唐華羽 李玉芝 李長德 解云川

黑龍江省佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外三科(佳木斯154002)

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四君子湯總多糖對小鼠腸道菌群及免疫功能的影響*

唐華羽 李玉芝 李長德 解云川

黑龍江省佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外三科(佳木斯154002)

目的：探討四君子湯總多糖對小鼠腸道菌群及免疫功能的影響。方法：100只健康小鼠分為4組，每組25只。脾虛造模。正常對照組與模型對照組每天生理鹽水灌胃，低劑量給藥組每天每公斤體重1g四君子湯多糖灌胃，高劑量給藥組每天每公斤體重2g灌胃。分析四君子湯總多糖對小鼠腸道菌群及免疫功能的影響。結(jié)果：低劑量給藥組及高劑量給藥組胸腺指數(shù)級派氏結(jié)顯著高于造模對照組。腸道sIgA含量顯著高于模型對照組；低劑量給藥組T淋巴結(jié)比例顯著高于模型對照組。造模對照組雙歧桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、脆弱擬桿菌水平均高于正常對照組。結(jié)論：四君子湯多糖能夠糾正腸道菌群失調(diào)，恢復(fù)脾虛小鼠的免疫功能，并且有劑量依賴性。

腸道細菌易位是指腸道細菌及其產(chǎn)物在一定的條件下從腸腔易位至腸系膜或者其他腸外臟器的過程，嚴重的患者可出現(xiàn)嚴重肝病、自發(fā)性細菌性腹膜炎、肝腎綜合征、肝性腦病、肝肺綜合征。多糖是四君子湯含的有效成分之一，四君子湯多糖能夠通過激活腸道黏膜局部的免疫從而影響機體的免疫功能[1-2]。目前四君子湯總多糖對機體免疫功能的作用機制還不十分明確。四君子湯在中醫(yī)上是治療脾虛之癥的經(jīng)典方，在現(xiàn)代醫(yī)藥研究中，其具有調(diào)節(jié)胃腸功能的作用，也具有促進代謝、保護肝臟、改善微循環(huán)、抗腫瘤、抗血小板聚集、抗應(yīng)激反應(yīng)等作用[3]。研究顯示四君子湯總多糖是四君子湯總多糖具有很強的免疫活性，能夠增強免疫功能[4]。研究顯示四君子湯能夠改善腸道菌群失調(diào)[5]。本研究分析四君子湯總多糖通過腸道菌群對小鼠免疫功能的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材 料

1.1 動 物 100只健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重20～22g。

1.2 試劑、儀器及藥物 番瀉葉用10倍水煮沸10min，60℃濃縮為100%水煎劑，4℃保存。氯化鈉注射液，冰乙酸，伊紅美藍瓊脂，乳酸桿菌選擇性瓊脂，雙歧桿菌BS培養(yǎng)基，類桿菌-膽汁-七葉皂瓊脂，革蘭染液，芽孢染液。立式壓力蒸汽滅菌器，電熱恒溫培養(yǎng)箱，厭氧培養(yǎng)袋，厭氧產(chǎn)氣劑，渦旋儀，高速離心機，血細胞分析儀，流式細胞儀。

2 方 法

2.1 分組 100只小鼠分為4組，四君子湯高劑量組(高劑量組)，四君子湯低劑量組(低劑量組)，模型對照組，正常組對照組,每組25只。

2.2 脾虛造模 除了正常對照組25只小鼠外，其余75只小鼠脾虛造模。用生藥濃度為1g/ml的番瀉葉水煎液灌胃，劑量每10g體重0.15ml，隔日禁食。連續(xù)8d。

2.3 給藥方法 高劑量組在連續(xù)8d后四君子湯多糖溶液每公斤體重2g灌胃，低劑量組每公斤體重1g灌胃。模型對照組及針刺對照組均等體積蒸餾水灌胃。連續(xù)8d。

