李夏

（四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川瀘州646000）

酵母菌絮凝作用在甜葉菊苷提取工藝中的應(yīng)用

李夏

（四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川瀘州646000）

以啤酒酵母菌懸液作為絮凝劑對浸提液進行絮凝，根據(jù)文獻資料選擇啤酒酵母培養(yǎng)時間、絮凝劑用量、溫度、助凝劑種類、CaO投加量、pH值這幾個因素進行單因素試驗，最后以浸提液澄清率和甜葉菊苷損失率作為評價指標，分別考察啤酒酵母在各因素不同水平下對甜葉菊苷浸提液的絮凝作用。結(jié)果表明，CaO投加量這一個因素對絮凝效果的影響最為顯著，其次為絮凝劑的用量，pH、溫度變化對絮凝效果影響不太顯著，且酵母菌絮凝效果最佳的組合為：絮凝劑用量4.8mL，pH值為5，CaO投加量為450mg/L，絮凝溫度為30℃，此時甜葉菊苷提取液吸光度為0.204、澄清率為78.5%、損失率為16.54%。

絮凝條件；絮凝效果；絮凝劑；酵母菌；化學(xué)絮凝劑

絮凝是酵母的可遺傳特性之一，絮凝特性受自身絮 凝 基 因（FLO1、FLO2、FLO4、FLO8、FLO5、FLO9、FLO10為顯性，F(xiàn)LO3為半顯性）控制，其中FLO1、FLO2、FLO4、FLO8為等位基因，故不同菌種的酵母，其絮凝性不同[1]。甜葉菊苷是一種性能優(yōu)良的甜味劑，其甜度為蔗糖甜度的近300倍，其食品安全性很高，并具有降低血壓的作用，是理想的高甜度、低熱量、口味好、防齲齒，對糖尿病和高脂血癥有很好療效的一種新型甜味劑，應(yīng)用前景十分廣泛。

本文圍繞酵母的絮凝特性對比現(xiàn)工業(yè)上提取甜葉菊苷廣泛采用的化學(xué)絮凝劑，提出酵母絮凝劑的影響因素及最佳絮凝條件，展望酵母絮凝劑的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

甜葉菊干葉：市售；酵母液體培養(yǎng)基：微生物實驗室自制；NaOH 1mol/L、HCl1mol/L、50%CaO溶液：生物化學(xué)實驗室自配。

SHZ-D（III）型抽濾機：中浮儀器設(shè)備有限公司；752N型分光分度計：上海天翔光學(xué)儀器有限公司；SPX-150恒溫生化培養(yǎng)箱：上海丙林電子科技有限公司；pH S-25數(shù)顯酸度計：上海虹益儀器儀表有限公司；TD5G臺式過濾離心機：上海趙迪生物科有限公司；JH-12型恒溫加熱器：成都市科恒達儀器設(shè)備有限

責(zé)任公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海藍凱儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 浸取液的制備

在1 000mL燒杯中加入適量去離子水（為原料的10倍），加熱至沸，加入甜葉菊干葉70 g，攪拌使干葉完全浸泡在沸水中，然后蒸煮40min。冷卻到室溫，過濾，得到黑褐色初提液。濾渣再連續(xù)提取2次（每次加300mL自來水，蒸煮20min）。過濾后將3次提取液合并，總體積約1 000mL。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

取市售大麥150 g，洗凈后浸泡12 h，放置在陰暗處覆蓋濕潤的紗布使其發(fā)芽（溫度為室溫），直至麥根長出，長度達到麥粒的兩倍長后，停止發(fā)芽并將麥芽攤開曬干。待將干麥芽磨碎、稱重，按照麥芽和水1∶4（g/mL）的比例混合，同時加入淀粉酶，65℃水浴糖化3 h。向糖化好的麥芽汁中加水20mL，然后將糖化液煮沸（注意要一邊攪拌一邊煮），過濾后加入2%瓊脂，高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌20min，制備得到的即為麥芽汁培養(yǎng)基。

