杜 寧，陳 志，申才良，張 峰，宋旆文

?

神經(jīng)干細胞靜脈移植對大鼠脊髓損傷的修復作用

杜 寧，陳 志，申才良，張 峰，宋旆文

制備陰性對照病毒轉(zhuǎn)染的傳代神經(jīng)干細胞(NSCs)，同期制作大鼠脊髓損傷模型，隨機分為實驗組、假手術(shù)組、空白組，并對其進行術(shù)后行為學評分。3 d后取實驗組再次手術(shù)，尾靜脈輸注已用陰性對照病毒標記的大鼠NSCs濃縮液。于1周和6周時對假手術(shù)組、實驗組大鼠行10%福爾馬林灌注，以固定的大鼠脊髓段落，福爾馬林浸泡存放去除的脊髓段1 d，石蠟包埋后切片。獲得大量尚未分化、懸浮生長的NSCs球。完成NSCs的傳代。實驗組的行為學評分結(jié)果比假手術(shù)組分值高。實驗組大鼠脊髓損傷區(qū)脊髓空洞體積較假手術(shù)組小。初步證明注射NSCs液的大鼠恢復速度高于假手術(shù)組和空白組，NSCs移植能夠減小脊髓損傷處的空洞體積和促進血管生長，從而促進脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復。

脊髓損傷；移植；慢病毒轉(zhuǎn)染；行為學評分

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是脊髓造成的一過性或者永久性損害，并使其正常功能發(fā)生改變的一種損傷。這種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷往往具有嚴重的致殘性，導致患者出現(xiàn)不同程度的截癱情況[2]。SCI作為一種高致殘率、低死亡率、高花費(美國每年需要花費一百億美元于SCI上[1])的疾病，其防治一直是各國學者研究的熱點。 自Reynolds et al[2]以來，在動物實驗中，人們發(fā)現(xiàn)移植的神經(jīng)干細胞(neural stem cell,NSCs)有效促進了受損的脊髓組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復，且可整合入宿主組織并分化為神經(jīng)元細胞、星形細胞和少突膠質(zhì)細胞。這種明顯強于僅使用藥物治療的方案更具優(yōu)勢，有望成為細胞代替治療的首選[3]。使用干細胞移植治療SCI后遺癥，經(jīng)常使用的移植方法包括靜脈輸注法、腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔注射法、手術(shù)切開探查直視下脊髓內(nèi)注射等[4]。該研究探討經(jīng)靜脈輸注骨髓NSCs移植治療大鼠胸段脊髓損傷后遺癥的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 新生SPF級大鼠1只。健康成年雌性大鼠60只，SPF級，(230±20)g。本實驗所用動物、大鼠SCI手術(shù)場地由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；慢病毒、Polybrene、Enhanced Infection Solution購自上海吉凱基因公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠NSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定 取新生SPF級大鼠的全腦用于分離干細胞[5]。生物安全柜下操作，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，斷頭處死大鼠，75%酒精浸泡5 min，后紫外線消毒30 min。剪除大鼠腦膜及附著血管，剝出全腦，Hank’s液漂洗3次，剔除雜質(zhì)，剪碎腦組織，加入神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1 ml胰酶細胞消化液，加入10%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化；經(jīng)70 μm孔徑的篩網(wǎng)過濾掉血凝塊與殘渣，制單細胞懸液。過濾后的細胞液盛放于試管中1 000 r/min離心10 min，棄上清液, 用尖頭拋光的長頸吸管反復吹打單細胞懸液，加入2 ml無血清培養(yǎng)基(DMEM/F12+2%B-27+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF+青霉素100 U/ml+鏈霉素0.1 mg/ml)，再次600 r/min離心5 min，吸棄上清液, 加入無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)。以105/ml接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每3 d半換液1次, 1周左右傳代1次。培養(yǎng)2～3 d后，出現(xiàn)懸浮生長的細胞球，7 d后，600 r/min離心5 min后吸棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，長頸吸管反復吹打細胞球成為小細胞球和單細胞懸液，按量將細胞懸液分別接種至新培養(yǎng)瓶中(1×105個細胞/瓶)，每7 d傳代1次，每3 d離心更換半量培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)條件不變。

