(guò)ILK發(fā)揮核心作用[8]，ILK參與體內(nèi)多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路，ILK及其信號(hào)通道在HLECs轉(zhuǎn)分化中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)顯示，TGF-β2處理后，培養(yǎng)的HLECs E-cadherin表達(dá)減弱，而α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達(dá)增強(qiáng)，而HLECs經(jīng)10 nmol/L QLT0267預(yù)處理后，α-SMA、p-Akt和p-GSK3β表達(dá)明顯減弱，E-cadherin的表達(dá)明顯增強(qiáng)。說(shuō)明Akt信號(hào)通路參與TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs轉(zhuǎn)分化過(guò)程。

ILK是近年發(fā)現(xiàn)的絲/蘇氨酸的蛋白激酶，依賴整合素的細(xì)胞粘著，通過(guò)ILK結(jié)合并磷酸化整合素β1亞單位，激活PI3K，磷酸化激活下游底物Akt、GSK-3β[9]，影響胞外信號(hào)向下游的傳遞，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等過(guò)程。QLT0267是人工合成的小分子蛋白，能自由地通過(guò)細(xì)胞膜，特異性結(jié)合ILK[10]。本研究顯示，應(yīng)用QLT0267后，HLECs p-Akt和p-GSK3β的表達(dá)明顯下降，說(shuō)明ILK介導(dǎo)Akt信號(hào)通路參與TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs轉(zhuǎn)分化過(guò)程，QLT0267通過(guò)特異性結(jié)合ILK，影響下游信號(hào)的傳導(dǎo)，降低了HLECs的轉(zhuǎn)分化，有可能抑制PCO的形成。QLT0267的作用從側(cè)面證實(shí)了ILK參與了HLECs的轉(zhuǎn)分化。

QLT0267部分抑制了TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs轉(zhuǎn)分化，但并沒(méi)有完全阻斷，提示可能還有其他的信號(hào)通道也參與了TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs轉(zhuǎn)分化過(guò)程，這需要進(jìn)一步的深入研究，以期尋找、干預(yù)HLECs轉(zhuǎn)分化或PCO形成的分子靶點(diǎn)，抑制PCO的產(chǎn)生。

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Effect of Akt signal pathway mediated by ILK in epithelial mesenchymal transition of human lens epithelial cells

Zhu Yuguang,Zhu Yan,Sun Baoqi,et al

(TheEyeCenter,AffiliatedHospitalofWeifangMedicalCollege,Weifang261031)

ObjectiveTostudytheeffectofQLT0267onexpressionsofE-cadherin,α-SMA,p-Aktandp-GSK3βinhumanlensepithelialcells(HLECs),andinvestigatetheeffectofAktsignalpathwaymediatedbyILKinepithelialmesenchymaltransition(EMT)ofHLECsinducedbyTGF-β2.MethodsTheHLECswereculturedandpassagedin vitro.The3rdgenerationofHLECsweredividedinto3groups.TheHLECsinTGF-β2groupweretreatedwithTGF-β2(100ng/L)forinducementfor48hours.TheHLECsinILKinhibitorgroupwerepretreatedwithQLT0267(10 nmol/L) for 1 hour, then treated with TGF-β2(100 ng/L) for 48 h.The HLECs in the control group were cultured in serum-free medium.The expressions of E-cadherin, α-SMA, p-Akt and p-GSK-3β were analyzed by Western blot.The expressions of E-cadherin, α-SMA, p-Akt and p-GSK-3β were detected by cell fluorescence immunoassay.ResultsCompared with the control group, the expression of E-cadherin was decreased significantly, while the expressions of α-SMA, p-Akt and p-GSK3β were increased significantly in TGF-β2 group.Compared with TGF-β2 group, the expressions of α-SMA, p-Akt and p-GSK3β were decreased significantly, while the expression of E-cadherin was increased significantly in ILK inhibitor group(F=12.325, 17.686, 8.547, 6.812, allP<0.001). QLT0267 partly reversed TGF-β2 induced expressions of E-cadherin,α-SMA, p-Akt and p-GSK3β.ConclusionThese results suggest that Akt signal pathway mediated by ILK may be involved in the procedure of EMT of HLECs induced by TGF-β2.QLT0267 can specifically bind ILK,and partly inhibit the process of EMT.Akt signal pathway may play an important role in the progress of PCO.

ILK; Akt signal pathway; human lens epithelial cells; epithelial mesenchymal transition; transforming growth factor-β2

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金計(jì)劃(編號(hào)：BS2009SW016)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2015WS0047)

濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科中心，濰坊 261031

朱玉廣，男，副教授，博士； 朱 艷，女，講師，責(zé)任作者，E-mail:azhu1975@sina.com

時(shí)間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.014.html

R 776.1

A

1000-1492(2016)11-1617-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.014

2016-06-27接收