2.4 腸道菌群計數(shù) 取小腸盲腸內(nèi)容物0.1g，置入滅菌EP管內(nèi)，加生理鹽水0.9ml，200轉(zhuǎn)/min渦旋，混勻，均質(zhì)化標本稀釋度10-1，取0.15ml，加無菌生理壓水1.35ml，混勻，標本稀釋度10-2，繼續(xù)10倍稀釋至10-8。取稀釋液，涂布法接種，定量0.1ml。進行菌落計數(shù)，采用菌落單位/g(CFU/g)對數(shù)值表示。各種細菌培養(yǎng)條件：雙歧桿菌培養(yǎng)基BS，厭氧培養(yǎng)48h；乳酸桿菌培養(yǎng)基乳酸桿菌選擇性瓊脂，厭氧培養(yǎng)48h；脆弱擬桿菌培養(yǎng)基BBE，厭氧培養(yǎng)48h；大腸桿菌培養(yǎng)基EMB，需要培養(yǎng)24h。

2.5 外周血白細胞比例測定 摘小鼠眼球取血，滴在EDTA.K2抗凝采血管中，混勻，檢測白細胞比例。

2.6 測定淋巴結(jié)以及脾臟淋巴細胞增殖能力 無菌條件下取小鼠腸系膜脾臟、淋巴結(jié)，置于預(yù)冷PBS無論培養(yǎng)皿中，研磨，200目網(wǎng)篩過濾，收集細胞，制備單細胞懸液，冷PBS液洗滌2次，1200轉(zhuǎn)/min離心10min。低滲法裂解脾細胞紅細胞，計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞濃度2×106個/ml。制備的淋巴細胞懸液接種在96孔板，每孔190μl，每樣6個復(fù)孔，其中3個孔加ConA液10μl，3個孔加等量培養(yǎng)液，另設(shè)調(diào)零孔，只有培養(yǎng)液。37℃，5%的CO2恒溫箱培養(yǎng)68h，加濃度為5mg/mlMTT液20μl，孵育4h。取出后顯微鏡下觀察有紫色結(jié)晶，1200轉(zhuǎn)/min離心10min，棄去上清，加DMSO150μl/孔，震板10min，溶解結(jié)晶。酶標儀在570nm處測吸光值，計算刺激指數(shù)。臟器指數(shù)計算方法為臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)×10。記錄小腸段派氏結(jié)。

2.7 測定腸道sIgA含量 自幽門開始，取小鼠小腸段20cm，置于含PBS液培養(yǎng)皿中，縱向剖開，轉(zhuǎn)至離心管，渦旋15s，3000轉(zhuǎn)/min離心10min，收集上清，采用ELISA方法測定sIgA含量。

2.8 檢測腸系膜淋巴結(jié)T、B淋巴細胞比例 腸系膜淋巴結(jié)置于含PBS液培養(yǎng)皿中，研磨，制備懸液，1000轉(zhuǎn)/min離心，4℃下，離心10min，PBS液沖洗2次。每樣取細胞懸液100μl置于流失管中，加抗體，混勻，避光孵育20min，各管加PBS液2ml沖洗2次，加PBS液500μl重懸，流式細胞儀檢測T、B淋巴細胞比例。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，采用F檢驗或t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組胸腺指數(shù)及派氏結(jié)個數(shù)比較 模型對照組胸腺指數(shù)及派氏結(jié)較對照組顯著下降，而低劑量給藥組及高劑量給藥組胸腺指數(shù)接近正常對照組，顯著高于造模對照組，低劑量組派氏結(jié)也顯著高于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組胸腺指數(shù)及派氏結(jié)個數(shù)比較

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與模型對照組比較▲P<0.05

3.2 外周血紅細胞、血紅蛋白、白細胞水平比較 模型對照組血紅細胞、血紅蛋白、白細胞水平均顯著低于正常對照組(P<0.05)；高劑量給藥組白細胞計數(shù)及血紅蛋白水平顯著高于模型對照組(P<0.05),見表2。

表2 外周血紅細胞、血紅蛋白、白細胞水平比較

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與模型對照組比較▲P<0.05

3.3 四組淋巴結(jié)及脾臟細胞增殖能力 模型對照組淋巴結(jié)及脾臟細胞刺激指數(shù)均較正常對照組顯著下降(P<0.05)；低劑量給藥組和高劑量給藥組淋巴結(jié)及脾臟細胞刺激指數(shù)均顯著高于模型對照組(P<0.05)。

表3 四組淋巴結(jié)及脾臟細胞刺激指數(shù)

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與模型對照組比較▲P<0.05

3.4 各組外周血白細胞比例 模型對照組中性細胞、單核細胞構(gòu)成比顯著高于正常對照組，淋巴細胞顯著低于正常對照組(P<0.05)；低劑量給藥組和高劑量給藥組中性細胞、單核細胞構(gòu)成比顯著低于造模對照組，淋巴細胞顯著高于模型對照組(P<0.05)。