1.2.2 大鼠懸浮NSCs的轉(zhuǎn)染 為確認合適的感染條件，按照不同培養(yǎng)條件將實驗分為5組，A組：常規(guī)培養(yǎng)基組，觀察常規(guī)培養(yǎng)條件下病毒對細胞的感染效果；B組：添加Polybrene的常規(guī)培養(yǎng)基組，觀察Polybrene是否可以提升感染效果；C組：ENi.S.組，觀察用ENi.S.替代常規(guī)培養(yǎng)基時病毒對細胞的感染效果； D組：添加Polybrene的ENi.S.組，觀察Polybrene和ENi.S.條件下病毒對細胞感染效果。 Control組：監(jiān)控實驗過程中細胞生長是否正常。提取2瓶傳代培養(yǎng)3代的NSCs，分別置于兩支25 ml試管中，3 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，將細胞沉淀接種于96孔板上。取完全培養(yǎng)基稀釋的細胞懸液80 μl/孔加入96孔板中，接種9個孔(表1)。并取ENi.S.稀釋的細胞懸液80 μl/孔，接種6個孔。按照表1向各孔中加入相應體積的溶液，參考手冊稀釋Polybrene與ENi.S.。感染后8～12 h，向每孔中加入100 μl常規(guī)培養(yǎng)基，保持細胞正常生長，不換液。在第2、3天繼續(xù)培養(yǎng)，在此中途可以對細胞補液，維持細胞活性。于培養(yǎng)第4天確認感染效果。

感染后72～96 h，NSCs熒光表達豐度較高時，用顯微鏡觀察。感染效率80%左右，且細胞生長良好的組所對應的感染條件和復感染指數(shù)[感染時病毒和細胞數(shù)量的比值(multiplicity of infection，MOI)]。即可以作為后續(xù)感染實驗的依據(jù)。正式實驗改為6孔板(底面積10 cm2N，接種體積2 ml，換液體積1 ml)SCs轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)7 d后，NSCs形態(tài)上已出現(xiàn)明顯的分化，于鏡下觀察轉(zhuǎn)染NSCs的分化情況。

1.2.3 實驗分組 SPF級雌性大鼠60只，將其分為空白組(control組，20只)：SCI后不做任何輸注處理；假手術(shù)組(A組，20只)：胸9脊髓損傷后3 d尾靜脈注射磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)2 ml；實驗組(B組，20只)：T9脊髓損傷后3 d尾靜脈注射POLY-M轉(zhuǎn)染后的第二代大鼠NSCs條件培養(yǎng)液2 ml。A組、B組再隨機均分為兩個亞組，其中A1、B1組分別于飼養(yǎng)7 d后處死，A2、B2組分別于飼養(yǎng)6周后處死。

1.2.4 大鼠胸9 SCI模型的創(chuàng)建及尾靜脈移植治療 采用改良的Allen裝置制作大鼠SCI模型，咬除大鼠胸9椎板后，暴露脊髓打擊處。打擊裝置整合于立體定位儀上。將一直徑為1.5 mm 圓形薄銅墊片(面積7.075 mm2.質(zhì)量0.1 g)置于胸段第九脊椎表面，以重10 g的砝碼5 cm 高度自由墜落打擊該墊片，致傷量為50 g·cm，造成胸9/10椎間隙處脊髓的沖擊傷。常規(guī)肌肉、筋膜、表皮3層縫合，予抗生素大腿肌注適量預防感染。對Control組、A組和B組大鼠進行分籠飼養(yǎng)，每6 h人工輔助排小便1次。并于術(shù)后12、24 h分別再次予以大腿肌肉注射抗生素1次。將培養(yǎng)72 h的A組大鼠經(jīng)尾靜脈注射PBS 2 ml，B組大鼠經(jīng)尾靜脈注射單細胞濃度為1×106/ml的POLY-M慢病毒轉(zhuǎn)染后NSCs液體。