1.2.3 菌種培養(yǎng)及處理

將活化的菌種（市售啤酒酵母）按2%的比例進行接種后至于搖床中，于35℃，120 r/min的條件下進行培養(yǎng)。發(fā)酵液2 000 r/min的條件下離心5min，保留菌體洗滌，此時得到較純的啤酒酵母菌體總共用200mL，將啤酒酵母分散到發(fā)酵液1/2體積的蒸餾水中，在振蕩器上振蕩混勻制得啤酒酵母菌懸液作為啤酒酵母絮凝劑。

1.2.4 甜葉菊苷樣品液的制備

稱取甜葉菊苷標準品10mg，放置在10mL的容量瓶中，用去離子水將甜葉菊苷溶解并稀釋到10mL，搖勻，制成1mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

1.2.5 甜葉菊苷的測定及損失率的計算[4-5]

甜葉菊苷測定及損失率計算參照多糖測定方法：苯酚-硫酸比色法及損失率計算方法：

量取提取液和絮凝后的樣品液各1.0mL，置10mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，苯酚-硫酸比色法測定甜菊苷的含量，損失率P按下式計算：

式中：P為損失率；C0、C1分別為提取液和樣品溶液中甜菊苷的含量，單位為mg/mL。

1.2.6 澄清率的計算[6-7]

以蒸餾水做參比，測定甜葉菊提取液在670 nm處的吸光度A0及樣品溶液在上述波長處的吸光度A1，澄清率B按下式計算：

1.2.7 酵母菌絮凝條件的確定

1.2.7.1 酵母菌絮凝單因素試驗

1）發(fā)酵時間對絮凝效果的影響

菌種培養(yǎng)24 h后每隔12 h進行取樣，測定不同的發(fā)酵時間對啤酒酵母絮凝效果的影響，共取樣9次，取樣按1.2.3的方法對啤酒酵母菌種進行處理，將處理后的菌懸液分別添加在裝有20mL甜葉菊苷浸取液的試管中，水浴35℃下絮凝20min，計算甜葉菊苷的損失率和絮凝后浸提液的澄清率。

2）酵母菌投加量對澄清效果的影響

取甜葉菊苷粗體液20mL，分別加入絮凝劑酵母菌混懸液 0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6、4.0、4.6、5.2 mL在pH 5.0，水浴35℃下絮凝20min.計算澄清率和甜葉菊苷損失率。

3）CaO添加量對絮凝效果的影響

取5只試管，加入甜葉菊苷粗提液20mL，酵母絮凝劑3.6mL，分別加入濃度各為150、300、450、600、750mg/L的CaO溶液。調(diào)整絮凝溶液pH值至5.0、35℃條件下水浴20min進行絮凝。

4）絮凝溫度對絮凝效果的影響試驗

取甜葉菊苷粗提液20mL，加入絮凝劑3.6mL，調(diào)整pH 5.0，水浴溫度分別為20、25、30、35、40、45、50℃，絮凝20min。

5）pH對絮凝效果影響的試驗

取甜葉菊苷粗提液20mL，加入絮凝劑3.6mL，在35℃，pH值分別為1、2、3、4、5、6、7、8條件下水浴20min。

1.2.7.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗，得出絮凝劑最佳用量范圍、最適溫度差以及助凝劑的投放范圍，在此基礎(chǔ)上設(shè)立正交試驗。其中各因素和水平見表1。

表1 酵母菌絮凝正交試驗各因素及水平Tab le1 Yeast flocculation orthogonalexperiment factorsand levels

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌絮凝法單因素試驗結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)時間對絮凝效果的影響結(jié)果

培養(yǎng)時間對絮凝效果的影響結(jié)果見表2。

表2 培養(yǎng)時間對絮凝效果的影響Table2 Theeffectof incubation tim eon flocculation

結(jié)果可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，啤酒酵母的絮凝活性逐漸升高，當(dāng)培養(yǎng)48 h后，啤酒酵母的絮凝活性達到49.16%。此后澄清率變化不再顯著增加，幾乎穩(wěn)定。江慧華等和郭旭輝等的研究中，篩選得到的微生物達到最大絮凝活性的時間為分別在培養(yǎng)后的56 h和60 h。均高于本試驗中啤酒酵母達到最大值絮凝效果的時間。所以，試驗中得出的啤酒酵母較短的培養(yǎng)時間以及較穩(wěn)定的絮凝活性使得該菌在實際生產(chǎn)中具有非常大的優(yōu)勢。