表4 各組外周血白細胞比例(%)

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與模型對照組比較▲P<0.05

3.5 各組淋巴結(jié)T、B淋巴細胞比例以及腸道sIgA含量 模型對照組腸道sIgA含量顯著低于正常對照組，而低劑量給藥組和高劑量給藥組顯著高于模型對照組；模型對照組T淋巴結(jié)比例顯著低于正常對照組，B淋巴細胞比例顯著高于正常對照組(P<0.05)；低劑量給藥組T淋巴結(jié)比例顯著高于模型對照組(P<0.05)。

表5 各組淋巴結(jié)T、B淋巴細胞比例以及腸道sIgA含量

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與模型對照組比較▲P<0.05

3.6 各組腸道菌群比較 造模對照組雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、脆弱擬桿菌水平均高于正常對照組(P<0.05)；低劑量給藥組乳酸桿菌水平低于模型對照組，高劑量給藥組乳酸桿菌、大腸桿菌水平均顯著低于模型對照組(P<0.05)。

表6 各組腸道菌群比較(logCFU/g)

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與模型對照組比較▲P<0.05

4 討 論

君子湯方劑組成主要為白術(shù)、人參、甘草、茯苓，四味藥均含有大量多糖。現(xiàn)代藥理研究顯示，白術(shù)能夠提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，促進細胞免疫功能。人參增強機體對非特異性刺激的能力，可改變機體的反應(yīng)性，增強機體對有害刺激的反應(yīng)能力，增強機體耐缺氧水平，增強機體免疫功能。甘草具有抗炎、抗過敏的作用，能夠保護腸道粘膜。有研究顯示，四君子湯能夠?qū)弓h(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制作用，促進淋巴細胞增殖，提示四君子湯能夠促進小鼠的細胞免疫及體液免疫功能[6]。白術(shù)性苦，溫，茯苓性甘、淡，黨參性甘、平，甘草性甘、平。黨參與甘草屬陽，白術(shù)與茯苓屬陰?，F(xiàn)代藥理研究顯示，白術(shù)能夠提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，促進細胞免疫功能。人參增強機體對非特異性刺激的能力，可改變機體的反應(yīng)性，增強機體對有害刺激的反應(yīng)能力，刺激垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)，增強機體免疫功能。甘草具有抗炎、抗過敏的作用，能夠保護腸道粘膜?，F(xiàn)代藥理顯示，四君子湯方劑具有抗自由基損傷，改善內(nèi)分泌，調(diào)節(jié)代謝等作用。四君子湯能夠促進小鼠的細胞免疫及體液免疫功能。腸道黏膜的免疫細胞在受到刺激后，發(fā)生活化，分泌細胞因子，分泌型IgA，淋巴細胞細胞毒作用，發(fā)揮腸黏膜的屏障防御作用。淋巴細胞活化后可遷移至免疫系統(tǒng)其他部分，介導(dǎo)胃腸道局部黏膜免疫系統(tǒng)導(dǎo)致的全身性免疫反應(yīng)。免疫細胞表面細胞膜分為大多為糖或者糖基化合物，是免疫細胞與其他活性物質(zhì)作用的配體，四君子湯多糖有可能通過這些配體分子而發(fā)揮作用。在四君子湯對機體的免疫調(diào)節(jié)過程中，腸道黏膜免疫系統(tǒng)可能發(fā)揮了重要的作用，通過腸道免疫細胞，提供信息傳遞，通過神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，調(diào)節(jié)全身的免疫系統(tǒng)。四君子湯對腸上皮細胞具有促進增殖的作用。

腸道黏膜的免疫細胞在受到刺激后，發(fā)生活化，分泌細胞因子，分泌型IgA，淋巴細胞細胞毒作用，那個人發(fā)揮腸黏膜的屏障防御作用。淋巴細胞活化后可遷移至免疫系統(tǒng)其他部分，介導(dǎo)胃腸道局部黏膜免疫系統(tǒng)導(dǎo)致的全身性免疫反應(yīng)。免疫細胞表面細胞膜分為大多為糖或者糖基化合物，是免疫細胞與其他活性物質(zhì)作用的配體，四君子湯多糖有可能通過這些配體分子而發(fā)揮作用。經(jīng)腹腔注射給藥，四君子湯多糖成分經(jīng)腸道特異受體主動轉(zhuǎn)運，或者被降解為特定片段，進入血液，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。在四君子湯對機體的免疫調(diào)節(jié)過程中，腸道黏膜免疫系統(tǒng)可能發(fā)揮了重要的作用，通過腸道免疫細胞，提供信息傳遞，通過神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，調(diào)節(jié)全身的免疫系統(tǒng)。四君子湯對腸上皮細胞具有促進增殖的作用[7]。