1.2.5 大鼠行為學、組織學評價方法 對傷后SCI大鼠分別進行BBB評分，作行為學觀察。BBB法將大鼠后肢運動分為22個等級，后肢全癱為0分，完全正常為21分，兩者間根據(jù)功能分為1～20分?；緝?nèi)容：關(guān)節(jié)活動的數(shù)目和范圍，負重程度及前后肢的協(xié)調(diào)性，前后爪和尾部的活動情況。評價方法見參考文獻[6]，盡可能控制動物在行動范圍的中心區(qū)域活動，觀察期時間為4 min。于以下時間點評測：術(shù)后1、6、24、48、72、96、120、144 h。本組抽取3名課題組研究生參評，他們均預先學習、掌握BBB評價標準的觀察方法。3人未參加之前的動物實驗、對大鼠分組情況不了解，3人各自獨立觀察記錄結(jié)果。

實驗鼠分別于術(shù)后1周和6周取手術(shù)標本(10%福爾馬林灌注以固定脊髓段)。對1周的A1、B1組在獲得脊髓標本后于脊髓損傷區(qū)前后截段取材，連續(xù)20 μm厚度縱切SCI處脊髓標本，HE染色觀察損傷區(qū)血管生長情況。在移植后6周獲得 A2、B2組脊髓標本脫水后石蠟包埋，以損傷區(qū)中心每間隔140 μm做橫切片行HE染色，取第10個切片來測量脊髓空洞的面積，以此方法順序取10個樣本。用 Image J1.38版本的影像分析軟件測量空洞的區(qū)域面積。空洞體積用下面方法計算：V=a×d; a=測量的面積；d=切片間距；空洞總體積Vtc=Vc1+Vc2……+Vc10。

表1 96孔板轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)干細胞加液成分表

P(M)為含0.5% Polybrene的培養(yǎng)基液，P(E)為含0.5% Polybrene的ENi.S.液

2 結(jié)果

2.1 NSCs的形態(tài)觀察及鑒定 原代NSCs接種后, 2～3 d后可見NSCs呈球形懸浮生長,到第7天時培養(yǎng)瓶內(nèi)可見球狀的細胞集落，生長數(shù)目達數(shù)十甚至上百個, 有桑葚狀、折光性強等特點，未見到明顯的貼壁和細胞突起形成(圖1)。將培養(yǎng)7 d懸浮NSCs球慢病毒轉(zhuǎn)染預實驗，確定合適的MOI值后進行批量制備(圖2)。

圖1 原代第5天NSCs的形態(tài)觀察 ×200

圖2 NSCs的轉(zhuǎn)染 ×200

2.2 NSCs的分化 在NSCs接種的用慢病毒轉(zhuǎn)染，Polybrene、Eni.S.誘導過的6孔板中，發(fā)現(xiàn)NSCs球逐漸貼壁, 細胞逐漸從細胞集落中爬出，表現(xiàn)出多種形態(tài)，細胞開始分化為各式神經(jīng)元樣細胞, 部分圓形或橢圓形的可見突起，部分則出現(xiàn)粗長突起并呈梭樣排列的神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞，并隨著培養(yǎng)時間的延長, 突起逐漸變長、增多。見圖3。

圖3 NSCs的分化鑒定 ×100

2.3 大鼠行為學評價結(jié)果 損傷72 h內(nèi)，三組數(shù)據(jù)無明顯區(qū)分，大鼠皆因SCI而評分較低，自損傷后第4天起，NSCs尾靜脈輸注處理的大鼠 BBB 評分高于control組，差異有統(tǒng)計學意義，其中96、120、144 h時，實驗組P<0.05(t=-3.354，P=0.004)。見表2。

表2 大鼠BBB評分表

與假手術(shù)組比較：#P<0.05；與前一時間點比較：*P<0.05

2.4 組織學評價結(jié)果 對損傷區(qū)血管橫徑進行測距，經(jīng)過NSCs 尾靜脈注射的B1組大鼠脊髓損傷區(qū)血管橫徑(13.50±0.93)μm較假手術(shù)組血管橫徑(6.90±0.81)μm大(圖4)，且control組和實驗組之間的差異有統(tǒng)計學意義(t=18.856，P=0.001)。

Image J 1.38檢測損傷區(qū)脊髓空洞體積顯示，經(jīng)過NSCs靜脈移植處理的實驗(B2)組大鼠SCI區(qū)脊髓空洞體積(0.27±0.09)mm3較對照(A2)組 體積(0.57 ± 0.10)mm3小(圖5)，得知control組和移植組差異有統(tǒng)計學意義(t=-7.518，P=0.001)。