2.1.2 酵母菌投加量對澄清效果影響試驗結(jié)果

酵母菌投加量對澄清效果的影響見表3。

表3 酵母菌投加量對澄清效果的影響Table3 Theeffectof dosing quantity of yeaston clarification

結(jié)果可看出，隨著絮凝劑投加量的增多，測得吸光度逐漸增大，但當(dāng)絮凝劑投加量達4.8mL時，又呈現(xiàn)下降狀態(tài)，20mL甜葉菊浸取液加入4.2mL絮凝劑時，吸光度達到最低并趨于穩(wěn)定。

2.1.3 CaO對絮凝效果的影響試驗結(jié)果CaO對澄清效果的影響見表4。

表4 CaO對澄清效果的影響Table4 Theeffectof CaO on clarification

可以看出，選用GaO做助凝劑，隨著Ca2+濃度的增大，鈣橋作用明顯，酵母菌的自絮凝作用隨之加強。酵母菌的絮凝效果隨Ca2+濃度變化穩(wěn)定。但隨著金屬離子的增多，酵母菌的絮凝作用也會相應(yīng)的呈現(xiàn)抑制作用，因此在擴大絮凝時也應(yīng)當(dāng)相應(yīng)考慮這一點。

2.1.4 絮凝溫度對絮凝效果的影響試驗結(jié)果

絮凝溫度對絮凝效果的影響見表5。

表5 絮凝溫度對絮凝效果的影響Table5 fTheeffectof floccu lation temperatureon floccu lation

可以看出溫度對啤酒酵母的絮凝性影響較大，當(dāng)溫度在20℃～35℃范圍內(nèi)時，甜葉菊浸提液澄清升高；當(dāng)溫度超過35℃后，絮凝活性下降，說明菌株所產(chǎn)絮凝劑的絮凝活性受溫度影響顯著。

2.1.5 pH值對絮凝效果影響試驗結(jié)果

pH值對絮凝效果的影響見圖6。

表6 pH值對絮凝效果的影響Table6 Theeffectof pH on floccu lation

可以看出在pH3～5范圍內(nèi)時，啤酒酵母的絮凝性較好，甜葉菊苷浸提液的澄清率較高；酸堿值超過此

范圍，絮凝活性有所下降，說明菌株所產(chǎn)絮凝劑的絮凝活性受pH影響較顯著，分析絮凝劑中的有效絮凝物質(zhì)可能帶有一定的電解性，絮凝劑的電解程度及其帶電荷的性質(zhì)與絮凝效果關(guān)系密切。

2.1.6 酵母菌絮凝正交試驗結(jié)果

酵母菌絮凝正交試驗結(jié)果見表6。

表6 酵母菌絮凝正交試驗結(jié)果Table6 Yeast flocculation orthogonalexperim ent results

通過正交試驗，得出了啤酒酵母菌絮凝甜葉菊苷浸提液的最優(yōu)因素和水平組合為A3B3C2D1，即：絮凝劑用量4.8mL，pH為5，CaO投加量為450mg/L，絮凝溫度為30℃，啤酒酵母絮凝效果最好。

由于正交試驗的9組試驗中沒有A3B3C2D1組合，因此按照最優(yōu)方案A3B3C2D1組合進行驗證，所得數(shù)據(jù)為：吸光度0.204、澄清率78.5%、損失率16.54%。

2.2 化學(xué)絮凝法澄清試驗結(jié)果[2]

對比文獻資料，使用化學(xué)絮凝劑在取得相近澄清效果的條件下（化學(xué)絮凝法78.48%，啤酒酵母絮凝法78.5%），兩者甜葉菊苷的損失率差異明顯（化學(xué)絮凝法19.24%，啤酒酵母絮凝法16.54%）。因此，啤酒酵母絮凝法能有效地保留溶液中的有效成分，投加量少，并且安全無毒，完全可以使用啤酒酵母替代傳統(tǒng)化學(xué)絮凝劑。