IgA由腸道相關(guān)淋巴組織以及固有層B細胞產(chǎn)生，以sIgA通過腸上皮細胞轉(zhuǎn)運，在腸腔發(fā)揮抗感染等功能。sIgA識別腸道細菌，組織細菌穿過腸上皮而發(fā)生腸道細菌易位[8-9]。sIgA的產(chǎn)生具有T細胞依賴性與非T細胞依賴性兩種。在這兩種機制中GALT均發(fā)揮了重要作用。T細胞依賴途徑主要在PPs生發(fā)中心，而非T細胞依賴途徑主要在成熟孤立淋巴濾泡[10]。sIgA的產(chǎn)生需要共生菌存在。本次研究結(jié)果顯示，脾虛造模小鼠sIgA水平顯著下降，說明脾虛小鼠腸道粘膜免疫功能下降。而四君子湯總多糖能夠提高脾虛造模小鼠sIgA水平，提示四君子湯多糖具有免疫調(diào)節(jié)的作用，并且其對白細胞計數(shù)具有顯著的恢復(fù)作用，改善白細胞中中性細胞、淋巴細胞以及多核細胞的構(gòu)成比。派氏結(jié)是小腸壁的淋巴組織，濾泡區(qū)主要由B淋巴細胞組成，濾泡旁區(qū)主要為T淋巴細胞組成[11]。派氏結(jié)是腸道粘膜免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)部分，在腸道粘膜免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用[12]。其數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)改變均影響免疫應(yīng)答過程。在本次研究中，脾虛造模小鼠派氏結(jié)數(shù)量下降，并且體積減小。給予四君子總多糖的給藥組，數(shù)量顯著增加。腸系膜淋巴結(jié)以T淋巴細胞為主，是腸道粘膜免疫應(yīng)答的重要效應(yīng)部分。在本次研究中，脾虛造模小組腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細胞水平下賤個，B淋巴細胞比例升高，說明脾虛造模小鼠存在腸道粘膜免疫功能紊亂。經(jīng)四君子糖多糖灌胃，T細胞水平升高，B細胞水平下降。

綜上所述，四君子湯多糖能夠糾正腸道菌群失調(diào)，恢復(fù)脾虛小鼠的免疫功能，并且有劑量依賴性。

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(收稿2016-09-20；修回2016-10-17)

Effect of total polysaccharides of Sijunzi decoction on intestinal flora and immune function in mice

Department of the Third Bone Surgery, First Affiliated Hospital of Jiamusi University(Jiamusi 154002)

Tang Huayu Li Yuzhi Li Changde et al

Objective:To discuss the effect of total polysaccharides of Sijunzi decoction on intestinal flora and immune function in mice. Methods:100 healthy mice were divided into 4 groups, each of 25 cases. Mice of high dose group, low dose group and model control group were spleen deficiency modelled. Normal control group and model control group were filled with normal saline every day, and low dose group was filled with Sijunzi decoction 1g/kg, and the high dose group was filled with Sijunzi decoction 2g/kg. The effect of total polysaccharides of Sijunzi decoction on intestinal flora and immune function in mice was analyzed. Results:Thymus index and the Peyer's patch of the low dose group and high dose group were higher than the model control group, and the difference was statistically significant. Intestinal sIgA content were higher than the model control group, and the difference was statistically significant. T lymphocyte ratio of the low dose group was higher than the model control group. Bacillus, bacillus, lactobacillus, escherichia coli, bacillus sp levels of the model control group were higher than the normal control group, and those of the high dose group were lower than the model control group. Conclusion: Sijunzi decoction can correct the intestinal flora imbalance, restore the immune function of spleen deficiency mice, and there is a dose dependent.

Castrointestinal tract Autoimmunity @ Sijunzi decoction

*黑龍江省衛(wèi)生計生委科研課題(2014-237)

胃腸道 自身免疫 四君子湯

R

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.12.054