圖4 SCI大鼠1周后觀察SCI區(qū)血管生長情況 HE×100

圖5 SCI大鼠6周后觀察脊髓空洞結(jié)果 HE×40

3 討論

3.1 評價大鼠脊髓功能 對于研究大鼠脊髓損傷及其治療作用來說，能否正確評價脊髓功能是一項非常重要的內(nèi)容，其不僅關(guān)系到實驗設(shè)計的可行性，還影響著實驗結(jié)果的分析。大鼠后肢BBB評分特點：操作簡單，容易掌握，相較聯(lián)合行為評分法[7]有更多動物行為評估的細節(jié)；隨分值提升，也體現(xiàn)了大鼠SCI恢復的整個過程。大鼠后肢BBB評分相對客觀，但需熟悉評價方式。本研究對不知道大鼠實驗與分組的觀察員進行訓練以減少主觀因素的影響。從BBB評分法的評定細節(jié)看，它幾乎涵蓋了大鼠SCI后肢體運動功能恢復行為上的變化，并且與大鼠SCI程度相符。

3.2 NSCs的旁分泌作用 經(jīng)過尾靜脈輸注治療過的SCI大鼠，雖然沒有證明損傷區(qū)血管數(shù)量是否增加，但鏡下顯示血管直徑較對照組大。研究表明NSCs能分泌多種細胞因子：如膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子等。目前細胞移植的研究無法證實細胞能夠在受損脊髓處發(fā)揮替代效應，但分泌的因子能夠?qū)Υ笫蟮募顾枭窠?jīng)起旁分泌作用，并促進內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞的增生[8-11]。

3.3 本實驗不足之處及未來研究方向

3.3.1 流式細胞儀的引入以及慢病毒轉(zhuǎn)染移植SCI大鼠的大體示蹤技術(shù)開展 流式是較先進的細胞定量分析技術(shù)，有引用價值。由于盲篩MOI準確率不高，每批NSCs的數(shù)目不一致，細胞計數(shù)存在誤差。流式細胞儀技術(shù)的引入對精確衡量細胞轉(zhuǎn)染成功率有顯著意義。目前本實驗對于NSCs分化的研究僅停留在體外，不能百分百佐證其在體內(nèi)的分化情況也與培養(yǎng)基中一致。而且NSCs出現(xiàn)分化也不代表細胞移植技術(shù)已將NSCs輸送至傷處進行功能修復，故今后應開展大體示蹤技術(shù)，如活體熒光攝像儀器可以充分顯示被標記細胞在大鼠體內(nèi)存在的位置(本實驗由于資源和時間關(guān)系未引入)。

3.3.2 MSCs的動脈序貫移植 間充質(zhì)干細胞(MSCs)等的研究價值越來越被人們重視。目前至少218項臨床試驗研究已將骨髓間充質(zhì)干細胞應用于治療途徑。在這之中，SCI的治療性研究主要集中在兩個領(lǐng)域：即神經(jīng)的保護和神經(jīng)再生。前者旨在防止繼發(fā)性的損傷對脊髓組織造成的危害，而后者則致力于研究重新連接斷開、死亡的脊神經(jīng)[12-15]。對各種干細胞移植的研究一直是骨科熱點，它能否成為治療SCI的金標準尚不清楚，如NSCs和骨髓間充質(zhì)干細胞相比，NSCs的體外培養(yǎng)簡單易行，而骨髓間充質(zhì)干細胞在體外生長增殖力會下降，且更易老化等；而NSCs本身的移植治療又存在脊髓微環(huán)境不適合NSCs生長、NSCs移植療效不可驗證的一些問題等。在接下來的研究中，將逐漸把重心轉(zhuǎn)移至骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)髂內(nèi)、腹主動脈的移植上。

[1] Noonan V K, Kwon B K. The Rick Hansen Spinal Cord Injury Registry (RHSCIR): a national patient-registry[J]. Spinal Cord, 2012,50(1):22-7.

[2] Reynolds B A,Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system[J]. Science,1992，255:1707-10.