3 討論

現(xiàn)工業(yè)中使用的大部分絮凝劑會改變甜葉菊苷的風(fēng)味、甚至有些絮凝劑對人體健康有一定的危害，在絮凝的過程中也會引入大量的雜質(zhì)，為下游加工處理帶來麻煩，處理費用也比較大。本試驗針對啤酒酵母的絮凝作用，采用啤酒酵母作為絮凝劑，探討啤酒酵母對甜葉菊苷提取液的絮凝效果及影響啤酒酵母絮凝作用的因素，尋找啤酒酵母最佳的絮凝條件組合。經(jīng)過試驗，確定了啤酒絮凝的最佳條件組合為絮凝劑用量4.8mL，pH值為5，CaO投加量為450mg/L，絮凝溫度為30℃，此時甜葉菊苷提取液吸光度為0.204、澄清率為78.5%、損失率為16.54%，同時按照試驗確定的最佳組合進行了小試生產(chǎn)試驗，試驗結(jié)果證明，啤酒酵母確實具有較強的絮凝能力，在實驗確定的最佳條件組合下，其對甜葉菊苷浸提液的澄清率均穩(wěn)定在70%以上，雖然與目前工業(yè)上使用的絮凝劑相比，效果稍差，但是無毒無害、可食用、易回收是啤酒酵母在食品添加劑制備領(lǐng)域的突出優(yōu)點。且甜葉菊苷具有不可發(fā)酵性，絮凝過程中殘存的啤酒酵母不易在產(chǎn)品中生存、發(fā)酵，對產(chǎn)品質(zhì)量及保質(zhì)期沒有影響，這也說明，甜葉菊苷自身性質(zhì)決定了其非常適合使用微生物絮凝劑進行絮凝純化。

[1]Luan J,Zhao C X.The research progress of yeast flocculation in advance[J].The food and fermentation industry,2008,12:139

[2]Xie J,Liu X J.Water extract and clarify themechanism of chitosan clarification stevia[J].Food science,2011,10:2

[3]Zhang LH,Hou X F.Regulating calcium levels,improve the state of yeast flocculation[J].wine,2008,9:63-64

[4]WeiX J,Xiang FC.Iron amaranth polysaccharide extraction process optimization[J].Anhuiagriculturalscience,2012,40(34):16548-16551

[5]HanW,Zhang L L.Mulberry polysaccharideof flocculating purification and its oxidation resistance[J].Journal of nanjing university of technology(naturalscienceedition),2014,1:97-98

[6]MORAESEDP,MACHADONRCF．Clarificationof Steviarebaudiana (Bert．)Bertoniextractby adsorption inmodified zeolites[J]．ActaScientiarum Universidade EstadualdeMaringa,2001,23(6):1375-1380

[7]SILVA FV,BERGAM ASCOR,ANDRADECM G,etal．Purificationprocess of stevioside using zeolites and membranes[J]．InternationalJournalofChemicalReactor Engineering,2007(5):7

[8]Zhang X Y,Xu ZW,ZanY,etal．Steviawater extraction liquid of flocculation[J]．Modern food scienceand technology,2006,23(2):8-10

The Application Technology of Yeast Flocculant in Extracting Stevioside

LIXia
（Sichuan ChemicalVocational TechnicalCollege，Luzhou 646000，Sichuan，China）

Yeastbacteria suspension was used as flocculant to extract.The literature flocculant dosage，temperature，CaO dosing quantity，pH numerical single factor experiments，extract absorbance，clarify rate and loss rateofsteviaglycosideswere choosed asevaluation index，to investigate the factorsunder different levelsof steviaglycosidesextractsof flocculation.The resultsshowed that the CaO dosingquantitywas the significant factors，the dosageof the flocculatingagent，pH，temperature changewerenotsignificant factoron the flocculation performance.The best combination of the yeast flocculation effectwas as follows：flocculant dosage 4.8 mL，pH 5，CaO dosing quantity 450 mg/L，flocculation temperature of 30℃，the stevia glycosides extracts absorbancewas0.204，clarification rateof78.5%，loss ratewas16.54%.

flocculation conditions；flocculation effect；flocculant；yeast；chemical flocculant

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.017

2016-02-23

李夏（1984—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：微生物、生物化學(xué)。