[3] An Y H．Tsang K S，Zhang H．Potential of stem cell based therapy and tissue engineering in the regeneration of central nervous systemi[J]．Biomed Mater，2006，1：38-44．

[4] 陳 濤,田增民,杜亞楠. 神經(jīng)干細胞移植途徑的理論研究進展[J]. 中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(40)：7947-50.

[5] White P M,Morrison S J, Orimoto K, et al.Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals[J].Neuron,2001,29(1):57-71.

[6] 陳向榮,游思維.金大地.BBB評分評估脊髓損傷大鼠后肢運動功能的探討[J].中國脊柱脊髓雜志,2004,14(9):547-9.

[7] Gale K, Kerasidis H, Wrathall J R.Spinal cord contusion in the rat:behavioral analysis of functional neurologic impairment[J].Exp Neurol,1985,88(1):123-34.

[8] Dray C, Rougon G, Debarbieux F. Quantitative analysis byinvivoimaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord[J].Proc Natl Acad Sci U S A ,2009,106:9459-64 .

[9] Jain A,McKeon R J, Brady-Kalnay S M,et al.Sustained delivery of activated Rho GTPases and BDNF promotes axon growth in CSPG-rich regions following spinal cord injury[J]. PLoS One,2011,6:e1613-5.

[10]Ochodnick P, Cruz C D, Yoshimura N, et al. Nerve growth factor in bladder dysfunction: contributing factor, biomarker, and therapeutic target[J]. Neurourol Urodyn,2011,30(7):1227-41.

[11]Sundberg L M, Herrera J J, Narayana P A. Effect of vascular endothelial growth factor treatment in experimental traumatic spinal cord injury:invivolongitudinal assessment[J]. Neurotrauma,2011, 28:565-78.

[12]Sharma R R, Pollock K, Hubel A,et al.Mesenchymal stem or stromal cells:a review of clinical applications and manufacturing practices[J]. Transfusion, 2014,54 (5):1418-37.

[13]Beyer Nardi N, da Silva Meirelles L.Mesenchymal stem cells: isolation,invitroexpansion and characterization[J]. Stem Cells, 2006,174:249-82.

[14]Kabu S,Gao Y,Kwon B K,et al.Drug delivery, cell-based therapies, and tissue engineering approaches for spinal cord injury[J]. J Controlled Release,2015,219:141-54.

[15]Silva N A, Sousa N, Reis R L,et al. From basics to clinical: A comprehensive review on spinal cord injury[J]. Prog Neurobiol,2014,114:25-57.

Effect of neural stem cells vein transplantation on repair of spinal cord injury rats

Du Ning，Chen Zhi，Shen Cailiang，et al

(DeptofOrthopaedics,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

Neural stem cell (NSCs) were taken from brain tissue of SPF newborn rat and NSCs transfected with virus were prepared. The model of rat spinal cord injury(SCI) was bulit by modified Allen method. All rats were divided into three groups, including SCI group, control group and blank group. Afterwards, every rat was going on behavioral score. After three days, rats of SCI group were injected with NSCs through caudal vein. After one week and three weeks, rats of SCI group and control group were perfused with 10% formalin until rats muscles spasmed and rats became stiff. Then, fixed spinal cords from rats were taken from rats and were fixed in formalin paraffin section. NSCs of rats were isolated and cellular pellets were observed suspending in the medium. These cells showed long-term proliferation in vitro. Behavioral score of SCI group was higher than that of the control group. What′s more, cavity volume in the injury site of spinal cord of SCI group was smaller than that of the control group(0.27±0.09,0.57±0.10 respectively). The transplantation of NSCs could accelerate recovery process of rats and promote recovery of neurological function after spinal cord injury through reducing cavity volume in the injury site of spinal cord and facilitating the growth of blood vessel.

spinal cord injury; transplantation; lentivirus infection; behavioral score

國家自然科學基金(編號:81472088);安徽省自然科學基金(編號:1508085MH152)

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨科，合肥 230032

杜 寧，男 ，碩士研究生； 申才良，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail：shencailiang1616@163.com

時間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.032.html

R 681.5

A

1000-1492(2016)11-1688-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.032

2016-07-18接收